CN113005062B

CN113005062B - 一株兼性营养型氨氧化细菌及其应用

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Publication number: CN113005062B
Application number: CN202110313349.0A
Authority: CN
Inventors: 李东; 曹沁; 陈意超; 赖生平; 聂明建; 杨洪伟; 廖杰; 高雪莉
Original assignee: Chongqing Derun Environment Co ltd; Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chongqing Derun Environment Co ltd; Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2041-03-24
Also published as: CN113005062A

Abstract

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株兼性营养型氨氧化细菌及其应用。具体技术方案为：一株红球菌，于2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种名称：红球菌(Rhodococcus sp.)CNOx，保藏号为CGMCC No.21393。本发明提供了一株全新的硝化细菌CNOx，是一个新的种。与以往研究不同的是，本发明所述硝化细菌CNOx是一类革兰氏阳性、兼性营养型硝化细菌，该菌株具有自养和异养硝化微生物的典型特点，既能通过异养生长实现快速扩培，又能进行自养硝化避免碳源投入增加处理成本，而且几乎不受高浓度的氨氮和有机物抑制具有极强的环境耐受能力，是人工培育、制备硝化菌剂的理想生物材料。

Description

一株兼性营养型氨氧化细菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株兼性营养型氨氧化细菌及其应用。

背景技术

化工、皮革、焦化、制药、种养殖业以及生活垃圾均会产生大量高氨氮废水，这些废水排入水体后会引起水体富营养化，严重影响水生生物的生长与繁殖。目前主要通过物理、化学和生物等方法进行污水中的脱氮处理，但物理法(膜处理)成本较高，化学法容易造成水体二次污染，而生物法具有绿色环保、无残留、安全可靠等特点，因此成为首选。

生物脱氮技术是目前应用最广泛且经济效益较高的脱氮方法。传统的生物脱氮主要包括硝化和反硝化两个过程，其中，硝化过程分为两个阶段：第一阶段为亚硝化，即NH₄ ⁺氧化为NO₂ ^-的阶段；第二阶段为硝化，即NO₂ ^-氧化为NO₃ ^-的阶段，两个阶段共同组成了分段式硝化，分别由亚硝酸细菌和硝酸细菌参与完成。与分段式氨氧化不同的是，单步硝化中，NH₄ ⁺可以在完全氨氧化微生物的作用下直接形成以NO₃ ^-为唯一产物的过程。但以上两个类型的硝化微生物在一般污水处理系统中的丰度均不高，硝化效果不理想。这是因为：同化类型均是自养型的它们能够从NH₄ ⁺及其衍生物的氧化过程中获取的能量有限，且利用率较低，故其生长缓慢，平均代时在10h以上。不仅如此，较高浓度的氨氮和有机物(C/N＞0.25)均会对其造成不同程度的抑制。这些不利因素常会导致硝化系统构建困难，给污水厂投运初期造成巨大压力。

异养型硝化菌是以无机态氨氮或有机氮为底物并利用有机物进行硝化作用的一类微生物，在自然界分布较为广泛，包括真菌、放线菌和细菌(如恶臭假单胞菌、脱氮副球菌等)，甚至一些藻类也能在异养硝化过程中产生氧化亚氮。与传统的自养型硝化细菌相比，虽然单位生物量的异养菌氧化氨氮的速率较自养菌要慢2～3个数量级，但异养菌的生长速度快，对环境的适应性也强，其总体氨氧化速率并不比自养菌慢。研究表明，在适当条件下，异养型硝化细菌4h的氨氮去除率可达60％以上，同时还可有效降低水体中的COD。此外，异养型硝化细菌对水环境的适应性更强，需要的溶解氧浓度较低，能耐受酸性环境且活性高。

目前兼性营养型的硝化细菌鲜有报道，资料显示仅有维氏硝化杆菌(Nitrobacterwinogradskyi)的一些品系能够在某些有机培养基上生长，但此类微生物均为无芽孢的革兰氏阴性菌。如果能提供一种新的兼性营养型硝化细菌，将丰富生物脱氮微生物的可选范围，具有极大的科研和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一株兼性营养型氨氧化细菌及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株红球菌，于2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种名称：红球菌(Rhodococcus sp.)CNOx，保藏号为CGMCC No.21393。

相应的，一株红球菌，其16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

相应的，一株红球菌，所述红球菌为硝化细菌，革兰氏阳性菌，兼性营养型，菌落呈乳白色，表面凸起有光泽，边缘呈花瓣状近似圆形。

相应的，所述红球菌在污水处理和/或垃圾处理中的应用。

优选的，所述红球菌在生物脱氮中的应用。

优选的，所述应用的温度为15～35℃，pH为7～8.5。

优选的，所述应用依靠短程硝化反硝化脱氮反应器进行。

优选的，所述短程硝化反硝化脱氮反应器包括硝化区域和反硝化区域，所述硝化区域位于反硝化区域上方，内部填充多孔悬浮球，所述反硝化区域从上到下依次包括抗扰流的分隔层、碳源分布层和填料层。

优选的，所述填料层从上到下依次包括层状填料层和块状填料层。

优选的，所述分隔层侧面开口，引入可溶解碳源的硝化液，被硝化液溶解后的碳源进入碳源分布层。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株全新的硝化细菌CNOx，是一个新的种。与以往研究不同的是，本发明所述硝化细菌CNOx是一类革兰氏阳性、兼性营养型硝化细菌，该菌株具有自养和异养硝化微生物的典型特点，既能通过异养生长实现快速扩培，又能进行自养硝化避免碳源投入增加处理成本，而且几乎不受高浓度的氨氮和有机物抑制具有极强的环境耐受能力，是人工培育、制备硝化菌剂的理想生物材料。

传统的异养或自养硝化细菌，均存在自身局限性。传代时间长，生态位占据能力弱，因此处理高氨氮废水时，常常需要先经过厌氧处理以降低废水中的BOD，以减弱异养型微生物的生态竞争，确保硝化过程的顺利进行，但这样的处理方式需要的场地和设备均更多，生产和投入较高。利用本发明提供的兼性营养型硝化细菌CNOx进行废水处理，则可以有效解决上述问题。

附图说明

图1为硝化细菌CNOx在硝化(异养)培养基上的菌落形貌图；

图2为硝化细菌CNOx在异养、自养培养基中分别的生长曲线图；

图3为硝化细菌CNOx的进化树图谱；

图4为连续曝气条件下硝化细菌CNOx对污水COD的降解趋势图；

图5为鲜活的硝化细菌CNOx对污水氮素转化示意图；

图6为灭活的硝化细菌CNOx对污水氮素转化示意图；

图7为短程硝化反硝化脱氮反应器结构示意图；

图8为脱氮反应器硝化区域不同溶氧下氮素变化情况示意图；

图9为脱氮反应器硝化区域不同C/N下氮素变化情况示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种新的硝化细菌CNOx，于2020年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21393。所述硝化细菌为革兰氏阳性菌；菌落呈乳白色，表面平整有光泽，边缘呈瓣状近似圆形，不粘稠、易挑取；菌体呈短杆状，存在内生孢子。

所述硝化细菌为兼性营养型，具有兼性营养型的硝化细菌较少，且多为革兰氏阴性菌，但本发明提供的为革兰氏阳性菌；其在异养条件下生长迅速，在自养环境中硝化能力较强。另外，试验发现：所述硝化细菌的硝化途径与传统的NH₄ ⁺→NO₂→NO₂ ^-的分步硝化不同；这一硝化细菌具有两条独立的硝化途径，分别是：NH₄ ⁺→NO₂ ^-和NH₄ ⁺→NO₃ ^-，其中，前者为主要代谢途径。同时，将CNOx进行分子生物学鉴定，发现其与Rhodococcus zopfii相似度最高，但相似度仅有96.3％，＜97％。综合判断，本发明提供的硝化细菌CNOx为一个新的种。

本发明还提供了所述硝化细菌CNOx在处理高氨氮废水中的应用。可根据本领域的常规技术，将所述硝化细菌接种到待处理的废水中进行处理。一种实施方式为：将所述硝化细菌CNOx的菌液(活菌浓度≥10⁸CFU/mL)按20％～50％的体积比接种到装有待处理废水的好氧池中。另一种实施方式为：将所述硝化细菌CNOx的菌液(活菌浓度≥10⁸CFU/mL)按10％～30％的体积比接种到SBR反应器中；菌种接入后的富集驯化程序如下：前1～2天不进出液，使接入的硝化菌种适应于土著微生物群落，接下来的1～2天低负荷进水(进水含20％的废水和80％的自来水)，此后逐渐提高进水负荷，直至进水满负荷运行。驯化完成后，可根据额定进水负荷进行后续污水处理。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：菌株的筛选与鉴定

1、准备培养基如下：

(1)硝化(自养)培养基：KHCO₃ 1g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，CaCl₂·2H₂O0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，CaCO₃ 2g/L。此外，每升加入2mL微量元素Ⅰ和2mL微量元素Ⅱ。培养基的最终pH值在7.0至7.5之间。增加琼脂糖12g/L，即为固体硝化(自养)培养基。

微量元素溶液Ⅰ：EDTA 20.71g/L和FeSO₄·7H₂O 9.15g/L。

微量元素溶液Ⅱ：ZnSO₄·7H₂O 430mg/L，MnCl₂·4H₂O 990mg/L，H₃BO₃14mg/L，CoCl₂·6H₂O 240mg/L，CuSO₄·5H₂O 250mg/L，NiCl₂·6H₂O190mg/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O550mg/L。

(2)硝化(异养)培养基：(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，葡萄糖9.09g/L、乙酸钠6.20g/L、丁二酸钠6.13g/L、柠檬酸钠7.42g/L、蔗糖4.32g/L，维氏盐溶液50mL/L，微量元素溶液Ⅲ1mL/L，去离子水1000mL，pH＝7.5。

维氏盐溶液：K₂HPO₄ 5.0g/L，MgSO₄·7H₂O 2.5g/L，NaCl 2.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.05g/L，MnSO₄ 0.05g/L，去离子水1000mL。

微量元素溶液Ⅲ：ZnSO₄·7H₂O 450mg/L，H₃BO₃ 100mg/L，CoCl₂·6H₂O250mg/L，KI100mg/L，CuSO₄·5H₂O 200mg/L，NiCl₂·6H₂O 200mg/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 600mg/L。

(3)硝酸细菌培养基：NaNO₂ 1.0g/L，K₂HPO₄ 0.75g/L，NaH₂PO₄0.25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.03g/L，Na₂CO₃ 2.5g/L，MnSO₄·4H₂O 0.01g/L。此外，每升加入1mL微量元素溶液Ⅰ和1mL微量元素溶液Ⅱ。培养基的最终pH值在7.0至7.5之间。

2、菌株的分离：

利用500mL采样瓶收集奶牛养殖基地硝化池的样品，装箱并实施低温处置，带回实验室，摇晃均匀后静置30min。于超净工作台用无菌注射器吸取50mL上清液，转移至已进行灭菌处理且盛有1950mL硝化(自养)培养基的2L富集反应器中，通过膜曝气装置保持溶氧≥2mg/L，并维持反应器内温度在30℃左右，持续60天，获得富集液。

取适量富集液通过显微镜直接计数法确定大概的菌体数量后，于超净工作台内利用无菌水将其稀释到菌体浓度为100CFU/mL左右，获得稀释富集液。吸取0.5mL稀释富集液于固体硝化(自养)培养基中，进行涂布分离培养。

把涂布好的培养皿于30℃恒温倒置培养3～8d，挑取不同类型的单菌落，经平板划线纯化3次以上后，4℃保存于固体硝化(自养)培养基中。

将保存好的各菌株进行活化后，分别接入装有30mL灭菌硝化(自养)培养基的三角烧瓶中，于30℃摇床培养7d，制得种子液。

将各菌株的种子液按照5％(v/v)的接种比例，分别接种到已灭菌的45mL硝化(自养)硝化和硝化(异养)培养基中，于30℃，200r/min摇床培养7天，获得培养液。取2mL培养液，于4℃，10000r/min离心10min。取上清液并稀释至适当浓度，用于测定NH₄ ⁺含量(水杨酸分光光度法，上清液稀释至0.01～1.0mg/L)、NO₂ ^-含量(酸萘乙二胺分光光度法，上清液稀释至0.003～0.2mg/L)、NO₃ ^-含量(离子色谱法上清液稀释至，0.08～1000mg/L)含量，OD₆₀₀(利用上清液作对照，测定发酵液在600nm处测定的净吸光度值，浓度过大可适当稀释)。同一菌株重复3次。

结果表明，初筛获得9株具有氨氧化或硝化作用的微生物，其分别对氮素的转化能力如表1。

表1不同硝化细菌的定量硝化能力测试

根据表1可以看出：菌株CNOx在自养硝化培养基上的氨氮去除效果最好，形成的产物包含了亚硝酸根和硝酸根两种。此外，CNOx在异养硝化培养基能够正常生长并形成了大量的菌体，其余各菌株在异养培养基上菌体增殖较少，且硝化作用并不明显。

同时，根据表1还可看出，硝化细菌CNOx在硝化过程中形成了两种产物：NO₂ ^-和NO₃ ^-。为进一步探索产物NO₃ ^-的产生途径是NH₄ ⁺→NO₂ ^-→NO₃ ^-的传统两步硝化途径，还是由NH₄ ⁺→NO₃ ^-的单步硝化过程，进行如下试验：将硝化细菌CNOx的菌体用0.85％的生理盐水于超净工作台内反复清洗(去除由接种物中引入的NO₃ ^-)，随后接种至硝酸细菌培养基，30℃、280rpm/min连续培养7天，获得培养液。取培养液于4℃、10000rpm/min离心5min，测定上清液中是否含有NO₃ ^-。试验结果表明：菌株CNOx在硝酸细菌培养基出现滞长情况，且培养液中未检测出NO₃ ^-，这表明在硝化培养基中产生的NO₃ ^-并不是通过NH₄ ⁺→NO₂ ^-→NO₃ ^-这样的途径产生的，而是直接由NH₄ ⁺转化形成的NO₃ ^-。因此，可认为由硝化细菌CNOx主导完成的硝化途径包括NH₄ ⁺→NO₂ ^-和NH₄ ⁺→NO₃ ^-两种。

3、菌株的鉴定：

(1)基本性状、生理生化特征鉴定。如图1所示，所述硝化细菌CNOx在硝化(异养)固体培养基中，菌落呈乳白色，表面凸起有光泽，边缘呈花瓣状近似圆形，不粘稠易挑取。24h后，35℃下菌落直径约为1～2mm。

生长条件为：15～40℃，pH 5.5～10.0，2～9％(w/w)NaCl。最佳生长温度为30℃，pH＝7.5～8.0，在硝化(异养)培养基和硝化(自养)培养基中，生长曲线如图2所示。

(2)16S rDNA测序。将硝化细菌CNOx接种至硝化(异养)液体培养基中，55℃、180r/min培养48h，获得发酵液；取1mL发酵液进行DNA提取和16S rDNA的扩增和测序。

利用通用引物27F和1492R进行扩增16S rDNA，引物序列为：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。PCR扩增条件为94℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、90s，30个循环；72℃、10min。

对PCR扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示。将测序结果在NCBI中进行比对，比对结果发现与该菌株最为相似的菌株是Rhodococcus zopfii(登录号为NR041775.1)，但相似度仅有96.3％，制作成系统进化树如图3所示。将其命名为硝化细菌CNOx，并于2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种名称：红球菌(Rhodococcussp.)CNOx，保藏号为CGMCC No.21393。

(3)生理生化鉴定。对硝化细菌CNOx进行革兰氏染色，并实施葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测，结果显示革兰氏染色呈阳性，葡萄糖氧化酶呈阳性，过氧化氢酶呈阳性。L-赖氨酸是该菌株细胞壁唯一的氨基酸类型，全细胞单糖包括阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖。

此外，专利所述菌株能够分别以1.0％麦芽糖、0.1％苯甲酸钠、1.0％乙醇、1.0％甘油、1.0％癸二酸、1.0％丙酮酸钠、1.0％琥珀酸钠、0.02％苯酚、甲苯蒸气和联苯蒸气为唯一碳源进行生长，而以1.0％肌醇、1.0％甘露醇作为唯一碳源时出现滞涨情况。

(4)生长条件的优化。

从硝化菌CNOx斜面刮取一环菌体接种于液体硝化(自养)培养基中，于30℃、280r/min培养7d制得种子液，利用显微镜直接计数法测得此时菌体数量约为10⁸CFU/mL。再将种子液分别按照体积比10％的接种比例接种到50mL的液体硝化(自养)培养基中，采用单因素试验分别考察不同温度、不同pH、不同氨氮浓度以及不同碳源等对CNOx硝化作用的影响。除考察因素外，培养条件均为：280r/min摇床培养7天。结果分别如表2、3、4、5所示。

表2硝化细菌CNOx在不同培养温度条件下的硝化效果

培养温度℃	OD<sub>600</sub>	氨氮含量mg/L	亚硝氮含量mg/L	硝氮含量mg/L
					15	0.031	316.49	36.86	13.57
20	0.107	188.97	100.90	23.29
					25	0.160	94.42	145.50	32.20
30	0.209	51.24	174.78	40.73
					35	0.185	76.79	152.32	34.25
40	0.020	353.99	29.20	9.39
					45	0.006	419.51	1.76	0.73

表3硝化细菌CNOx在不同pH条件下的硝化效果(使用HCl和NaOH调节pH)

培养基pH	OD<sub>600</sub>	氨氮含量mg/L	亚硝氮含量mg/L	硝氮含量mg/L
					6.0	0.042	338.10	25.68	8.59
6.5	0.119	183.67	27.38	17.04
					7.0	0.169	82.43	67.42	22.79
7.5	0.194	31.91	170.56	40.98
					8.0	0.193	34.45	173.46	40.60
8.5	0.132	156.68	86.82	22.95
					9.0	0.101	219.52	47.02	5.95
9.5	0.031	359.80	13.62	4.15
					10.0	0.000	420.39	1.27	0.38

表4硝化细菌CNOx在不同初始氨氮浓度下的硝化效果

初始氨氮浓度mg/L	OD<sub>600</sub>	氨氮含量mg/L	亚硝氮含量mg/L	硝氮含量mg/L
					500	0.215	11.95	202.58	49.92
1000	0.217	47.81	388.56	96.71
					1500	0.219	116.06	582.41	138.66
2000	0.232	194.50	711.84	172.08
					2500	0.254	572.88	862.85	198.50
3000	0.279	936.29	827.30	213.12
					3500	0.306	1183.73	1039.66	247.17
4000	0.300	2107.01	1011.39	175.48

表5中，各组以(NH₄)₂SO₄为氮源，且氨氮浓度为423.79mg/L。

表5硝化细菌CNOx在不同碳源条件下的硝化效果

通过上述培养条件优化试验可知：硝化细菌CNOx的生长温度为15～35℃，最适培养温度在30℃左右；当pH＜7.0或pH＞8.5时，菌株CNOx的硝化速率显著降低。在初始氨氮浓度500～4000ppm的范围内，硝化细菌CNOx的发酵液中亚硝酸含量与初始氨氮浓度基本呈现出正相关的现象，但总的硝化效率呈现下降趋势。不同的碳源对硝化细菌CNOx的硝化效果有显著影响。其中，在仅添加无机碳源(碳酸氢钠)时，NO₂ ^-和NO₃ ^-含量最高，硝化效果最佳；添加有机碳源培养条件下，硝化细菌CNOx的菌体数量明显增多，且发酵液较为浓稠，但NO₂ ^-和NO₃ ^-含量均较低，表明在不同碳源条件下，硝化细菌CNOx的代谢途径存在显著差异。

实施例二：硝化细菌CNOx对高浓度废水COD和氨氮的协同处理

将6L硝化细菌CNOx的发酵液(活菌浓度≥10⁹CFU/mL)进行低温离心收集菌体，随后于超净工作台内平均分为质量相等的两份，其中一份于115℃灭菌30min作对照处理，另一份于4℃低温暂存。待灭菌结束后,将两份菌体分别接种于盛有6L高浓度有机废水(COD为15200mg/L，氨氮含量为1640mg/L)的8L有机玻璃罐内，搅拌均匀后进行曝气(3L/min)处理，每天利用碳酸钠补充碱度，维持溶液pH在7.5～8.0之间，并按照初始液位进行补水，同时取样测定废水的COD、氨氮、亚硝氮、硝氮、总氮(过硫酸钾氧化-紫外分光光度法)和有机氮(凯氏法减去氨氮)。

试验结果表明，在单一的反应器内仅通过接种硝化细菌CNOx连续曝气4d，就能使污染水源从15200mg/L的COD下降至4000mg/L以下，且去除97％以上的氨氮(结果如图4～图6)。相同耗时条件下，较对照处理COD降解速率提高18.07％，氨氮去除速率增加37.85％。

其中图5、6详细的记录了连续曝气期间反应器中氮素的变化过程。不难发现，在曝气初期(0～4d)对照组和试验组内微生物大量繁殖(对照组中，即接种灭活硝化细菌CNOx的组别中，污水中本身存在活菌)，将大量氨氮和BOD吸收、转化、沉淀到菌体内，导致有机氮含量增加。随后由于BOD消耗殆尽，整个系统进入内源呼吸期，前期产生的大量菌体会导致这个阶段的持续时间大大缩短，最后步入衰亡期。此时试验组和对照组的氮素转化出现显著差异，由于对照组罐体中缺乏具备硝化能力微生物群体，导致衰败的微生物残骸被新的菌群利用，从而导致氮素形态并未向无机态转化现象。

与对照组不同的是，衰亡期试验组水体中的亚硝氮和硝氮含量显著增加。这或许是因为，试验组中大量接种的CNOx是一种兼性营养型细菌，衰败菌体分解产生的残骸和氨氮均可作为CNOx的能量来源，这为CNOx提供了显著的竞争优势。此外，CNOx氧化氨氮代谢产生的亚硝氮也不利于其他微生物的生长和繁殖，进一步让该菌处于这个系统中的主导地位。试验终止于连续曝气的第10天，是因为在废水处理过程中停留时间通常不会超过10天，且此时氨氮含量已经低于20mg/L的排放标准。

实施例三：硝化细菌CNOx在短程硝化反硝化脱氮反应器中的应用

短程硝化反硝化脱氮技术是指将硝化反应控制在NH₄ ⁺→NO₂ ^-阶段，避免发生或少发生NO₂ ^-→NO₃ ^-的转化，直接进行NO₂ ^-→N₂的反应。与传统的硝化反硝化技术相比，短程硝化反硝化具有如下优点：好氧阶段可节省25％的氧消耗量；缺氧阶段可减少40％的碳源消耗。同时，由于NO₂ ^-→N₂的反应速率是NO₃ ^-→N₂的1.5～2倍，因此反硝化停留时间可大大缩短。此外，短程硝化反硝化还能有效降低污泥产量。通过实施例一中菌株的筛选试验发现，硝化细菌CNOx在进行氨氧化的过程中大量累积NO₂ ^-，仅有少部分氨氮完全氧化形成NO₃ ^-。因此，发明人进一步探索了利用硝化细菌CNOx构建短程硝化反硝化脱氮系统的可行性。

利用有机玻璃罐构造了如图7所示的短程硝化反硝化脱氮反应器。反应器包含两个区域：分别是硝化区域和反硝化区域。硝化区域(即图7中的硝化层)位于反应器上部，有效容积为5L，区域内使用棉芯多孔悬浮球(图中未示出悬浮球)进行填充，通过可调节的曝气装置维持硝化区域溶氧量为0.5～2.5mg/L。反硝化区域有效容积为3L，分为4层，从上到下依次为：15cm厚的石英砂分隔层、碳源分布层、层状填料层和块状填料层。其中，石英砂分隔层主要起到抗扰流的作用，在该层侧面开口引出硝化液，用于溶解碳源，碳源为甲醇(将甲醇用硝化液稀释100倍)。溶解好的碳源通过导管引入碳源分布层进行均匀分布。碳源分布层的下方是层状填料层，包括30层聚氨酯海绵孔状填料，用于附着反硝化细菌；最下层的块状填料层中填有圆形火山岩滤料，用于过滤水质。罐体周围利用恒温加热套维持罐体温度在35℃左右。

在反应器启动之初，利用本实验室菌种库中的反硝化细菌(Paracoccusdenitrificans和Pseudomonas xanthomarina)扩培3L富含反硝化菌的发酵液，接种到反硝化区域，将CNOx用硝化(异养)培养基制备2L发酵液与3L灭菌后的硝化(自养)培养基均匀混合，一起添加到硝化区域，开启微量曝气48h进行挂膜。待挂膜结束后，正常运行脱氮反应器，反应器外部设置模拟的废水源(氨氮为3000mg/L的硝化(自养)培养基)、碳源溶解液收集器(2个，轮流使用，在收集好的碳源溶解液中加入甲醇用于为反硝化提供碳源)，控制所有导管流速均为2L/d，维持硝化区域pH在8.0左右，进行脱氮流化反应。另外，硝化区域的NH₃ ⁺会逐渐转化为硝酸，降低硝化区域的pH，除添加NaHCO₃补充碱度外，还可以将反硝化区域块状填料层处理后的液体回流引至硝化区域(因为反硝化区域的NO₃ ^-会逐渐转化为氮气，产生OH^-，从而增加pH)，以进一步平衡系统的pH。回流比优选为1:1(即经块状填料层排出的液体，一半排入环境或另作他用，一半回流到硝化区域)。当回流仍无法保持硝化区域pH时，可通过添加NaHCO₃补充碱度。

反应器正常开启后，每天监测硝化区域和出水水质的氨氮、亚硝氮、硝氮含量，每7天为一个运行周期，不同周期通过调节曝气强度来调整溶氧的浓度，并改变碳源添加量来确保出水恰好不含有亚硝氮。

如图8所示，试验发现，利用硝化细菌CNOx构建的脱氮反应器，在硝化区域内氨氮和亚硝氮含量随溶氧量(0.5mg/L～2.5mg/L)的增加出现明显的负相关，而硝氮含量的变化并不明显，且当溶氧量为2.5mg/L时，NO₂ ^-/NO₃ ^-的比值最大。以上现象表明：在此条件下，溶氧量的增加仅仅强化了NH₄ ⁺→NO₂ ^-过程，而并未增强NH₄ ⁺→NO₃ ^-过程，这样的途径为实现脱氮反应器中的短程硝化反硝化提供了十分有利的条件。不仅如此，此时硝化区域达到了1031.84mg/(L·d)，较普通装置存在显著提升。

式(1)：NO₃ ^-+1.08CH₃OH→0.065C₅H₇NO₂+0.468N₂+1.68CO₂+HCO₃ ^-

在包含微生物自身生长消耗的条件下，正常反硝化碳源消耗理论反应方程式如式(1)所示，此时C/N为3.70。观察图9可知，本实验条件下反硝化区域C/N为3～5时，反硝化脱氮效果彻底，出水水质中不含有NO₂ ^-。当C/N进一步下降为2时，出水水质中检测到残余NO₂ ^-，表明此时反硝化碳源不足。适当调高至C/N＝2.5时，出水水质中NO₂ ^-消失，周期内的持续运行也并未发现NO₂ ^-再次检出，可认为此时碳氮消耗契合。通过计算，不难发现此时碳源消耗较正常反硝化减少32.43％左右，约有87.08％的氮素是通过短程反硝化进行脱氮的，证明利用硝化细菌CNOx构建短程硝化反硝化脱氮系统是可行的。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一株兼性营养型氨氧化细菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1096

<212> DNA

<213> 红球菌(Rhodococcus sp.)

<400> 1

gctggggggg gtctacctgc agtcgaacga tgaagcccag cttgctgggt ggattagtgg 60

cgaacgggtg agtaacacgt gggtgatctg ccctgcactt cgggataagc ccgggaaact 120

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tgaaatcccg cagctcaact gcgggcgtgc aggcgatacg ggcagactag agtactgcag 600

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gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt ggattaattc 900

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tttcccttgt ggtcggtgta caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020

ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcctggg ttgccacaat tcggttgggg 1080

actcccagga aactgc 1096

Claims

1.一株红球菌（Rhodococcus sp.）CNOx，其特征在于：于2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21393。

2.权利要求1所述红球菌在污水处理和/或垃圾处理中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述红球菌在生物脱氮中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用的温度为15～35℃，pH为7～8.5。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用依靠短程硝化反硝化脱氮反应器进行。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述短程硝化反硝化脱氮反应器包括硝化区域和反硝化区域，所述硝化区域位于反硝化区域上方，内部填充多孔悬浮球，所述反硝化区域从上到下依次包括抗扰流的分隔层、碳源分布层和填料层。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于：所述填料层从上到下依次包括层状填料层和块状填料层。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于：所述分隔层侧面开口，引入可溶解碳源的硝化液，被硝化液溶解后的碳源进入碳源分布层。