CN114317342B - 一种坦氏不动杆菌pp-1及其培养方法和应用 - Google Patents

一种坦氏不动杆菌pp-1及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种坦氏不动杆菌PP‑1及其培养方法和应用，所述坦氏不动杆菌PP‑1为坦氏不动杆菌（Acinetobacter tandoii）PP‑1，于2021年08月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20211065；所述坦氏不动杆菌（Acinetobacter tandoii）PP‑1于LB液体培养基中，在30℃、180 r/min条件下，连续培养24h；所述坦氏不动杆菌（Acinetobacter tandoii）PP‑1可应用于养殖水体调节和制备养殖水体中总磷和硝酸盐的微生态降解制剂。本发明可以同时降解养殖水体中的总磷和硝酸盐，在短时间内即可达到较为理想的效果，且对人和养殖生物无毒害作用，具有降解效果好、效率高、不产生二次污染等优点。

Description

一种坦氏不动杆菌PP-1及其培养方法和应用
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种同时具备总磷和硝酸盐快速降解功能的坦氏不动杆菌PP-1及其培养方法和应用。
【背景技术】
水环境是水生经济动物赖以生存的生态环境，随着养殖规模的不断扩大，养殖水环境逐步恶化，部分水质理化因子不仅会导致水生经济动物频繁处于应激状态，病原微生物的侵入也与其有着较为密切的关系，并已成为水产养殖业健康发展的重要制约因素之一。因此，脱氮降磷技术对于解决养殖水环境的恶化问题至关重要。传统的生物脱氮降磷技术，主要利用具有硝化作用、反硝化作用、降磷作用的微生物，在缺氧环境和好氧环境下分别实现脱氮降磷，这需要考虑到环境因素和微生物群落的竞争互生关系对微生物生长造成的影响，受环境的制约性较大。反硝化聚磷菌是一种可以实现“一碳多用”的复合型脱氮降磷功能菌群，在污废水的脱氮降磷过程中可提高碳源利用效率。近年来，基于反硝化聚磷菌的新型脱氮降磷技术，在低碳污水处理中表现出良好的应用前景。目前针对反硝化聚磷菌的研究主要以生活、工业污水处理方面为主，通过结合特定的反应器，实现反硝化聚磷菌的富集增加，达到脱氮降磷的效果，但关于水产养殖用反硝化聚磷菌的研发应用较少。为减少水产养殖尾水排放对周边水域环境的富营养化污染，水产养殖水体和养殖尾水的环保脱氮降磷技术，已成为当前的研发热点和水产养殖行业的迫切需求。因此，急需开发一种对水生经济动物无害的水产养殖用反硝化聚磷菌。
本申请的坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1与现有公开技术(专利号为CN201210158648.2和CN 201610007503.0)所公开的不动杆菌属 (Acinetobacter)菌株的主要区别与优势在于：
(1)本申请的坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1的接种量均明显低于现有菌株的接种量，可节约菌种扩培使用成本。
(2)本申请的坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1在好氧环境下具有较强的快速降解养殖水体中总磷和硝酸盐的能力。在降解养殖废水过程中，当C/N比与它们接近或更低时，对总磷和硝酸盐浓度的降解率明显高于现有菌株，且所用时间更短。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种坦氏不动杆菌PP-1及其培养方法和应用，该菌株可以同时降解养殖水体中的总磷和硝酸盐，在短时间内即可达到较为理想的效果，且对人和养殖生物无毒害作用，具有降解效果好、效率高、不产生二次污染等优点。
本发明是这样实现的：
本发明的第一个目的是提供一种坦氏不动杆菌PP-1，所述坦氏不动杆菌PP-1为坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1，于2021年08月23 日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为 CCTCC NO:M 20211065。
本发明的第二个目的是提供一种坦氏不动杆菌PP-1的培养方法，述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1于LB液体培养基中，在30℃、180 r/min条件下，连续培养24h。
本发明的第三个目的是提供一种坦氏不动杆菌PP-1的应用，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1在养殖水体调节中的应用。
进一步地，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1可以在好氧环境下快速降解养殖水体中总磷和硝酸盐浓度。
进一步地，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1在降解养殖水体中总磷和硝酸盐时，坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1的接种量为0.5％。
本发明的第四个目的是提供一种坦氏不动杆菌PP-1的应用之二，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1可用于制备养殖水体中总磷和硝酸盐的微生态降解制剂。
本发明具有如下优点：
本发明提供的一种具有氮磷降解功能的坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1，该菌株属于好氧异养菌，可以在短时间内降解养殖水体中的总磷、硝酸盐，且对人和养殖生物无毒害作用；该菌种沉降于养殖水体底部后，回收可利用于施肥等农业生产环节，规模化生产可应用于快速改善养殖水体环境和养殖尾水治理。总之，本发明具有应用条件广、降解效果好、效率高、不产生二次污染等优点。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明实施例2中基于坦氏不动杆菌PP-1的16S rDNA的系统发育进化树。
【具体实施方式】
本发明涉及一种坦氏不动杆菌PP-1，所述坦氏不动杆菌PP-1为坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1，于2021年08月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20211065。
本发明还涉及一种坦氏不动杆菌PP-1的培养方法，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1于LB液体培养基中，在30℃、180r/min条件下，连续培养24h。
本发明也涉及一种坦氏不动杆菌PP-1的应用，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoi)PP-1在养殖水体调节中的应用。
较优的，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1可以在好氧环境下快速降解养殖水体中总磷和硝酸盐浓度。
较优的，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1在降解养殖水体中总磷和硝酸盐时，坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoi)PP-1的接种量为0.5％。
本发明又涉及一种坦氏不动杆菌PP-1的应用之二，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoi)PP-1可用于制备养殖水体中总磷和硝酸盐的微生态降解制剂。
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1、Acinetobacter tandoi PP-1的分离筛选
取样：从福建南平市某鳗鲡养殖场的尾水处理池中采集底泥，于-4℃保存备用。样本经沉降浓缩后倒掉上清液，将剩余混合液放于磁力搅拌器上搅拌，将搅拌好的泥水混合液静置2-3h备用。
富集：吸取10mL样本预处理液，放入100mL EM培养基(已灭菌) 中，并使用棉花封住瓶口，在30℃，150r/min条件下，于恒温摇床内富集培养1-2d。
EM培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，H2O 1L，pH 7.0-7.4， 121℃灭菌30min。
分离纯化：待富集培养结束后，吸取150μL富集培养液，放入1.5mL 无菌水中，混匀，依次类推，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同稀释倍数梯度的菌悬液。分别吸取200μL后三个稀释倍数(10-5、10-6、 10-7)梯度的菌悬液，并用无菌三角玻璃刮刀均匀涂布于YG培养基上，每种稀释倍数(10-5、10-6、10-7)的菌悬液重复涂布3次。把稀释涂布后的YG培养基倒置放入30℃的生化培养箱中，培养3d后，从各个稀释倍数的 YG培养基上挑选出菌落形态、大小等表征方面存在明显不同的菌落，并于新的YG培养基上开始划线分离。划线时注意不要划破培养基表面，直到获得由单个微生物细胞发育而来的纯培养物。
YG培养基：酵母提取物1g，无水葡萄糖1g，K2HPO4·3H2O 0.3931g， KH2PO4 0.25g，琼脂20g，MgSO4·7H2O 0.4094g，H2O 1L，pH 7.0-7.2，121℃灭菌30min。
筛选和保藏：取分离纯化得到的纯培养物，分别点接于过磷/限磷SM 培养基上，30℃于生化培养箱内倒置培养3d，观察待测菌株在过磷/限磷SM 培养基上的显色情况。在过磷/限磷SM培养基上均能呈现蓝色菌斑的菌株即为初筛菌株。将得到的初筛菌株进行液体扩培，以2％的接种量接种于DM 培养基中，使用棉花封住瓶口(保持好氧环境)，30℃、180r/min于恒温振荡器内培养2-3d，对其进行定向驯化。测定经过定向驯化的菌悬液的OD600值，选取OD600值较大的菌株进行二次筛选。取适量待测菌株驯化后的菌悬液于离心管中，30℃、10000rpm于高速离心机内离心10min，根据紫外分光光度法和钼酸铵分光光度法检测离心后的上清液中总磷和硝酸盐氮的残余量，最后选取效率高的菌株作为目标菌株。
MOPS-Glu过磷/限磷SM培养基组合：
①MOPS-Glu混合液(100mL)：MOPS 8.372g、Tricine 0.717g溶解于蒸馏水(<38mL)中，10mol·L-1KOH调节溶液整体pH至7.4，加蒸馏水使溶液总体积至44mL，新鲜制取的0.0183mol·L-1FeSO4·7H2O溶液1mL，再按顺序依次加入1.9mol·L-1NH4Cl溶液5mL、0.276mol·L-1K2SO4溶液1 mL、5×10-4mol·L-1CaCl2溶液1mL、1.127mol·L-1MgCl2·6H2O溶液1mL、 5mol·L-1NaCl溶液10mL，微量元素溶液1mL，蒸馏水36mL，无水葡萄糖0.1g。
②过磷/限磷SM培养基(过磷/限磷各500mL)：取Glu-MOPS混合液 50mL于500mL锥形瓶中。当配制过磷SM培养基时，依次加入K2HPO4·3H2O 0.2282g、1％VB1溶液5mL、X-Pi0.025g、440mL蒸馏水、10g琼脂，pH 7.2；当配制限磷SM培养基时，依次加入1％VB1溶液5mL、X-Pi 0.025g、蒸馏水440mL、琼脂10g，pH 7.2。121℃高压灭菌30min后，取出放冷至60℃，摇晃均匀后倒入平板中。
DM培养基：CH3COONa 5g，KH2PO4 0.0659g，KNO3 0.722g， MgSO4·7H2O 0.2g，H2O1L，微量元素溶液2mL。
实施例2、坦氏不动杆菌PP-1的鉴定
纯化后的细菌采用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction KitVer.3.0提取菌株的基因组DNA。以16S rDNA序列的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(如SEQ ID No:1所示)和1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')(如SEQ ID No:2所示)为PCR反应引物，使用2×TsingKE Master Mix体系进行PCR扩增；PCR反应体系为：基因组DNA 1μL，2×TsingKE Master Mix 25μL，27F Primer(10μM)1μL，1492R Primer(10μM)1μL，dH2O 22μL。PCR反应条件为：预变性94℃ 10min，30个循环(94℃30s、55℃30s、72℃1.5min)，延伸72℃10min。
将获得的PCR产物经纯化后，送样至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，得菌株PP-1的16S rDNA序列(结果如SEQ ID No:3所示)。
将菌株PP-1的16S rDNA序列进行BLAST同源序列比对 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，结果显示菌株PP-1与Acinetobacter tandoistrain 2pw_2(GenBank登录号:LC191526.1)相似性高达100％。采用MEGA7构建系统发育进化树(Neighbor-Joining法)如图1所示，结果显示菌株PP-1与NCBI数据库现有的4株Acinetobacter tandoi16s rDNA 序列处于进化树的同一分支且距离最近。将菌株PP-1的16S rDNA序列上传到EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)，结果显示菌株PP-1 与16S rRNA序列数据库中的Acinetobacter tandoistrain DSM 14970(Accession:KE007359)相似性高达99.93％。结合上述鉴定分析结果，判断菌株PP-1为坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoi)，并将其命名为坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoi)PP-1。
实施例3、坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoi)PP-1对养殖水质中的总磷和硝酸盐降解效果测定及其异养性检测
挑取单一纯菌株坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1接种于已灭菌的LB液体培养基中，30℃、180r/min于恒温振荡器内扩增培养24h。处理组分补充碳源组和无补充碳源组进行实验，扩增培养的坦氏不动杆菌 (Acinetobacter tandoi)PP-1菌液均以0.5％的接种量一次性接种于1L的鳗鲡养殖水质中(补充碳源组通过添加乙酸钠调节C/N比至7.9)；对照组不添加菌液和碳源；每个处理(对照)做3个相同重复。试验期间，除测定本底总磷和硝酸盐浓度外，于12h、24h和48h采集养殖水质，30℃、10000rpm 于高速离心机内离心10min，取上清液测定总磷和硝酸盐的降解率，测定结果见表1、表2。
表1.坦氏不动杆菌PP-1对养殖水质中的总磷降解效果测定
表2.坦氏不动杆菌PP-1对养殖水质中的硝酸盐氮降解效果测定
根据测定结果可知，在C/N比为7.9的条件下，坦氏不动杆菌 (Acinetobactertandoii)PP-1在12h、24h内对养殖水质中的总磷降解率即可分别达到56.31％和81.82％；在12h、24h内对养殖水质中的硝酸盐氮降解率即可分别达到65.5％和90.37％。另一方面，添加补充碳源(C/N比为7.9)的处理组经24h对养殖水质中的总磷浓度从5.008mg/L降至0.911 mg/L，补充碳源组的总磷浓度降解率81.82％显著高于无补充碳源组(C/N 比为0.55)的降解率37.00％和对照组(C/N比为0.55)的降解率6.23％；添加补充碳源(C/N比为7.9)的处理组经24h对养殖水质中的硝酸盐氮浓度从14.362mg/L降至1.383mg/L，补充碳源组的硝酸盐氮浓度降解率 90.37％显著高于无补充碳源组(C/N比为0.55)的降解率33.08％和对照组 (C/N比为0.55)的降解率11.46％。
结果表明，在C/N比为7.9条件下，坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii) PP-1具备短时间内快速降解养殖水体中总磷和硝酸盐氮的能力，可实现高效快速调节养殖水体的氮磷浓度。另一方面，由于补充碳源组的C/N比7.9 高于无补充碳源组(C/N比为0.55)，补充碳源的添加对坦氏不动杆菌 (Acinetobacter tandoii)PP-1降解总磷和硝酸盐氮起促进作用，这也证明坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1属于异养型细菌。
实施例4、坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1在水产养殖应用中的安全性检测
以8×104cfu/mL的接种量至含0.8m3水体的养殖美洲鳗鲡的塑料桶中，不加补充碳源，对照组不加细菌PP-1，设双平行对照试验；处理组和对照组每桶的养殖美洲鳗鲡重量40kg，平均规格250g/尾，试验期间，于0h、72h 和144h分别采集各桶养殖水样，测定总磷、硝酸盐氮的浓度，计算去除率。处理组和对照组均正常按1.1％投料率投喂饲料和管理，美洲鳗鲡健康生长，无病和死亡。
结果(见表3)表明，72h添加菌液的处理组鳗鲡养殖水体中的总磷浓度从4.97mg/L降至3.08mg/L(去除率38％)，硝酸盐氮浓度从6.27mg/L 降至4.05mg/L(去除率35.4％)；144h添加菌液的处理组鳗鲡养殖水体中的总磷浓度从4.97mg/L降至2.05mg/L(去除率58.8％)，硝酸盐氮浓度从 6.27mg/L降至2.75mg/L(去除率56.1％)。表明，Acinetobactertandoi PP-1 在养殖水体中能良好降低总磷和硝酸盐氮浓度，稳定水质且具有良好的养殖安全性。
表3.鳗鲡养殖水质因子浓度动态对比
综上，本发明提供的一种具有氮磷降解功能的坦氏不动杆菌 (Acinetobactertandoii)PP-1，该菌株属于好氧异养菌，可以在短时间内降解养殖水体中的总磷、硝酸盐，且对人和养殖生物无毒害作用；该菌种沉降于养殖水体底部后，回收可利用于施肥等农业生产环节，规模化生产可应用于快速改善养殖水体环境和养殖尾水治理。总之，本发明具有应用条件广、降解效果好、效率高、不产生二次污染等优点。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110> 集美大学
<120> 一种坦氏不动杆菌PP-1及其培养方法和应用
<130> 100
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1350
<212> DNA
<213> （Acinetobacter tandoii）
<400> 3
cttgcacctt agcttagcgg cggacgggtg agtaatgctt aggaatctgc ctattagtgg 60
gggacaacat tccgaaaggg atgctaatac cgcatacgcc ctacggggga aagcagggga 120
tcttcggacc ttgcgctaat agatgagcct aagtcggatt agctagttgg tggggtaaag 180
gcctaccaag gcgacgatct gtagcgggtc tgagaggatg atccgccaca ctgggactga 240
gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcggaagc 300
ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttttgg ttgtaaagca ctttaagcga 360
ggaggaggct cttaaggtta atacccttga tgagtggacg ttactcgcag aataagcacc 420
ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg cgagcgttaa tcggatttac 480
tgggcgtaaa gcgtgcgtag gcggctgatt aagtcggatg tgaaatccct gagcttaact 540
taggaattgc attcgatact ggtcagctag agtatgggag aggatggtag aattccaggt 600
gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg aataccgatg gcgaaggcag ccatctggcc 660
taatactgac gctgaggtac gaaagcatgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 720
ccatgccgta aacgatgtct actagccgtt ggggcctttg aggctttagt ggcgcagcta 780
acgcgataag tagaccgcct ggggagtacg gtcgcaagac taaaactcaa atgaattgac 840
gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac 900
ctggtcttga catagtaaga actttccaga gatggattgg tgccttcggg aacttacata 960
caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1020
agcgcaaccc ttttccttat ttgccagcac ttcgggtggg aactttaagg atactgccag 1080
tgacaaactg gaggaaggcg gggacgacgt caagtcatca tggcccttac gaccagggct 1140
acacacgtgc tacaatggtc ggtacaaagg gttgctacct agcgatagga tgctaatctc 1200
aaaaagccga tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc 1260
tagtaatcgc ggatcagaat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1320
gtcacaccat gggagtttgt tgcaccagaa 1350

Claims (6)

1.一种坦氏不动杆菌PP-1，其特征在于：所述坦氏不动杆菌PP-1为坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1，于2021年08月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M 20211065。
2.一种坦氏不动杆菌PP-1的培养方法，其特征在于：所述坦氏不动杆菌PP-1为权利要求1所述的一种坦氏不动杆菌PP-1，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1于LB液体培养基中，在30℃、180r/min条件下，连续培养24h。
3.一种坦氏不动杆菌PP-1的应用，其特征在于：所述坦氏不动杆菌PP-1为权利要求1所述的一种坦氏不动杆菌PP-1，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1在养殖水体调节中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种坦氏不动杆菌PP-1的应用，其特征在于：所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1在好氧环境下快速降解养殖水体中总磷和硝酸盐浓度。
5.根据权利要求4所述的一种坦氏不动杆菌PP-1的应用，其特征在于：所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1在降解养殖水体中总磷和硝酸盐时，坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1的接种量为0.5％。
6.一种坦氏不动杆菌PP-1的应用，其特征在于：所述坦氏不动杆菌PP-1为权利要求1所述的一种坦氏不动杆菌PP-1，所述坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)PP-1用于制备养殖水体中总磷和硝酸盐的微生态降解制剂。
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