CN116004448B

CN116004448B - 一株嗜吡啶红球菌及微生物菌剂和应用

Info

Publication number: CN116004448B
Application number: CN202211557719.6A
Authority: CN
Inventors: 吕镇梅; 吴昊; 殷一然; 蒋经纬; 蒋正海
Original assignee: Zhejiang Haihe Environmental Technology Co ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang Haihe Environmental Technology Co ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-12-06
Filing date: 2022-12-06
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2042-12-06
Also published as: CN116004448A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株嗜吡啶红球菌及微生物菌剂和应用。该菌株的保藏编号为CCTCCNO:M2022730。该菌株对废水中的氮和磷具有显著的去除效果，除氮效果尤其显著，其中，去硝氮率和去亚硝氮率分别达100％和92.3％，可用于天然水体生态改造或原位修复。

Description

一株嗜吡啶红球菌及微生物菌剂和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株嗜吡啶红球菌及微生物菌剂和应用。

背景技术

随着人类的活动，水体富营养化已成为全球性问题，许多研究发现导致富营养化的主要原因之一是富含氮的生活废水、农业废水、工业废水排放至水体中。因此，从水体中除去积聚的氮是防治水体富营养化的关键,污水处理目前主要使用化学除氮和生物脱氮。生物脱氮主要包括三个过程，分别是氨化、硝化和反硝化。将废水中的硝酸盐或亚硝酸盐，在反硝化细菌的作用下还原为气态氮的过程就是反硝化反应。

反硝化细菌属于异养型的兼性细菌，并不是一类专门的细菌，分属于不同的种属，在自然界中广泛的分布。反硝化细菌能够在缺氧条件下，以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体，以有机物作为电子供体，对硝态氮进行还原。该反应由膜结合的硝酸还原酶(NAR)或质周硝酸还原酶(NAP)催化。许多生物，包括模式生物反硝化副球菌，都含有NAP和NAR。NAR减少细胞质中的硝酸盐，并向细胞质周释放质子，从而通过质子动力直接促进能量守恒。相比之下，NAP将周质中的硝酸盐减少为亚硝酸盐，因此不会使质子移位，而这可能有助于质子动力。硝酸盐异化还原为亚硝酸盐不仅仅是反硝化的第一步。部分微生物将还原硝酸盐为亚硝酸盐再到铵，而大部分微生物，只将硝酸盐还原为亚硝酸盐。硝酸盐还原是其他氮循环过程(包括好氧亚硝酸盐氧化和厌氧氨氧化)中亚硝酸盐的主要来源。异化硝酸盐还原耦合电子供体(如有机物、甲烷、硫化合物、氢或铁)的氧化作用。硝酸盐是含有同化硝酸盐还原酶(NAS)的真核生物、细菌和古菌的主要氮源。考虑到硝酸盐支持至少20％的海洋藻类生长70，硝酸盐同化的程度可能超过海洋中大多数其他氧化还原驱动的氮循环过程。NAS与同化亚硝酸盐还原酶一起产生氨，氨被纳入生物物质。由于NAS位于细胞质中，硝态氮的同化需要通过依赖ATP的转运蛋白将硝态氮转运到细胞内。由于这种能量需求，NAS的表达在充满氨的环境中被抑制，如肥沃的土壤。细菌和古细菌的NAS与NAP、NAR和NXR一起属于二甲亚砜还原酶家族。这表明硝酸还原酶有多种来源。原则上，硝酸盐同化还原产生的亚硝酸盐可以在呼吸链中进一步减少。相反，结核分枝杆菌已被证明使用NAR复合体进行硝酸盐同化。

亚硝酸盐还原为铵，既可用于异化，也可用于同化。亚硝酸盐异化还原为铵是由大多数细菌谱系进行的。这种反应是由nrfAH编码的周质的细胞色素c亚硝酸盐还原酶(ccNIR)、八面体血红素亚硝酸盐还原酶(ONR)或者八面体血红素连四硫酸盐还原酶(OTR)催化完成。目前尚不清楚后两种酶是否能用于呼吸作用、亚硝酸盐或羟胺的解毒作用中。亚硝酸盐还原为铵盐的过程中还涉及到中间产物羟胺的形成，而羟胺一直和相应的酶结合在一起直到转变成铵盐。亚硝酸盐异化还原成铵是所谓的硝酸钠异化还原成铵过程中的关键反应。微生物可以通过将DNRA与电子供体(如有机物、亚铁、氢、硫化物和甲烷)的氧化偶联而生长。人们对DNRA的环境重要性知之甚少；然而，在海洋和湖泊沉积物中，当电子供体相对于硝酸盐过量时，DNRA似乎比反硝化更受青睐。同化亚硝酸盐还原酶可以产生氨，而且它和NAS一样普遍，这两种酶经常被相同的nas操纵子编码。在海洋中亚硝酸盐最大值的形成是由于浮游植物中硝酸盐的同化吸收作用与亚硝酸盐的还原作用并没有偶联，从而可以释放更多的亚硝酸盐，但这种未偶联的生理原因并不清楚。

许多微生物都有将亚硝酸盐还原为一氧化氮的能力，比如变形菌、厌氧氨氧化菌和拟杆菌。这些微生物在很多环境中都能被发现，比如在土壤、低氧区、海洋沉积物等环境中(在这些环境中硝酸盐可被利用且含氧量低)，然而，目前去氮除磷效果显著的微生物仍然比较少见。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株嗜吡啶红球菌及微生物菌剂和应用，该菌株对废水中的磷和氮具有显著的去除效果。

本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M2022730的嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)ZM17。

ZM17菌株按照以下方法分离鉴定：

(1)分别配制培养基A-E：

培养基A为菌株分离、纯化、保藏培养基，其组成为：每升培养基A包含蛋白胨10g，酵母提取物5g，CH₃COONa 2g，琼脂19g，其余为水，调节pH至7.0～7.2.

培养基B为全氮(含N 600mg/L)无机盐培养基，其组成为：每升培养基B包含CH₃COONa 3.42g，KH₂PO₄87.8 mg(P～20mg/L)，K₂HPO₄112.5mg(P～20mg/L)，(NH4)₂SO₄236mg，NH₄Cl 191mg，KNO₃1.44 g，NaNO₂985mg，CaCl₂60 mg，MgSO₄82 mg，HEPES 7g，微量元素2mL，其余为水，调节pH至7.0～7.2。

培养基C为氨氮(含N 200mg/L)无机盐培养基，其组成为：每升培养基C包含CH₃COONa 3.42g，MgSO₄82 mg，FeSO₄3.7 mg，CaCl₂60 mg，(NH₄)₂SO₄472 mg，NH₄Cl 382mg，KH₂PO₄87.8 mg(P～20mg/L)，K₂HPO₄112.5mg(P～20mg/L)，HEPES 7g，微量元素2mL，其余为水，调节pH至7.0～7.2；

培养基D为硝酸盐(含N 200mg/L)无机盐培养基，其组成为：每升培养基D包含乙酸钠3.32g，MgSO₄82 mg，FeSO₄3.7 mg，CaCl₂60 mg，NH₄Cl95mg，KNO₃1.44 g，(NH₄)₂SO₄118 mg，KH₂PO₄87.8 mg(P～20mg/L)，K₂HPO₄112.5 mg(P～20mg/L)，HEPES 7g，微量元素2mL，其余为水，调节pH至7.0～7.2；

培养基E为亚硝酸盐(含N 200mg/L)无机盐培养基，其组成为：每升培养基E包含CH₃COONa 3.32g，MgSO₄82 mg，FeSO₄3.7 mg，CaCl₂60 mg，NH₄Cl 95mg，NaNO₂985 mg，(NH₄)₂SO₄118 mg，KH₂PO₄87.8 mg(P～20mg/L)，K₂HPO₄112.5 mg(P～20mg/L)，HEPES 7g，微量元素2mL，其余为水，调节pH至7.0～7.2。

所述微量元素的组成为：每升微量元素包含FeSO₄·7H₂O 100mg，H₃BO₃20mg，CuSO₄·5H₂O20 mg，AlK(SO₄)₂·12H₂O 15mg,KI 100mg，MnSO₄·7H₂O11mg，CaCl₂60 mg，ZnSO₄·7H₂O 100mg，CoCl₂·6H₂O 100mg，Na₂MoO₄50mg，乙二胺四乙酸10g，其余为水。

(2)富集培养

取不同处理厂污水处理池活性污泥20g至100mL无菌水中于30℃振荡培养12h，取10mL振荡培养后的混合液转接到100mL氮浓度为600mg/L的全氮无机盐培养基B中，30℃富集培养3d，转接至低氨氮无机盐培养基C中培养3d，分别转接至硝酸盐培养基D和亚硝酸盐培养基E中培养3d，在培养基D和E中共转接4轮，富集培养18d，得到富集培养液。

(3)分离纯化

将所述富集培养液稀释至10^-3～10^-6，吸取500μl稀释液于分离纯化平板中，在40℃～42℃下与培养基A混合，凝固后倒置，于30℃恒温培养出菌落；挑取所述平板上的单菌落在平板上进行多次划线纯化，观察显示无杂菌，即得到纯化菌株；挑取生长迅速的菌落接种于涂布100μL BTB(溴百里香酚蓝)显色剂的培养基培养，将产生明显蓝色晕圈的菌落作为候选菌株。

(4)反硝化筛选

将上述候选菌株接种于装有100mL培养基B的锥形瓶中，在130r/min，30℃下振荡培养24h，得预培养液，将所述预培养液按10％分别转接到装有100mL培养基D和培养基E的锥形瓶中，在130r/min，30℃下振荡培养24h；培养完成后取培养液8000g离心10min取上清液，测定上清液的硝氮和亚硝氮浓度，考察菌株对硝氮和亚硝氮的去除率，从而筛选出一株具有较高硝酸盐还原效果的反硝化菌ZM17。ZM17的反硝化率和反亚硝化率分别为100％和92.3％。该菌株的16SrDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明ZM17菌株分离自浙江杭州天子岭垃圾处理厂污水处理池污泥，在LB培养基和无机盐乙酸钠碳源培养基上呈粉红色圆形菌落，无光泽，边缘整齐。经革兰氏染色，鉴定该菌为革兰氏阳性菌。扫描电镜观察菌体呈球状，无鞭毛、菌毛、微荚膜等特殊的细胞结构，生理生化特征如表1所示。

表1ZM17菌株生理生化鉴定

根据Rhodococcuspyridinivorans ZM17的形态特征和生理生化特征，结合菌株ZM17的16S rRNA序列比较鉴定，表明其与Rhodococcuspyridinivorans DSM 44555(T)(GeneBank:LRRI01000001.1)的16S rRNA序列的相似性最高，达到99.23％，最终将Z17其归类于红球菌属，命名为Rhodococcus pyridinivorans ZM17，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2022730，保藏日期为2022年5月26日。

本发明进一步研究了菌株Rhodococcuspyridinivorans ZM17的去氮机制，采用Illumina二代测序技术联用nanopore三代测序技术完成高效去氮菌株Rhodococcuspyridinivorans ZM17的基因组扫描测序，Unicycler拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，得到最优的组装结果后，再运用Pilon软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正。依据拼接序列的总长、scaffold的数量以及scaffoldN50等技术指标，对多个Kmer的组装结果进行综合评定，最终ZM17基因组测序分析获得基因组长度为4563632bp，GC含量为52.12％。

利用Glimmer 3.02软件进行细菌的基因预测，将预测基因的蛋白序列分别与NR、GENEs、STRING和GO数据库进行blastp比对(BLAST 2.2.28+)，鉴定菌株ZM17含1个nar基因、1个nir基因和1个nirK基因，命名为nar-zm17(SEQ NO.2)，nir-zm17(SEQ NO.3)和nirK-zm17(SEQ NO.4)，开放阅读框(ORF)大小分别为3696bp、2517bp和849bp，分别编码1232(SEQNO.5)、839(SEQ NO.6)和283(SEQ NO.7)个氨基酸。

其中，所述硝酸盐还原酶基因nar-z17、亚硝酸盐还原酶基因nir-zm17和含铜亚硝酸还原酶基因nirK-zm17的扩增方法如下：

以菌株Rhodococcuspyridinivorans ZM17基因组为模板，利用PCR的方法获得完整的基因片段nar-zm17、nir-zm17和nirK-zm17。

上述PCR扩增中使用的引物如表2：

表2：nar、nir和nirK基因引物序列信息表

实验表明，ZM17菌株对农污出水、农污原水和乳品厂原水的去氮除磷效果显著，除氮效果尤其显著，其中，去硝氮率和去亚硝氮率分别达100％和92.3％。

本发明还提供了所述的嗜吡啶红球菌在废水除磷、除氮中的应用。

其中，所述废水包括加农污出水、农污原水、乳品厂原水中的至少一种。所述废水中的硝氮含量≤218.16mg/L，亚硝氮含量≤205.3mg/L。

本发明还提供一种用于废水除磷除氮的微生物菌剂，包含嗜吡啶红球菌ZM17菌株。

本发明还提供一种处理废水的方法，包括向含氮和/或磷的废水中施加所述的嗜吡啶红球菌ZM17菌株或所述的微生物菌剂。

本发明提供的处理废水的方法中，向废水中施加所述嗜吡啶红球菌至嗜吡啶红球菌的OD值≥1。

本发明提供了多聚磷酸盐激酶基因，其核苷酸序列为1)～3)中任意一种：

本发明提供了来源于嗜吡啶红球菌Z17菌株的基因，其核苷酸序列为1)～3)中任意一种：

1)、SEQ ID NO：2～4任一项所示的核苷酸序列；

2)、在1)所示的核苷酸序列中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且与1)所示的核苷酸序列编码相同的蛋白或编码的蛋白功能相同或相似的核苷酸序列；

3)、与1)或2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性且编码的蛋白功能相同或相似的核苷酸序列。

本发明还提供了所述的基因编码的蛋白，其氨基酸序列为：

I)、SEQ ID NO：4～6任一项所示的氨基酸序列；

II)、在I)所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与I)所示氨基酸序列的蛋白功能相同或相似的氨基酸序列；

III)、与I)或II)所示的氨基酸序列至少有90％同源性且蛋白功能相同或相似的氨基酸序列。

本发明提供的嗜吡啶红球菌Rhodococcuspyridinivorans ZM17对废水中的磷和氮具有显著的去除效果，除氮效果尤其显著，其中，去硝氮率和去亚硝氮率分别达100％和92.3％，可用于天然水体生态改造或原位修复。

附图说明

图1是Rhodococcuspyridinivorans ZM17菌体的扫描电镜图；1-a为10000倍镜下的观察结果，1-b为40000倍镜下的观察结果；

图2是反硝化基因琼脂糖凝胶电泳图；2-a为硝酸盐还原酶基因琼脂糖凝胶电泳图，ar-zm17基因PCR产物，代表NAR硝酸盐还原酶的编码基因；2-b为亚硝酸盐还原酶基因琼脂糖凝胶电泳图，nir-zm17基因PCR产物，代表NIR亚硝酸盐还原酶的编码基因，nirK-zm17基因PCR产物，代表NIRK含铜亚硝酸盐还原酶的编码基因。

图3是不同碳氮比的反硝化性能图；3-a为不同碳氮比的硝酸盐和亚硝酸盐去除率，3-b为不同碳氮比的生长OD₆₀₀值。

图4是不同碳源的反硝化性能图；4-a为不同碳源的硝酸盐和亚硝酸盐去除率，4-b为不同碳源的生长OD₆₀₀值。

图5是不同pH的反硝化性能图；5-a为不同pH的硝酸盐和亚硝酸盐去除率，5-b为不同pH的生长OD₆₀₀值。

图6是最优反硝化性能图，同时监测除磷性能和生长情况；6-a为硝酸盐和亚硝酸盐去除率，6-b为除磷率和生长OD₆₀₀值。

图7是反硝化和反亚硝化能力范围图；7-a为反硝化能力范围，7-b为反亚消化能力范围。

图8是人工合成废水反硝化除磷性能图；8-a为人工合成废水的硝酸盐和亚硝酸盐去除率，8-b为人工合成废水中的除磷率和菌株生长OD₆₀₀值。

图9是污水处理厂废水反硝化除磷性能图；9-a为不同废水的硝酸盐去除率，9-b为不同废水的亚硝酸盐去除率，9-c为不同废水中的除磷率和菌株生长OD₆₀₀值。

生物保藏说明

Rhodococcuspyridinivorans ZM17，于2022年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2022730。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明，而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

以下实施例中所用的酶、试剂盒及其他试剂均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

以下实施例中所用引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

实施例1：去氮菌Rhodococcuspyridinivorans ZM17的分离与鉴定

1.样品处理

在无菌条件下，取不同处理厂污水处理池活性污泥20g至至已灭菌的含玻璃珠的100mL无菌水中于30℃振荡培养12h，取10mL振荡培养后的混合液转接到100mL氮浓度为600mg/L的全氮无机盐培养基B中，30℃富集培养3d，转接至低氨氮无机盐培养基C中培养3d，分别转接至硝酸盐培养基D和亚硝酸盐培养基E中培养3d，在培养基D和E中共转接4轮，富集培养18d，得到富集培养液。

2.分离纯化

将所述富集培养液在无菌条件下稀释至10^-6～10^-3，吸取500μl稀释液于分离纯化平板中，在40℃～42℃下与20mL培养基A混合，凝固后倒置，于30℃恒温培养出菌落；挑取所述平板上的单菌落在平板上进行多次“z字型”划线纯化，至观察显示无杂菌，即得到纯化菌株；挑取生长迅速的菌落接种于涂布100μL的BCIP(对甲苯胺蓝)显色剂的培养基B培养，将生长迅速的蓝绿色菌落作为候选菌株。结合细菌的形态特征和生理生化特征和16SrRNA序列对上述筛选的菌株进行菌种鉴定。

将所述富集培养液在无菌条件下10^-6～10^-3，吸取500μl稀释液于分离纯化平板中，在40℃～42℃下与培养基A混合，凝固后倒置，于30℃恒温培养出菌落；挑取所述平板上的单菌落在平板上进行多次划线纯化，观察显示无杂菌，即得到纯化菌株；挑取生长迅速的菌落接种于涂布100μL BTB(溴百里香酚蓝)显色剂的培养基培养，将产生明显蓝色晕圈的菌落作为候选菌株。结合细菌的形态特征和生理生化特征和16S rRNA序列对上述筛选的菌株进行菌种鉴定。

3.去氮菌筛选

将上述候选菌株接种于装有100mL培养基B的锥形瓶中，在130r/min，30℃下振荡培养24h，得预培养液，将所述预培养液按10％分别转接到装有100mL培养基D和培养基E的锥形瓶中，在130r/min，30℃下振荡培养24h；培养完成后取培养液8000g离心10min取上清液，分别用紫外分光光度法220nm和盐酸-萘乙二胺比色法550nm测定上清液测定上清液的硝氮和亚硝氮浓度，考察菌株对硝氮和亚硝氮的去除率，从而筛选出的具有较高硝酸盐还原效果的反硝化菌。结果ZM17的反硝化率和反亚硝化率分别为100％和92.3％。

4.形态特征的鉴定

1)扫描电镜

用接种环挑取单菌落于5mL LB培养基中，30℃，130rpm培养12h后，4℃，6000×g离心5min收集500μL菌液，用预冷的0.1M PBS洗涤菌体3次后，将菌体悬浮在500μL预冷的2.5％戊二醛固定液中，4℃避光固定24h；0.1MPBS清洗三次；加入400μL 1％锇酸固定2h；先后用30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％乙醇洗脱15min，再用无水乙醇脱水15min(重复二次)；在通风厨中，将样品浸入六甲基二硅胺烷(HMDS)中15min，重复两次；室温下，将样品放入临界干燥仪中进行CO₂置换干燥60min，用剪刀剪裁盖玻片，将适合的样品贴在铜板上；在溅射仪中进行金属铂镀膜，镀金厚度约20-30nm；在扫描电子显微镜下，选取适宜的放大倍数观察样品，并拍照，结果如图1。

2)基因组DNA提取

使用微生物基因组DNA快速抽提试剂盒进行提取，并通过1.0％琼脂糖电泳检测，结果如图2所示。

3)16S rRNA的PCR扩增与鉴定

选用细菌16S rDNA序列通用引物F27/R1492进行PCR扩增，F27引物序列为：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，R1492引物序列为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；

PCR反应体系组成：PCRmixbuffer25μL，3’Primer 1μL，5’Primer 01μL，DNA模版2μL，ddH₂O 21μL，总体积为50μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min；最后72℃温育10min，4℃保存。

取6μL DNA产物用1.0％琼脂糖胶电泳检测。

经BLAST软件与GenBank中已登录的16SrDNA序列进行比对，菌株ZM17与Rhodococcuspyridinivorans的同源性为99.6％，属于红球菌属。

实施例2本发明菌株的最佳去氮条件

1.盐酸-萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐含量

亚硝酸盐标准曲线的制备：吸取0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL亚硝酸钠标准使用液(相当于0，2.5，5，10，15，20，25μg亚硝酸钠)，分别置于25mL带塞比色管中。于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液，加2.5mL60％乙酸后立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25min，用1cm比色杯(灵敏度低时可换2cm比色杯)，以零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，绘制标准曲线。

样品测定：吸取10.0mL上述滤液(4.1)于25mL带塞比色管中，于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液，加2.5mL60％乙酸后立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25min，用1cm比色杯(灵敏度低时可换2cm比色杯)，以零管调节零点，于波长550nm处测吸光度。同时做试剂空白。

2.钼锑抗分光光度法测定总磷，具体方法如下：

配制磷标准使用溶液。分别取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0、4.0、5.0mL磷标准溶液于带盖试管中，加入蒸馏水至总体积为10mL，加入1.6mL过硫酸钾，混匀，120℃消解30min。冷却后，加入0.4mL抗坏血酸溶液，混匀；30s后，加入0.8mL钼酸盐混合液，混匀，室温静置15min。700nm波长下，以1号为空白参照，测定其吸光度，并绘制标准曲线。

3.最佳碳氮比例测定

用本发明保藏的菌株富集培养后接种于不同碳氮比例的培养基D和E中，初始OD₆₀₀＝0.1，C:N分别为1:1、2.5:1、5:1、10:1、20:1和30:1，其中N源分别由NH₄CL-N：KNO₃-N：NaNO₂-N＝1：1：1组成；30℃下振荡培养48h，其中先厌氧培养24h，再好氧培养24h，48h后检测培养基的OD₆₀₀值及去氮率，检测结果如图3所示。由图3结果可知，本发明菌株具有广泛碳源浓度适应性，在C:N 2.5：1至30：1内都有较好的去氮效果，可用于低碳源条件下的废水处理。

4.最佳碳源测定

用本发明保藏的菌株富集培养后接种于不同碳源的富磷培养基C中，初始OD₆₀₀＝0.1，在30℃振荡培养48h，其中先厌氧培养24h，再好氧培养24h，48h后检测培养基的OD₆₀₀值及去氮除磷率，检测结果如图4所示。上述不同碳源的富磷培养基是指培养基C，以等含碳量葡萄糖替代培养基C中乙酸钠所得到的培养基C1，以等含碳量果糖替代培养基C中乙酸钠所得到的培养基C2，以等含碳量蔗糖替代培养基C中乙酸钠所得到的培养基C3，以等含碳量乳糖替代培养基C中乙酸钠所得到的培养基C4；以等含碳量淀粉替代培养基C中乙酸钠所得到的培养基C5。由图4结果可知，本发明菌株能很好的利用各种碳源，最适碳源为乙酸钠。

5.最佳pH值测定

用本发明保藏的菌株富集培养后接种于不同pH的培养基D和E中，初始OD₆₀₀＝0.1，在20℃下振荡培养48h，其中先厌氧培养24h，再好氧培养24h，48h后检测培养基D和E的OD₆₀₀值及去氮率，检测结果如图5所示。上述不同pH值的培养基分别指：培养基D和E；培养基D6和E6：成分与培养基D和E相同，pH5.0；培养基D7和E7：成分分别与培养基D和E相同，pH6.0；培养基D8和E8：成分分别与培养基D和E相同，pH8.0；培养基D9和E9：成分分别与培养基D和E相同，pH9.0；培养基D10和E10：成分分别与培养基D和E相同，pH10.0；由图5结果可知，本发明菌株在pH7-9的范围内，具有很强的去氮活性。

6.最佳条件下去氮除磷能力测定

用本发明保藏的菌株富集培养后接种于培养基B中，初始OD₆₀₀＝0.1，20℃下振荡培养48h，其中先厌氧培养24h，再好氧培养24h，整个培养过程中的实时OD值、反硝化率、反亚硝化率和除磷率如图6所示，48h后反硝化率和反亚硝化率分别达到98.5％和97.7％，除磷率达到45.6％。

7.去氮菌反硝化和反亚硝化能力范围测定

用本发明保藏的菌株富集培养后接种于最适条件培养基B中，初始OD₆₀₀＝0.1，pH＝7.5，保持C含量不变，调整C:P为100：1，其中N源分别由NH₄Cl-N：KNO₃-N：NaNO₂-N＝1：1：1组成，并设置NO₃ ^--N含量为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L和240mg/L，设置NO₂ ^--N含量为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L和240mg/L；30℃下振荡培养48h，其中先厌氧培养24h，再好氧培养24h，48h后检测培养基的OD₆₀₀值及去氮除磷率，检测结果如图7所示。由图7可知，本发明菌株48h内能去除至多218.16mg/L和205.3mg/L的硝氮和亚硝氮。

实施例3：人工合成废水除磷率的测定

1.合成废水培养基配方如下：

三水合醋酸钠890mg、酵母粉10mg、蛋白胨10mg、K₂HPO₄11.25 mg、KH₂PO₄8.8 mg、KNO₃380 mg、NaNO₂246.3 mg、CaCl₂28 mg、NaCl 50mg、NaHCO₃75 mg、MgSO₄75 mg、ddH₂O 1L。硝氮含量为50mg/L，亚硝氮含量为50mg/L，P含量为4mg/L。

2.菌株的去氮率：用本发明保藏的菌株接种于合成中，富集培养12h后厌氧培养12h，共培养24h后接种于200ml合成培养基中，初始OD₆₀₀＝1，好氧培养24h后检测菌株的反硝化率、反亚硝化率、OD₆₀₀值和除磷率，检测结果如图8所示。计算ZM17的硝氮和亚硝氮去除率分别为97.9％和99.3％，除磷率为46.7％。

实施例4：污水处理厂污水去氮除磷

取浙江金华一处农业污水原水和出水以及一处乳品厂污水，分别测定pH、总磷、硝氮和亚硝氮含量如下：

表3

将上述除磷菌株分别接种于装有100mL农污原水、农污出水和乳品污水的锥形瓶中，初始OD₆₀₀＝1，在130r/min，30℃下好氧振荡培养6h；培养完成后取培养液8000g离心10min取上清液，测定上清液的硝氮、亚硝氮和总磷浓度，考察菌株对总磷、硝氮和亚硝氮的去除率，检测结果如图9所示。结果ZM17的去氮除磷率均为100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.保藏编号为CCTCC NO: M2022730的嗜吡啶红球菌（Rhodococcus pyridinivorans）ZM17。

2.根据权利要求1所述的嗜吡啶红球菌，其特征在于，其16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

3.权利要求1或2所述的嗜吡啶红球菌在废水除磷、除氮中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述废水包括农业污水、农村生活污水、乳制品厂污水、化肥厂污水、厨余废水中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述废水中的硝氮含量≤ 218.16 mg/L，亚硝氮含量≤205.3 mg/L。

6.一种用于废水除磷除氮的微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述的嗜吡啶红球菌。

7.一种处理废水的方法，其特征在于，包括向含氮和/或磷的废水中施加权利要求1或2所述的嗜吡啶红球菌或权利要求6所述的微生物菌剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，向废水中施加所述嗜吡啶红球菌至嗜吡啶红球菌的OD值≥1。