CN102154172A - 一株异养硝化好氧反硝化的嗜吡啶红球菌及其应用 - Google Patents
一株异养硝化好氧反硝化的嗜吡啶红球菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株异养硝化好氧反硝化的嗜吡啶红球菌及其应用。本发明提供的嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans),命名为CPZ-24,其保藏编号为CGMCC No.4401。该菌具有异养硝化作用和好氧反硝化作用,且具有同步硝化反硝化功能,可独立高效完成脱氮的全过程。该菌在脱氮过程中,产生99%的气体为N2,1%的气体为N2O、NO、NO2,利于环境保护。嗜吡啶红球菌CPZ-24可应用于水体脱氮、废水脱氮和富营养化水体处理。本发明为更有效、更经济、更快速地去除畜禽养殖废水中的氮提供了基础,对于治理水体富营养化,恢复健康的生态环境具有深远意义。
Description
技术领域
本发明属于环境污染物生物技术处理领域,涉及一株异养硝化好氧反硝化的嗜吡啶红球菌及其应用。
背景技术
目前,畜禽养殖业集约化、规模化的快速发展,随之而带来的环境污染问题也越发严重。其中畜禽养殖废水中氮污染问题最为突出,多数养殖场废水中的氨氮都超标,超标率为80%以上,氮超标所引起水体的富营养化以及严重的生态环境污染已经成为世界性的问题。因此,对畜禽养殖废水中氮降解的研究,就显得尤为迫切。
目前,在水污染环境处理方面微生物脱氮法与物理、化学法相比较,以它高效率、低成本、无二次污染等不可比拟的优点已被人们所广泛认可,成为环境科学和水处理领域关注和研究的主要内容。
同时硝化反硝化(Simultanous nitrification and denitrification,SND)可使硝化和反硝化反应在同一反应器内同时完成,节省反应空间,缩短反应时间,平衡了反应条件,还克服了传统生物脱氮的很多弊端,被认为是在废水生物脱氮中具有很大的研究价值和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株异养硝化好氧反硝化的嗜吡啶红球菌及其应用。
本发明提供的嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans),命名为CPZ-24,分离自浙江萧山养猪场氧化塘的废水,已于2010年12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),菌种保藏号为CGMCC No.4401。嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)CPZ-24CGMCC No.4401简称嗜吡啶红球菌CPZ-24,是一种新型异养硝化好氧反硝化菌。
嗜吡啶红球菌CPZ-24是采用极限稀释和GN显色培养基显色相结合的方法筛选得到的,具体筛选过程如下:
(1)通过多次富集培养含有氨氧化菌的最优富集液;
(2)采用极限稀释筛选法从最优富集液中筛选异养硝化菌;
(3)采用GN显色培养基显色的筛选方法筛选好氧反硝化菌;
(4)对异养硝化好氧反硝化菌株进行分离纯化进行保藏。
嗜吡啶红球菌CPZ-24可应用于水体脱氮。
嗜吡啶红球菌CPZ-24可应用于废水脱氮。所述废水具体可为畜禽养殖废水。
嗜吡啶红球菌CPZ-24可应用于制备废水处理菌剂。所述废水具体可为畜禽养殖废水。
本发明还保护一种废水处理菌剂,它的活性成分为嗜吡啶红球菌CPZ-24。所述废水具体可为畜禽养殖废水。
嗜吡啶红球菌CPZ-24可应用于富营养化水体处理。
嗜吡啶红球菌CPZ-24可应用于制备富营养化水体处理菌剂。
本发明还保护一种富营养化水体处理菌剂,它的活性成分为嗜吡啶红球菌CPZ-24。
本发明针对传统生物脱氮的弊端,提供了一株新功能菌,嗜吡啶红球菌CPZ-24。该菌具有异养硝化作用和好氧反硝化作用,且具有同步硝化反硝化功能,可独立高效完成脱氮的全过程。该菌在脱氮过程中,产生99%的气体为N2,1%的气体为N2O、NO、NO2,利于环境保护。本发明为更有效、更经济、更快速地去除畜禽养殖废水中的氮提供了基础,对于治理水体富营养化,恢复健康的生态环境具有深远意义。
附图说明
图1为未接菌的GN显色培养基。
图2为接入嗜吡啶红球菌CPZ-24培养3天的GN显色培养基。
图3为嗜吡啶红球菌CPZ-24的扫描电镜照片(8000×)。
图4为嗜吡啶红球菌CPZ-24的透射电镜照片(8000×)。
图5为嗜吡啶红球菌CPZ-24异养硝化生长曲线。
图6为嗜吡啶红球菌CPZ-24异养硝化效果图。
图7为嗜吡啶红球菌CPZ-24好养反硝化生长曲线。
图8为嗜吡啶红球菌CPZ-24好养反硝化效果图。
图9为嗜吡啶红球菌CPZ-24同步硝化反硝化功能实验的硝化产物曲线图。
图10为嗜吡啶红球菌CPZ-24同步硝化反硝化功能实验的反硝化产物曲线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
氨氮浓度的检测方法:纳氏试剂光度法(GB 7479-87)。
亚硝酸盐氮浓度的检测方法:N-(1-萘基)-乙二胺光度法(GB 7493-84)。
硝酸盐氮浓度的检测方法:紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)。
总氮浓度的检测方法:过硫酸钾氧化-紫外分光光度法(GB 11894-89)。
N2的检测采用GC-TCD方法;参考文献:Su J.J.,Liu B.Y.,Chang Y.C.,2001.Comparison of aerobic denitrification under high oxygen atmosphere byThiosphaera pantotropha ATCC 35512 and Pseudomonas stutzeri SU2 newlyisolated from the activated sludge of a piggery wastewater treatmentsystem.J Appl Microbiol.90,457-462.
N2O的检测采用GC-ECD方法;参考文献:Su J.J.,Liu B.Y.,Chang Y.C.,2003.Emission of greenhouse gas from livestock waste and wastewater treatment inTaiwan.Agr.Ecosyst.Environ.95,253-263.
NO的检测采用NOx分析仪(型号:AP1200A,Riken keiki)测定;参考文献:Hung-SooJoo,Mitsuyo Hirai,Makoto Shoda,2006.Piggery wastewater treatment usingAlcaligenes faecalis strain No.4 with heterotrophic nitrification and aerobicdenitrification.Water Research.40,3031.
NO2的检测采用NOx分析仪(型号:AP1200A,Riken keiki)测定;参考文献:Hung-SooJoo,Mitsuyo Hirai,Makoto Shoda,2006.Piggery wastewater treatment usingAlcaligenes faecalis strain No.4 with heterotrophic nitrification and aerobicdenitrification.Water Research.40,3031.
细胞内的氮的检测方法:参考文献:Hung-Soo Joo,Mitsuyo Hirai,Makoto Shoda,2006.Piggery wastewater treatment using Alcaligenes faecalis strain No.4 withheterotrophic nitrification and aerobic denitrification.Water Research.40,3031.
实施例1、嗜吡啶红球菌CPZ-24(异养硝化好氧反硝化菌)的分离和鉴定
一、样品的采集
实验样品为2008年4月取自浙江萧山养猪场氧化塘的废水。
二、嗜吡啶红球菌CPZ-24的分离和筛选
1、最优富集液的培养
取10mL水样接入相同的装有90mL已灭过菌的富集培养基中,于30℃、120r/min摇床培养。经多次富集培养,通过格里斯试剂和二苯胺试剂检测样品中氨氧化菌的存在,并选取镜检下菌落大、数量多的作为最优富集液。
富集培养基:将(NH4)2SO4 0.5g、琥珀酸2.17g、维氏盐溶液50mL溶解后用蒸馏水定容至1L(固体培养基中加入琼脂,使其质量百分含量为2%)。
维氏盐溶液:将K2HPO4·3H2O 6.5g、MgSO4·7H2O 2.5g、NaCl 2.5g、FeSO4·7H2O0.05g、MnSO4·H2O 0.04g溶解后用蒸馏水定容至1L。
2、异养硝化菌的筛选
富集液中分别吸取1mL菌液,加入100mL新鲜液体异养硝化培养基中,30℃、120r/min摇床培养2d。检测氨氮量,将氨氮降低的样品重复以上操作2次。对氨氮降低较明显的样品进行极限稀释,样品分别稀释105、106、107倍,将稀释液移入100mL新鲜液体异养硝化培养基中,30℃、120r/min摇床培养2d。检测其氨氮降低量,筛选出氨氮降低最多的样品进行多次纯种分离,采用平板涂布法和平板划线分离法进行多次纯种分离。
异养硝化培养基:将(NH4)2SO4 0.24g、琥珀酸钠2.81g、维氏盐溶液50mL溶解后用蒸馏水定容至1L(固体培养基中加入琼脂,使其质量百分含量为2%)。
3、好氧反硝化菌的筛选
将若干初筛菌再次进行氨氮和总氮降解率的测定,挑选出降解率较高的菌株。将其接种到GN显色培养基上,30℃培养24h,能使GN培养基由绿色变成蓝色的菌株作为复筛菌,即为异养硝化好氧反硝化菌(见图1和图2)。
GN显色培养基(pH7.0):KNO3 1.0g,L-天冬酰胺1.0g,用酒精稀释的0.1%(质量百分含量)百里酚蓝(BTB)5mL,柠檬酸钠8.5g,KH2PO4 1.0g,MgSO4·7H2O 1.0g,CaCl2·6H2O 0.2g,FeCl3·6H2O 0.05g,溶解后用蒸馏水定容至1L。
4、异养硝化好氧反硝化菌株进行纯化、进行石蜡保藏。
将筛选后的复筛菌种,经过多次的平板划线培养后得到不同的单个菌落,直至显微镜下检验无杂菌,即为纯化的菌株,将其命名为CPZ-24。
将液体石蜡置于100mL的小锥形瓶内,塞上棉塞,外包牛皮纸,高压蒸汽灭菌,121℃灭菌30min。灭菌后将装有液体石蜡锥形瓶置于105~110℃的烘箱内lh,以除去液体石蜡的水分。将菌株CPZ-24接种至斜面培养基上。30℃培养箱内培养48h,使其充分生长。用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡,注入到已长好的斜面上,使菌种CPZ-24与空气隔绝。将已注入液体石蜡的斜面培养物直立,置于4~5℃冰箱保存。
三、嗜吡啶红球菌CPZ-24的鉴定
1、形态学鉴定
将菌株CPZ-24涂于平板上,获得单菌落,观察其菌落形态,用透射电镜和扫描电镜观察其菌体形态等。CPZ-24颜色为橙红色,菌体形态为杆状(见图3和图4)。
2、生理生化鉴定
依据《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定,结果见表1。
表1 菌株CPZ-24的生理生化特征
3、16S rDNA的PCR扩增和测序
用通用引物F27和R1492对菌株CPZ-24的总DNA进行PCR扩增,得到长度为1437bp的16SrDNA序列,见序列表的序列1。
F27:5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’;
R1492:5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
将测得的菌株CPZ-24的16S rDNA基因序列在GenBank数据库中通过Blast方法比对,与嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)同源性达到99%。
通过对菌株的形态、生理生化特征和16SrDNA序列进行分析,将CPZ-24鉴定为嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)。将嗜吡啶红球菌(Rhodococuuspyridinivorans)CPZ-24保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为No.4401。嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)CPZ-24CGMCC No.4401简称嗜吡啶红球菌CPZ-24。
实施例2、嗜吡啶红球菌CPZ-24的异养硝化作用
维氏盐溶液:将K2HPO4·3H2O 6.5g、MgSO4·7H2O 2.5g、NaCl 2.5g、FeSO4·7H2O0.05g、MnSO4·H2O 0.04g溶解后用蒸馏水定容至1L。
异养硝化培养基:将(NH4)2SO4 0.24g、琥珀酸钠2.81g、维氏盐溶液50mL溶解后用蒸馏水定容至1L。
一、嗜吡啶红球菌CPZ-24在异养硝化培养基中的生长曲线
将5mL活化后的嗜吡啶红球菌CPZ-24菌液接种于100mL新鲜异养硝化培养基中,保证充足的氧气,30℃、120r/min摇床培养,每隔2h取样,在600nm处检测吸光值(D值,D600)。
菌液的D值反映CPZ-24的细胞生长密度,根据各个时间点菌液的D值绘制生长曲线,见图5。嗜吡啶红球菌CPZ-24在0-6h为适应期,6h开始进入对数生长期,20h达到最大生长量,之后进入稳定生长期。
二、嗜吡啶红球菌CPZ-24的异养硝化效果
将5mL活化后的嗜吡啶红球菌CPZ-24菌液接种于100mL新鲜异养硝化培养基中,保证充足的氧气,30℃、120r/min摇床培养,每隔2h取样,检测氨氮浓度[p(NH4 +-N),mg/L]、亚硝酸盐氮浓度[p(NO2 --N),mg/L]、硝酸盐氮浓度[p(NO3 --N),mg/L]以及总氮浓度[p(TN),mg/L]。
氨氮浓度、亚硝酸盐氮浓度、硝酸盐氮浓度以及总氮浓度的结果见图6。氨氮起始浓度为50mg/L,反应进行到20h,嗜吡啶红球菌CPZ-24可将培养基中的氨氮全部去除,对总氮的去除率可达到98%。
实施例3、菌株的好氧反硝化作用
微量元素溶液:EDTA 50.0g、ZnSO4 2.2g、CaCl2 25.5g、MnCl2·4H2O 5.06g、FeSO4·7H2O5.0g、CuSO4·5H2O 1.57g、CoCl2·6H2O 1.61g,溶解后用蒸馏水定容至1L。
好氧反硝化培养基(pH7.0):KNO3 0.36g、Na2HPO4·7H2O 7.9g、KH2PO4 1.5g、MgSO4·7H2O 0.1g、琥珀酸钠2.81g、微量元素溶液2mL,溶解后用蒸馏水定容至1L。
一、嗜吡啶红球菌CPZ-24在好氧反硝化培养基中的生长曲线
将5mL活化后的嗜吡啶红球菌CPZ-24菌液接种于100mL新鲜好氧反硝化培养基中,保证充足的氧气,30℃、120r/min摇床培养,每隔4h取样,在600nm处检测吸光值(D值,D600)。
菌液的D值反映CPZ-24的细胞生长密度,根据各个时间点菌液的D值绘制生长曲线,见图7。嗜吡啶红球菌CPZ-24在0-4h为适应期,4h开始进入对数生长期,16h达到最大生长量,之后进入稳定生长期。
二、嗜吡啶红球菌CPZ-24的好氧反硝化效果
将5mL活化后的嗜吡啶红球菌CPZ-24菌液接种于100mL新鲜好氧反硝化培养基中,保证充足的氧气,30℃、120r/min摇床培养,每隔4h取样,检测亚硝酸盐氮浓度[p(NO2 --N),mg/L]、硝酸盐氮浓度[p(NO3 --N),mg/L]以及总氮浓度[p(TN),mg/L]。
亚硝酸盐氮浓度、硝酸盐氮浓度以及总氮浓度的结果见图8。硝酸盐氮的浓度由开始的50.0mg/L降低到16.60mg/L,去除率达到66.74%,总氮的去除率达到64%。
实施例4、菌株的同步硝化反硝化功能
维氏盐溶液:将K2HPO4·3H2O 6.5g、MgSO4·7H2O 2.5g、NaCl 2.5g、FeSO4·7H2O0.05g、MnSO4·H2O 0.04g溶解后用蒸馏水定容至1L。
异养硝化培养基:将(NH4)2SO4 0.47g、琥珀酸钠5.6g、维氏盐溶液50mL溶解后用蒸馏水定容至1L。
为了验证菌株的同步硝化与反硝化,需要对反应过程中硝化产物和反硝化产物进行分析。实验所用的反应器为50L全自动不锈钢密封生物反应器。所有实验均在室温25℃完成。生物反应器内反应温度为30±0.2℃,反应器内溶解氧DO(METTLERInPro6800,Switzerland)的范围为4-6mg/L,通过气体流量计和搅拌器控制。
蒸汽灭菌后,将已灭过菌的20L异养硝化培养基注入反应器内,并接入1.5L种子培养液(D600=1.164的嗜吡啶红球菌CPZ-24菌液),密封反应器。打开进气口和出气口,两端均有气体过滤器。以3L/min的高纯氧气(99.99%)量通入反应器数分钟,直到反应器和管道中的氮气全部被排出。关闭出气口,通入高纯氩气(99.9992%),反应器内的压力恒定为0.5MPa.。每间隔5小时,从反应器的顶部取样口取气体样品检测N2、N2O、NO、NO2,从反应器的底部取样口取液体样品检测氨氮浓度[p(NH4 +-N),mg/L]、亚硝酸盐氮浓度[p(NO2 --N),mg/L]、硝酸盐氮浓度[p(NO3 --N),mg/L]和细胞内的氮[intracellular-N,mg/L]。
氨氮浓度、亚硝酸盐氮浓度、硝酸盐氮浓度、细胞内的氮浓度的检测结果见图9。N2、N2O、NO、NO2的检测结果见图10。经过25h,氨氮去除率达到86%,其中13%的氨氮转化为硝化产物(NO3 --N、NO2 --N),24%的氨氮转化为细胞内的氮,48%的氨氮转化为反硝化产物(N2、N2O、NO、NO2),其中N2占反硝化产物的99%。以上结果表明,嗜吡啶红球菌CPZ-24具有同步硝化反硝化功能。
Claims (10)
1.嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)CPZ-24,其保藏编号为CGMCCNo.4401。
2.嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)CPZ-24CGMCC No.4401在水体脱氮中的应用。
3.嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)CPZ-24CGMCC No.4401在废水脱氮中的应用。
4.嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)CPZ-24CGMCC No.4401在制备废水处理菌剂中的应用。
5.如权利要求3或4所述的应用,其特征在于:所述废水为畜禽养殖废水。
6.一种废水处理菌剂,它的活性成分为嗜吡啶红球菌(Rhodococuuspyridinivorans)CPZ-24CGMCC No.4401。
7.如权利要求6所述的废水处理菌剂,其特征在于:所述废水为畜禽养殖废水。
8.嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)CPZ-24CGMCC No.4401在富营养化水体处理中的应用。
9.一种富营养化水体处理菌剂,它的活性成分为嗜吡啶红球菌(Rhodococuuspyridinivorans)CPZ-24CGMCC No.4401。
10.嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)CPZ-24CGMCC No.4401在制备富营养化水体处理菌剂中的应用。
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