CN104911130A - 一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其应用,属于微生物应用技术领域。盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1,保藏编号为CCTCC NO:M2015266。盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1能快速高效去除水体中的硝酸盐和亚硝酸盐,且对高浓度亚硝酸盐具有很强的耐受性及去除能力。盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在处理高浓度亚硝酸盐废水、含氮废水生物脱氮、水产养殖亚硝酸盐去除等中应用。所述含氮废水包括但不限于硝酸盐废水、亚硝酸盐废水、氨氮废水等。盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1-6-1能够耐受亚硝酸盐氮达4000mg/L。
Description
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域,具体是涉及一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其应用。
背景技术
天然水体中,氮以-3至+5九种不同价态形式存在,在生物及非生物因素的共同作用下,它们在水体内不断地迁移转化,构成一个复杂的动态循环。其中氨氮、亚硝酸盐等可以导致对湖泊、河流、近海海洋等的酸化和富营养化,同时作为具有潜在毒性的无机氮化合物,也对养殖生物具有毒害作用。如何经济、高效地去除水体中的氮素污染,已成为水污染控制领域的重点研究内容。
目前应用于水体脱氮的方法主要包括物理法、化学法及生物脱氮法。其中,物理、化学法操作复杂,需要增加设备投资额,运行成本高。同时该方法对有机物去除效率低,会造成二次污染,因此在实际运用中存在一定的局限性。近年来,人们开始尝试利用微生物、植物或其他生物自身具有的功能消除或改变污染物存在形态,达到降低污染物毒性的目的。与物理、化学脱氮相比,生物脱氮在系统内仅靠生物自身的能量循环和物质循环起作用,不引入其他外来物质。由于生物脱氮技术具有成本低、易操作、无二次污染、脱氮彻底等优点,逐渐应用于工业废水脱氮处理。
参与生物脱氮的微生物主要包括硝化细菌和反硝化细菌。传统理论认为,细菌的反硝化作用是一个严格的厌氧过程,反硝化细菌会优先利用氧气作为最终电子受体。好氧反硝化细菌的发现,突破了传统的认识,同时也为人们研究新的生物脱氮技术提供了新的思路。好氧反硝化,是指在有氧条件下能以NO3 --N、NO2 --N作为最终电子受体,进行反硝化过程。目前已发现的好氧反硝化菌主要集中在假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)和芽孢杆菌属(Bacillus)。尽管国内外对于好氧反硝化菌的分离、筛选以及机理研究较多,但优良菌种较少,仍无法满足目前工业生产的需求。分离筛选高效好氧反硝化细菌,并对其好氧反硝化特性进行研究,对含氮废水的生物脱氮具有重要的理论价值和实际意义。
中国专利CN 201410138167.4公开一株具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株 HGMN521及其应用。具体涉及一种具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521,该菌株的保藏名称:盐单胞菌HGMN521,分类命名:Halomonas sp.HGMN521,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏日期:2009年8月28日,保藏号:CCTCC NO:M209187,保藏地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心;还公开了该菌株HGMN521在处理受无机氮污染海水中的应用。该菌株在好氧条件下具有高效反硝化能力,能快速有效的去除受无机氮污染海水中的亚硝酸盐氮(NO2 --N)及硝酸盐氮(NO3 --N),且对海水养殖生物没有毒害致病作用,具有安全、环保、高效的特点。
中国专利CN 20120458579公开一株具有异养硝化好氧反硝化功能的盐田盐单胞菌及其应用。该发明的盐田盐单胞菌BMEN3(Halomonas campisalis BMEN3),具有异养硝化好氧反硝化功能,其保藏编号为:CGMCC NO.6536。该发明筛选出的菌株Halomonas campisalis BMEN3在高盐高碱条件下仍具有异养硝化和好氧反硝化能力,而且菌株能在有氧异养条件下生长,这大大提高了菌体的生长速率,提高挂膜速度,缩短反应器启动时间,提高了脱硝效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有脱氮能力的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1,该菌株在好氧条件下,能快速高效去除硝酸盐和亚硝酸盐,且对亚硝酸盐具有很强的耐受性和去除能力。
本发明的第二个目的在于提供所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在含氮废水生物脱氮以及在水产养殖亚硝酸盐去除中的应用。
所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1,已于2015年04月29日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为中国武汉武汉大学;保藏编号为CCTCC NO:M 2015266。
所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1是从污水处理厂初沉池污泥中定向富集分离获得。所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1也保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC),保藏编号为:MCCC 1A10904。
所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1具有以下特征:
1、形态特征:盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1,革兰氏阴性,在Marine Agar固体培养基上28℃培养24h,菌落呈米白色、表面光滑、微凸起、边缘规则、不透明,菌落直径大小约为0.5~1mm。
2、生理生化特征:菌株生长盐度为0~6%,7%以上不生长,最适为1~3%;生长pH 为6.5~10.5,最适为7.5~9.5。生长温度为10~45℃,最适为30~40℃。氧化酶(+),接触酶(-),硝酸盐还原(+),吲哚试验(-),能发酵D-葡萄糖产酸,明胶液化(-),尿素酶(+),β-葡萄糖苷酶(-),β-半乳糖苷酶(-),能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、苹果酸、柠檬酸、苯乙酸,不能利用癸酸、己二酸、、L-阿拉伯糖、D-甘露糖。
API ZYM结果显示,盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1具有碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、酸性磷酸酶、β-葡(萄)糖苷酶,不具有胱氨酸氨肽酶、胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-胰凝乳蛋白酶、β-葡(萄)糖苷酸酶、α-葡(萄)糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶等酶活性。
3、16S rRNA基因序列分析:按照常规方法抽提盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的基因组DNA,并对16S rRNA基因序列进行测定,盐单胞菌CYQ1-6-1的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
经BLAST比对分析,盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的16S rRNA基因与Halomonas daqingensis DQD2-30(T)EF121854相似性最高,分别为98.99%,其次为H.kenyensis AIR-2(T)AY962237和H.desiderata FB2(T)X92417,分别为98.39%和98.38%。
综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rDNA基因序列分析结果,本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1属于盐单胞菌属,为该属的一个潜在新种,具体为盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1。
本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1能快速高效去除水体中的硝酸盐和亚硝酸盐,且对高浓度亚硝酸盐具有很强的耐受性及去除能力。
所述脱氮作用在含氮模拟废水中进行,所述含氮模拟废水溶解氧浓度为0~7ppm。
所述含氮模拟废水的碳源为甲酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、酒石酸钾钠及琥珀酸钠,优选碳源为柠檬酸钠。
所述含氮模拟废水的C/N为3~24,优选C/N为6~24。
所述含氮模拟废水的pH值为5.5~10.5,优选pH值为7.5~9.5。
所述含氮模拟废水的盐度为0~60g/L,优选为10~30g/L。
所述含氮模拟废水的温度为15~45℃,优选为30~45℃。
在优选条件下,盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1-6-1分别能在12h、16h和16h内将模拟废水中的100mg/L NO3 —N、NH4 +-N和NO2 --N完全去除,分别在36h、48h、60h和72h将500mg/L、600mg/L、700mg/L和1000mg/L NO2 --N完全脱除,具有高效脱氮能力。
由此可见,盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在处理高浓度亚硝酸盐废水、含氮废水生物脱氮、水产养殖亚硝酸盐去除等中应用。
所述含氮废水包括但不限于硝酸盐废水、亚硝酸盐废水、氨氮废水等。
所述盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1-6-1能够耐受亚硝酸盐氮达4000mg/L。
本发明与现有技术相比有如下突出效果:
1.本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1以铵盐、硝酸盐或亚硝酸盐为唯一氮源均能正常生长及脱氮,可适用于各种含氮废水的生物脱氮处理,是一株新发现的具有高效脱氮性能的好氧反硝化菌株。该菌在有氧、无氧情况下均可进行无机氮素的去除,突破了传统反硝化菌受氧气抑制的限制。
2.本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1能利用低浓度碳源(C/N=3)进行反硝化,脱氮效率高,在实际废水脱氮中可以节省碳源使用,该特性大大增加了盐单胞菌为(Halomonassp.)CYQ1-6-1的实用性能。
3.本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1对高浓度的亚硝酸盐耐受性强,脱氮效率高,能在72h内将1000mg/L NO2 --N完全去除。
附图说明
图1为不同碳源对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响(右侧纵坐标对应NO2 --N的含量及菌体浓度OD600两个值)。
图2为不同C/N对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响(右侧纵坐标对应NO2 --N的含量及菌体浓度OD600两个值)。
图3为不同pH对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响(右侧纵坐标对应NO2 --N的含量及菌体浓度OD600两个值)。
图4为不同盐度对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响(右侧纵坐标对应NO2 --N的含量及菌体浓度OD600两个值)。
图5为不同温度对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响(右侧纵坐标对应NO2 --N的含量及菌体浓度OD600两个值)。
图6为盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在最适条件下对模拟废水中硝酸盐的去除效果(右侧纵坐标对应NO2 --N的含量及菌体浓度OD600两个值)。
图7为盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在最适条件下对模拟废水中亚硝酸盐的去除效果。
图8为盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1对含高浓度亚硝酸盐的模拟废水的脱氮效果(以500、600、700、1000mg/l NO2 --N)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述的实施例中的方法,如无特别说明,均为常规方法。
实施例1盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的富集、分离和鉴定
1菌株的富集和分离:取厦门前埔污水处理厂初沉池污泥样品10g,加入90ml富集培养基(乙酸钠1g/L,柠檬酸钠2.5g/L,NaCl 20g/L,KH2PO42g/L,Na2HPO43g/L,MgSO4·7H2O0.05g/L、FeSO4·7H2O 0.02g/L、CaCl20.02g/L,蒸馏水1000mL,pH 7.6~8.2,121℃灭菌20min),以0.5g/L NO2 --N作为唯一氮源,28℃,160rpm/min震荡培养,进行好氧反硝化细菌的第一次富集。15天后,从初次富集培养液中取10mL样品液,转接到新鲜富集培养液中,以1.0g/L NO2 --N作为唯一氮源,28℃,160rpm/min震荡培养,进行第二次富集。15d后,从二次富集培养液中取10mL样品液,转接到新鲜的富集培养液中,添加1.5g/L NO2 --N作为唯一氮源,28℃,160r/min震荡培养,进行第三次富集。完成三次富集培养后,采用梯度稀释涂布平板法,分别用Marine Agar固体培养基涂板分离纯化得到盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的单菌。该菌也保藏在中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC),保藏编号为:MCCC 1A10904。
2菌株的生理生化特征和分子鉴定
形态特征:盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1,革兰氏阴性,在Marine Agar固体培养基上28℃培养24h,菌落呈米白色、表面光滑、微凸起、边缘规则、不透明,菌落直径大小约为0.5~1mm。
生理生化特征:菌株生长盐度范围为0~6%,7%以上不生长,最适为1%~3%;生长pH为6.5~10.5,最适为7.5~9.5。生长温度为10~45℃,最适为30~45℃。氧化酶(+),接触酶(-),硝酸盐还原(+),吲哚试验(-),能发酵D-葡萄糖产酸,明胶液化(-),尿素酶(+),β-葡萄糖苷酶(-),β-半乳糖苷酶(-),能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、苹果酸、柠檬酸、苯乙酸,不能利用癸酸、己二酸、L-阿拉伯糖、D-甘露糖。
API ZYM结果显示,盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1具有碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、酸性磷酸酶、β-葡(萄)糖苷酶,不具有胱氨酸氨肽 酶、胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-胰凝乳蛋白酶、β-葡(萄)糖苷酸酶、α-葡(萄)糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶等酶活性。
分子鉴定:按照常规方法抽提盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的基因组DNA,并对16S rRNA基因序列进行测定。经BLAST比对分析,盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的16S rRNA基因与Halomonas daqingensis DQD2-30(T)EF121854相似性最高,为98.99%,其次为H.kenyensis AIR-2(T)AY962237和H.desiderata FB2(T)X92417,分别为98.39%和98.38%。
综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列分析结果,本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1属于盐单胞菌属,为该属的一个潜在新种,具体为盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1。盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在模拟废水中脱氮条件优化
从MA平板上刮取新鲜的菌体,用无菌海水重悬,菌种浓度调至109cfu/mL,按照0.2%的接种量接种到含有一定浓度的NO3 --N或者NO2 --N的模拟废水中,测定菌株在不同碳源,pH值,温度,盐度,C/N比时的脱氮情况,进行反硝化条件的优化。
模拟废水:KH2PO42g/L,Na2HPO43g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L、FeSO4·7H2O 0.02g/L、CaCL20.02g/L,蒸馏水1000mL,121℃灭菌20min。
实验测定方法:硝酸盐氮测定采用GB T12763锌镉还原法测定;亚硝酸盐氮测定采用GB 7493-87一盐酸萘乙二胺分光光度法。
1.不同碳源对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1反硝化性能的影响:以100mg/LNO3 --N为唯一氮源,分别以甲酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、酒石酸钾钠、琥珀酸钠作为唯一碳源,在C/N=15,pH=7.6,盐度2%,28℃,160r/min条件下震荡培养16h,测定菌浊度(OD600)及硝酸盐及亚硝酸盐含量。实验结果如图1所示,盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在以琥珀酸钠为唯一碳源时,生长好且脱氮效率最高,能在24h内能将100mg/L NO3 --N完全去除且无亚硝酸盐积累。
2.不同C/N比对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1反硝化性能的影响:以100mg/L NO3 --N为唯一氮源,琥珀酸钠为碳源,pH=7.6,盐度2%,设置不同C/N比(3、6、9、12、15、18、21、24),28℃,160r/min震荡培养24h,测定菌浊度(OD600)及硝酸盐和亚硝酸盐含量。结果见图2,结果表明盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在C/N为3~24时均能生长,且在24h内盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1能将100mg/L NO3 --N去除完 全,说明菌株在C/N比较低时就表现出高的脱氮效率,在实际废水脱氮处理中可以减少碳源投加。
3.不同pH值对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1反硝化性能的影响:以100mg/LNO3 --N为唯一氮源,琥珀酸钠为碳源,C/N=12,盐度2%,设置不同的pH值(5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5),28℃,160r/min震荡培养24h,测定菌浊度(OD600)及硝酸盐和亚硝酸盐含量。结果见图3,结果表明盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1适合在偏碱条件下(pH=7.5~9.5)进行脱氮,此时盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1对硝酸盐的去除率均达到100%,无亚硝酸盐残留。
4.不同盐度对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1反硝化性能的影响:以100mg/LNO3 --N为唯一氮源,琥珀酸钠为碳源,C/N=12,pH=7.8,设置不同盐度(0、10、20、30、40、50、60g/L),28℃,160r/min震荡培养24h,测定菌浊度(OD600)及硝酸盐和亚硝酸盐含量。结果见图4,结果表明盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1最适的脱氮盐度为1~3%,菌体生长快且脱氮效果高,24h内脱氮效率均达到100%,并且无亚硝酸盐累积。
5.不同温度对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1反硝化性能的影响:以100mg/L NO3 --N为唯一氮源,琥珀酸钠为碳源,C/N=12,pH=7.8,盐度为3%,设置不同温度(15℃、25℃、35℃、40℃、45℃),160r/min震荡培养24h,测定菌浊度(OD600)及硝酸盐和亚硝酸盐含量。结果见图5,结果表明30-45℃时,盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1生长快,硝酸盐去除效率达到100%且无亚硝酸积累。
实施例3最优条件下盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在模拟废水中的脱氮效果
挑取盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的单菌落划线至Marine Agar固体平板上,28℃培养24h后取出,刮取新鲜菌体,用无氮培养基制成菌悬液,菌种浓度调至109cfu/mL,按照0.2%的接种量分别接种到以100mg/L NO3 --N或NO2 --N为唯一氮源的模拟废水中(琥珀酸钠3.37g/L,NaCl 20g/L,KH2PO42g/L,Na2HPO43g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L、FeSO4·7H2O 0.02g/L、CaCl20.02g/L,蒸馏水1000mL,pH 7.6,121℃灭菌20min),于30℃,160r/min摇床中培养,每隔4h取样检测废水中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度、菌体浓度OD600。结果见图6-7,结果表明盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在该最优条件下,分别在12h和16h时可将废水中的硝酸盐和亚硝酸盐完全脱除,脱氮速率分别为8.33mg-N/L·h和6.25mg-N/L·h。此外,在以100mg/L NH4 +-N为唯一氮源时,菌株CYQ1-6-1能在16h脱氮完全,脱氮速率为6.25mg-N/L·h。
实施例4盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1对含高浓度亚硝酸盐的模拟废水的脱 氮效果
培养方法同实施例3。在以500mg/L、600mg/L、700mg/L、1000mg/L NO2 --N为唯一氮源的模拟废水中,对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1生长情况及脱氮性能进行测定。结果见图8,结果表明盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1对高浓度亚硝酸盐具有很好的耐受性和去除能力,分别能在36h、48h、60h和72h内将模拟废水中的500mg/L、600mg/L、700mg/L和1000mg/L亚硝酸盐完全脱除,脱氮速率分别为:13.89mg-N/L·h、12.5mg-N/L·h、10mg-N/L·h、13.89mg-N/L·h。此外,菌株CYQ1-6-1可耐受高达4g/LNO2 --N,在72h内对4g/L的NO2 --N去除率可达50%。
Claims (4)
1.盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1已于2015年04月29日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2015266。
2.如权利要求1所述盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在含氮废水生物脱氮中应用。
3.如权利要求2所述应用,其特征在于所述含氮废水包括但不限于硝酸盐废水、亚硝酸盐废水、氨氮废水。
4.如权利要求1所述盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在水产养殖亚硝酸盐去除中应用。
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