CN111925960B

CN111925960B - 一种具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN111925960B
Application number: CN202010760440.2A
Authority: CN
Inventors: 李江
Original assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); First Institute of Oceanography MNR
Current assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); First Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: CN111925960A

Abstract

本发明属于氮污染的技术领域，本发明提供了一种具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌DY‑S025GC05及其应用。本发明提供的具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌DY‑S025GC05，拉丁文为Halomonas sp.，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年5月19日，保藏编号为：CGMCC NO.19847。本发明提供的盐单胞菌DY‑S025GC05同时具有硝化和反硝化的双重活性，通过调节氧含量即可实现硝化和反硝化功能的转换。

Description

一种具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及氮污染的技术领域，尤其涉及一种具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌及其应用。

背景技术

近年来，由于江河湖海中的氮、磷等营养元素过多，使得藻类等水生生物繁殖速度加快，造成水体的富营养化，降低了水体中溶解氧的含量，进而导致水环境恶化。

水体富营养化中，氨氮污染占很大比重，因此引起人们的密切关注。污水处理中的脱氮方法主要有物理化学法和生物法。物理化学法包括折点加氯法、离子交换法等，处理污水需要的成本高，并且对环境造成的影响较大，而生物法成本费用低、脱氮能力强、对环境不会造成二次污染，具有较高的实用价值。传统的生物脱氮法主要包括硝化作用和反硝化作用。硝化作用是指利用亚硝化细菌把NH₄ ⁺转化为NO₂ ^-，再利用硝化细菌把NO₂ ^-转化为NO₃ ^-；反硝化作用是利用反硝化细菌把NO₃ ^-转化为NO₂ ^-，再利用亚硝酸盐还原酶等逐步将NO₂ ^-转化为NO、N₂O，最终还原成N₂的过程。传统上认为，硝化作用是好氧自养菌在有氧的环境下进行的，而反硝化作用是异养微生物在缺氧或厌氧的环境中进行的。传统的生物脱氮技术因硝化作用和反硝化作用对氧的需求不同，通常需要多种微生物参与，即需要硝化菌和反硝化的协同处理，处理过程繁琐，且在低温条件下(25℃以下)除氮效果较差。若能筛选得到具有硝化反硝化双重作用的单一菌株，实现脱氮的同步硝化与反硝化，则能够大大缩减脱氮程序，且不会造成环境的二次污染。

目前污水处理厂的活性污泥面临着在低温条件下各种有机物降解效率低、出水质量难达标等问题，因此利用深海微生物的适冷特性，分离、筛选出在低温下能够高效降解有机污染物的极端环境(深海和极地)微生物并应用于环境工程有着广阔的前景。

印度洋水团复杂，印度洋赤道水、南印度洋水、印尼贯穿流上层水和中层水、南极中层水和南极底层水均汇集于此，不同来源、不同性质的海水及其对应的水体输运也将对该海域生物多样性产生重要影响。由于该区域复杂多样的环境特征孕育了高度多样性的微生物种群，菌种资源更为丰富，其中不乏嗜低温、嗜压和嗜盐等环境抗逆型微生物；某些微生物与海岭底栖生物共附生，也进化出了高级的化学防御功能，很多具有拮抗、抗氧化等特殊的活性；这些微生物及其功能基因资源往往可以应用于生物农药开发、生物医药前体筛选以及功能食品开发等领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有硝化和反硝化作用的菌株，实现水体脱氮的同步硝化与反硝化。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌DY-S025GC05，拉丁文为Halomonas sp.，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年5月19日，保藏编号为：CGMCC No.19847。

优选的，所述的具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌DY-S025GC05的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述盐单胞菌DY-S025GC05通过调节氧气含量来实现硝化和反硝化作用的转换。

本发明还提供了所述具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌DY-S025GC05用于去除氮污染的应用。

优选的，所述氮污染为水体中的氮污染。

优选的，所述氮污染为氨态氮污染和/或硝态氮污染。

本发明提供的盐单胞菌DY-S025GC05同时具有硝化和反硝化的双重活性，通过调节氧含量即可实现硝化和反硝化功能的转换，而且该菌在15℃的低温下具有较高的脱氮活性，因此在污水有机污染物中氮素的去除领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为菌株在反硝化培养基中对NO₃ ^--N的脱氮效果；

图2为菌株在反硝化培养基中对NO₂ ^--N的脱氮效果；

图3为菌株在硝化培养基中的NH₄ ⁺-N去除效果；

图4为菌株在硝化培养基中的NO₃ ^--N的累计情况；

图5为菌株在硝化培养基中的NO₂ ^--N的累计情况；

图6为菌株对NH₄ ⁺-N的去除效率；

图7为菌株对NO₃ ^--N的去除效率；

图8为菌株对NO₂ ^--N的去除效率。

保藏说明

盐单胞菌DY-S025GC05，拉丁文为Halomonas sp.，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年5月19日，保藏编号为：CGMCC No.19847。

具体实施方式

本发明提供了一种盐单胞菌DY-S025GC05同时具有硝化和反硝化的双重活性。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

在本发明中，陈海水是指：将新鲜海水装入玻璃盛器中，于暗处贮放数星期后的海水。但贮放的新鲜海水须是从不被陆源污染物污染或很少混有淡水的清洁海区采取。贮放采用玻璃盛器，而不用金属盛器，这是因为有些金属能使海水变得具有杀菌力；贮放在暗处则是避免在光合作用下生物生长。经过贮放后的陈海水有机物含量减少(因异养微生物分解所致，由原来的4～5克/升，减少至0.4～0.5克/升)，所含的杀菌成分亦随时间而逐渐减少，但仍含有有利于微生物生长的物质。所以，用陈海水制备的海洋微生物培养基，往往能取得良好的培养和分离效果。

实施例1

菌株DY-S025GC05的获得

反硝化筛选培养基(g/L)配方：KNO₃ 0.61g/L，乙酸钠2g/L，MgSO₄·7H₂O0.05g/L，K₂HPO₄ 0.2g/L，MnSO₄·4H₂O 0.01g/L，FeSO₄ 0.01g/L，过滤陈海水:超纯水(v/v，2:1)定容至1000ml。并经过121℃下高压湿热灭菌20min，备用。

微生物样品采自于印度洋九十度海岭3000米以下的沉积物，取约1g沉积物样品接种到50mL反硝化筛选培养基中，在15℃，150r/min的摇床中振荡培养7d，再分别从反硝化筛选培养基的培养液中取500μL转接新配制的反硝化筛选培养基中，相同的条件下培养7d，按此步骤重复两次，进行反硝化细菌的富集。取最后一次富集得到的培养液，根据生长情况，进行适当的稀释后，取100μL培养液均匀涂布于固体反硝化培养基(即为1000ml反硝化筛选培养基中加入20g琼脂)上，待菌液完全渗入培养基中后，倒置于15℃培养箱中，培养14d。根据菌落的生长形态，挑取不同的单菌落在固体反硝化平板培养基上划线，直至分离出单菌落为止。并进行16S rDNA种属鉴定，DY-S025GC05最终被鉴定为盐单胞菌Halomonas sp.。

实施例2

有氧条件下盐单胞菌DY-S025GC05的反硝化除氮作用

反硝化筛选培养基(g/L)：KNO₃ 0.61g/L，乙酸钠2g/L，MgSO₄·7H₂O0.05g/L，K₂HPO₄0.2g/L，MnSO₄·4H₂O 0.01g/L，FeSO₄ 0.01g/L，过滤陈海水:超纯水(v/v，2:1)定容至1000ml。并经过121℃下高压湿热灭菌20min，备用。

将盐单胞菌DY-S025GC05接种于反硝化筛选培养基中，于15℃摇床150rpm振荡培养，每24h检测NO₃ ^--N和NO₂ ^--N浓度的变化，结果如图1～2所示。结果显示，培养时间为24h时，盐单胞菌DY-S025GC05脱氮能力最强，NO₃ ^--N的浓度从40mg/L降到了15mg/L，去除率为62.5％；盐单胞菌DY-S025GC05在48h对NO₃ ^--N的去除率可达90％以上；在72h可完成对NO₃ ^--N的完全去除(图1)。DY-S025GC05在24h对NO₂ ^--N的积累均达到最大值，约为15，接着迅速的减少，72h已完全去除(图2)。说明盐单胞菌DY-S025GC05在低温(15℃)有氧条件下具有反硝化除氮的作用。

实施例3

厌氧条件下盐单胞菌DY-S025GC05的硝化除氮作用

硝化培养基(g/L)：NH₄Cl 0.19g/L，乙酸钠5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.125g/L，MnSO₄·4H₂O 0.01g/L，FeSO₄ 0.01g/L，过滤陈海水:超纯水(v/v，2:1)定容至1000ml。并经过121℃下高压湿热灭菌20min，备用。

将盐单胞菌DY-S025GC05接种于硝化培养基中，充氮并密封培养(15℃，150rpm)，每24h检测NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N浓度的变化，结果如图3～5所示。结果表明，盐单胞菌DY-S025GC05在厌氧条件下，在96h对NH₄ ⁺-N的去除率达83.3％(图3)，在0～96h时，培养液中积累了一定的NO₃ ^--N(图4)和NO₂ ^--N(图5)，说明盐单胞菌DY-S025GC05进行硝化反应时生成了硝态氮和亚硝态氮，进一步说明盐单胞菌DY-S025GC05在低温(15℃)厌氧条件下具有硝化除氮的作用。

实施例4

通过控制氧含量进行脱氮试验

混合培养基(g/L)：NH₄Cl 0.19g/L，KNO₃ 0.36g/L，乙酸钠11g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.125g/L，MnSO₄·4H₂O 0.01g/L，FeSO₄ 0.01g/L，过滤陈海水：超纯水(v/v，2:1)定容至1000ml。并经过121℃下高压湿热灭菌20min，备用。

将菌株DY-S025GC05接种于混合培养基中，充入氮气15℃下密封培养96h，然后充入氧气继续培养72h，每隔24h取样测定各种氮含量。由图6～8可见，在厌氧条件下，DY-S025GC05可在96h内将NH₄ ⁺-N的浓度从60mg/L降为14mg/L，去除率均达到76.7％(图6)；而培养基中NO₃ ^--N的含量由0～96h呈现增加趋势，而96h后NO₃ ^--N的含量迅速降解(图7)；NO₂ ^--N的生成与积累与NO₃ ^--N相似，其浓度呈现出先增加后减少的趋势(图8)。该结果表明DY-S025GC05既具有硝化活性，同时也具有反硝化活性，而且可以在低温下通过控制氧气含量来实现硝化和反硝化功能的转化，从而实现有机污染物中氮的高效去除。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 自然资源部第一海洋研究所中国大洋矿产资源研究开发协会(中国大洋事务管理局）

<120> 一种具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1438

<212> DNA

<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)

<400> 1

gggcatgcgg cagctacaca tgcaagtcga gcggtaacag atccagcttg ctggatgctg 60

acgagcggcg gacgggtgag taatgcatag gaatctgccc gatagtgggg gataacctgg 120

ggaaacccag gctaataccg catacgtcct acgggagaaa gggggctccg gctcccgcta 180

tgggatgagc ctatgtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggccacgat 240

ccgtagctgg tctgagagga tgatcagcca catcgggact gagacacggc ccgaactcct 300

acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggggaaa ccctgatcca gccatgccgc 360

gtgtgtgaag aaggccctcg ggttgtaaag cactttcagc gaggaagaac gcctagcggt 420

taatacccgc taggaaagac atcactcgca gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca 480

gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta 540

ggtggcttga taagccggtt gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaacgg catccggaac 600

tgtcaagcta gagtgcagga gaggaaggta gaattcccgg tgtagcggtg aaatgcgtag 660

agatcgggag gaataccagt ggcgaaggcg gccttctgga ctgacactga cactgaggtg 720

cgaaagcgtg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc 780

gaccagccgt tgggtgccta gcgcactttg tggcgaagtt aacgcgataa gtcgaccgcc 840

tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt 900

ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctactcttg acatcctgcg 960

aatttggtag agatacctta gtgccttcgg gaacgcagag acaggtgctg catggctgtc 1020

gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta 1080

tttgccagcg cgtaatggcg ggaactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1140

tggggacgac gtcaagtcat catggccctt acgagtaggg ctacacacgt gctacaatgg 1200

tcggtacaaa gggttgccaa ctcgcgagag tgagccaatc ccgaaaagcc gatctcagtc 1260

cggatcggag tctgcaactc gactccgtga agtcggaatc gctagtaatc gtggatcaga 1320

atgccacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg 1380

actgcaccag aagtggttag cctaacgcaa gagggcgatc actcgccggt ggtttaac 1438

Claims

1.一种具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌DY-S025GC05，拉丁文为Halomonas sp.，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年5月19日，保藏编号为：CGMCCNo.19847。

2.权利要求1所述的具有硝化和反硝化作用的盐单胞菌DY-S025GC05用于去除氮污染的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氮污染为水体中的氮污染。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述氮污染为氨态氮污染和/或硝态氮污染。