CN110129224A - 一种耐盐反硝化菌及其菌剂的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐盐反硝化菌及其菌剂的制备方法与应用，属于环境微生物领域，该菌命名为盐单胞菌(Halomonas stevensii)，属于厌氧反硝化菌菌株，保藏编号为CGMCC No.15311。所述盐单胞菌具有较高的耐盐脱氮特性，脱氮率达98％以上，在氯化钠盐分小于10％条件下均可将水体中高浓度硝酸盐氮‑

Description

一种耐盐反硝化菌及其菌剂的制备方法与应用
技术领域：
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种耐盐反硝化菌及其菌剂制备方法与应用。
背景技术：
随着工农业生产的发展和人们生活水平的提高，我国含氮污染物的排放量迅速增加，含氮污染物是水体富营养化的主要来源之一。据粗略统计，我国约有3000万人饮用高硝酸盐水，硝酸盐污染已成为我国癌症发生的主要环境因素之一。硝酸盐被摄入人和动物体内后，部分会被还原成亚硝酸盐。亚硝酸根可将血液中的血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，后者不具备结合氧的能力，当血液中高铁血红蛋白含量增加时，血液输送氧的能力下降，严重者导致人体组织紫疮，临床上称高铁血蛋白症。目前全国城镇污水处理已普遍采用三级处理，脱氮除磷效果较好，并且绝大多数污水厂出水可达到一级A排放标准，已经有效地遏制了水质污染持续恶化的势头。
但是，工业活动产生的高浓度硝酸盐废液，具有水质成分复杂、含有机污染物、盐分高、生物毒性强等特点，增加了废液脱氮的难度。部分工业活动如化肥制造、火药制造、金属表面酸洗处理、电镀及线路印刷版蚀刻等工业排放的废液中含有高浓度的硝酸盐和亚硝酸盐。如硝酸钾生产厂排放的废液中硝酸盐含量达到2640mg/L，含亚硝酸盐640mg/L。如电镀行业在进行挂具退镀时产生废液中含有的硝酸盐浓度高达100,000mg/L。
对于废液脱氮，生物法反硝化脱氮将硝态氮转化为氮气是最经济彻底的治理技术。但是工业生产排放的高盐度废液会导致常规生物处理系统中微生物的生物膜渗透压偏高，微生物细胞膜破裂；微生物酶活性受抑制；污泥沉降效果变差等。所以，在高盐条件下常规的生物脱氮工艺不能有效进行反硝化脱氮，而对于高浓度硝酸盐废液处理目前工业上常采用离子交换、蒸发结晶、反渗透和催化还原等工艺，但这些方法存在污染转移和二次污染等问题，不能实现污染物的最终处置。因此，筛选耐盐的高效菌种是解决高盐条件下高浓度硝酸盐反硝化脱氮的有效途径之一。
发明内容：
为了解决现有技术中高浓度硝酸盐废液处理不彻底、存在二次污染的问题以及常规反硝化工艺耐盐效果差的问题，本发明提供一种高效、耐受高盐具有高浓度硝酸盐降解的反硝化菌及其用途。
一种耐盐反硝化菌，具体为盐单胞菌(Halomonas stevensii)，保藏编号为CGMCCNo.15311。
所述盐单胞菌的16S rDNA序列见序列表SEQ ID No.1。
所述盐单胞菌，已于2018年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15311，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
所述盐单胞菌从取自某工业废液厌氧池污泥经过长达400天的驯化后分离筛选得到，在400天的驯化过程中逐步提高厌氧污泥底物的盐分和硝酸盐浓度。
所述盐单胞菌的特征为：革兰氏阴性，菌落颜色淡黄色，菌落呈为单个凸起菌落，表面有褶皱，边缘不规则；投射电镜下观察该菌体的形态为杆状，直或弯曲成弧状。
本发明所提供的盐单胞菌能够在高盐条件下，以有机物为电子供体，NO- 3为电子受体，将其还原为氮气。使用该菌株处理废液工艺简单，脱氮彻底，效果稳定，节约运行成本。在实际应用中，可将菌株置于高盐高硝酸盐废液中实现反硝化脱氮的目的。
优选地，所述盐单胞菌的适宜培养温度为20℃-40℃，pH值为6.6-8.0。
所述盐单胞菌在废液中的耐受氯化钠盐浓度为1-10％，耐受的硝酸根离子浓度为1000-60000mg/L。
本发明的另一目的是提供上述耐盐反硝化菌的菌剂，所述菌剂具体为菌体干粉或菌活力为103-104cfu/L的菌悬液。
本发明的另一目的是提供上述耐盐反硝化菌菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)发酵培养：将所述盐单胞菌经活化后按3％-10％接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度20℃-40℃，溶解氧<0.2mg/L,罐压0.03-0.10Mpa，30-55rpm震荡培养时间72-96h，得到发酵液；所述发酵培养基的组成为：蛋白胨6g/L-12g/L，酵母膏3g/L-6g/L，氯化钠30-50g/L，余量为蒸馏水，pH值7.5，121℃灭菌20min，灭菌后冷却至室温。
(2)将所述步骤(1)得到的发酵液经离心、冻干得到菌体干粉或经离心、稀释菌体得到菌悬液。
优选地，所述步骤(1)中，所述盐单胞菌的活化步骤为：将所述盐单胞菌接种于种子培养基中，控制培养温度30℃-40℃，30-55rpm震荡培养48-72h。
更优选地，所述种子培养基组成为：KNO3 2g/L-4g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L-0.4g/L、K2HPO4 0.5g/L-0.8g/L、酒石酸钾钠20g/L-30g/L、氯化钠30-50g/L，余量为水，pH值7.2，121℃灭菌20min。
优选地，所述步骤(2)中，所述离心条件为：4-10℃条件下，6000-7500rpm，离心10-15min。
优选地，所述步骤(2)中，菌悬液具体为将发酵得到的菌体沉淀，经所述发酵培养基稀释或经与发酵培养基等氯化钠离子强度的盐水稀释获得菌悬液。
所述等氯化钠离子强度稀释具体为将所述菌体沉淀利用氯化钠浓度为30-50g/L盐水稀释获得菌悬液。
更优选地，所述步骤(2)中，菌悬液具体为将发酵得到的菌体沉淀，经所述发酵培养基稀释获得菌悬液。
本发明的另一目的是提供上述耐盐反硝化菌在废液反硝化脱氮处理中的用途。
优选地，所述废液具体为高含盐废液。
优选地，所述废液中氯化钠盐浓度为1-10％，耐受的硝酸根离子(NO- 3)浓度为1000-60000mg/L。
优选地，所述所述废液中，为(0.7-2.5)：1。
更优选地，所述废液中，为(1-2.5)：1。
优选地，所述废液处理温度为20-40℃，pH为4.5-8.0。
更优选地，所述废液处理温度为25-35℃，pH为6.5-7.5。
优选地，所述盐单胞菌在废液反硝化脱氮处理中用途的方法如下：
将所述盐单胞菌经发酵后稀释成为菌活力为103-104cfu/L的菌悬液，将所述菌悬液按照与污泥体积比5-15:100混合作为接种物投加到废液中；所述废液的水力停留时间为20-36h。
其中，菌体干粉的稀释方法与菌悬液的制备方法相同，即利用发酵培养基或用含有氯化钠浓度为30-50g/L盐水稀释菌体干粉，获得菌活力为103-104cfu/L的菌悬液。
更优选地，所述盐单胞菌在废液反硝化脱氮处理中用途具体步骤如下：
将所述盐单胞菌经发酵后稀释成为菌活力为103-104cfu/L的菌悬液，将所述菌悬液按照与活性污泥按照体积比5-15:100混合投加进废液反应器内，进行混合反应，所述混合反应时间为10-16小时，向废液反应器内注入废液，所述废液的水力停留时间为20-36h。所得脱氮率达98％以上。
更优选地，所述盐单胞菌在废液反硝化脱氮处理中用途具体方法为：
所述废液采用两阶段厌氧处理方法，首先利用厌氧酸化菌群对所述废液进行酸化处理，快速将难降解的有机物进行开环断链将有机物转化为可生化性较好的VFA，控制厌氧酸化反应时间4-8h、内循环比100-300％，反应完成后，将经处理的废液与硝酸盐废液混合，经调节水质后，排入包含有盐单胞菌菌体和污泥混合物的废液反应器内进行厌氧反硝化阶段，盐单胞菌以硝态氮为电子受体，以厌氧酸化生成的VFA作电子供体，进行厌氧反硝化反应处理污水，控制内循环比100-300％。所得脱氮率达98％以上，所述盐单胞菌菌体和污泥混合物是按照上述制备方法混合反应10-16小时获得的。
所述内循环比为回流废液流量与进水废液流量比。
需要说明的是，上述所述的污泥为普通废水生化处理系统所得的常规剩余污泥。
有益效果：
本发明的盐单胞菌及其应用与现有技术相比较有如下优势：
(1)显著的菌种特性：本发明的盐单胞菌对高盐的耐受力强，能够在高盐条件下实现反硝化脱氮，解决高盐对常规生物处理的限制，使得高浓度硝酸盐废液有一种经济、高效稳定和彻底的处理方法。
盐单胞菌具有较高的耐盐脱氮特性，脱氮率达98％以上，在盐分小于等于10％条件下均可将水体中高浓度硝酸盐氮(NO- 3≤60000mg/L)还原为无害的氮气且无亚硝酸盐积累，应用在反硝化脱氮反应器中脱氮高效稳定、无二次污染，能够缩短启动期。
(2)本发明可以完成碳氮的同步去除，对于高浓度的有机废液去除硝酸盐采用本发明具有较好经济效益和环保效益。
(3)菌种对于氮、碳源的利用特点：
本发明菌种能够利用多种碳源，具有很好的适应性。
本发明中，盐单胞菌可以有效利用废液中的硝酸盐作为氮源，高效分解。
本发明的盐单胞菌可有效利用经厌氧酸化菌群发酵酸化后所产的发酵产物VFA(挥发性脂肪酸)等作为电子供体进行反硝化反应，达到脱氮及去除有机废液废液有机碳的作用。
(4)采用本发明所述培养基通过发酵培养制备得到的菌剂投加至厌氧反硝化反应器，可加快处理高盐硝酸盐废液的驯化启动效率。
(5)菌株反硝化脱氮原理：本发明所提供的盐单胞菌能够在高盐条件下，以有机物为电子供体，为电子受体，将其还原为氮气。使用该菌株处理废液工艺简单，脱氮彻底，效果稳定，节约运行成本。在实际应用中，可将菌株置于高盐高硝酸盐废液中实现反硝化脱氮的目的。
(6)反硝化参数设置：①本发明中BOD/NO- 3比例设置有效地保证了菌剂完全反硝化所需有机物电子供体，有效控制BOD/NO3 ->0.6，防止脱氮效率降低。
②本发明中温度和pH参数控制可有效保证菌株代谢反应的正常进行以及保持显著的微生物活性，当超出此范围，功能微生物活性就会抑制，处理效果会恶化。
③本发明优选方案将菌剂混合污泥加入到废水中，纯菌附着污泥生长，一方面有利于避免纯菌从反应器流失，另一方面启动成功反应器里面纯菌成为优势菌，污泥里的其他微生物种群结构受到演化与纯菌形成协同代谢共生关系，强化了功能微生物的代谢速率。
④本发明中菌剂与活性污泥混合时间的控制，有效保证了菌种在污泥上的有效附着生长；此外，本发明中水力停留时间对于反硝化脱氮率的效果具有显著的提高作用。
附图说明：
图1盐单胞菌系统发育树；
图2盐单胞菌的透射电镜照片。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：本发明菌株的分离鉴定：
(1)富集、分离培养基和扩培培养基：
富集培养基：硝酸钾2g、七水硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾1.76g、酒石酸钾钠20g、7水硫酸亚铁0.005g，氯化钙0.02g，氯化铵0.63g、NaCl 5％、蒸馏水1000mL，pH值7.5。
分离培养基：硝酸钾2g、七水硫酸镁0.2g、磷酸氢二钾0.5g、酒石酸钾钠20g、NaCl5％、蒸馏水1000mL，pH值7.0-7.2，固体培养基另加琼脂1.5％和1mL溴麝香百里酚蓝溶液。
发酵培养基：蛋白胨8g、酵母膏4g、氯化钠10g、蒸馏水1000mL pH值7.5。
(2)盐单胞菌菌株的分离、纯化：
称取5g经过驯化的反硝化污泥置于250mL厌氧瓶中，加100mL灭菌富集培养基并氮吹排氧后密封，置于30℃恒温培养箱培养4天，然后取2ml混合菌液在无氧手套箱内接种至选择培养基，如此反复操作3次。之后从选择培养基吸取1mL菌悬液至9mL稀释液(无菌无氧水)，得到10-2稀释度悬液，依次按10倍稀释法稀释至10-7，由此制得各稀释度菌悬液。
在无氧手套箱内分别吸取各稀释度悬液0.1mL至反硝化细菌分离固体培养基上均匀涂布。之后将平板倒置，放入30℃恒温培养箱，培养至长出明显菌落。然后挑取单菌株，在平板上多次划线纯化本发明中的盐单胞菌。
(3)16S rRNA的PCR扩增与测序：
采用全自动磁珠核酸提取仪Smart LabAssist-16和MO-BIO PowerSoil DNA提取试剂盒(台湾圆点奈米技术股份有限公司)提取及纯化所获得盐单胞菌的DNA。取5μL DNA样品在120V，20-25min条件下进行电泳检测，在凝胶电泳仪下进行观察质检。
选用细菌通用引物F16S-27(5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`)和R16S-1492(5`-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3`)进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，循环30个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保存。
依次经过PCR产物纯化和质检和纯化产物，回收后的PCR扩增产物委托北京奥维森基因科技有限公司进行测序。
测序后得到菌株的16S rDNA长度为1430bp的序列，提交到Genbank与其他菌株进行比对，利用系统学分析(MEGA3.1)软件邻位连接(Neighbour Joining)法构建系统发育树(参照附图1)发现菌株与Halomonas sp.的进化距离最为接近，确定其属于盐单胞菌属，命名为盐单胞菌，参照图2盐单胞菌的透射电镜照片。
(4)菌株的脱氮测试
将100mL已灭菌的硝酸盐浓度为2000mg/L，盐分为3％的富集培养基装入250mL三角瓶中，按照10％的接种量接入种子菌液，静置培养。在25-35℃范围内，三天的时间内盐单胞菌能够总氮去除率达85％以上，总氮去除率最高达99％。本发明菌株在培养的前48h有亚硝酸盐积累现象，之后亚硝酸盐浓度逐渐降低，总氮将降至20mg/L以下。
实施例2：盐单胞菌菌剂的制备
将所述盐单胞菌经活化培养后，将盐单胞菌种子液按5％接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度35℃，溶解氧<0.2mg/L,罐压0.03-0.10Mpa，40rpm震荡培养时间75h，得到发酵液，经4℃条件下，7500rpm，离心10min，弃去上清液，得到菌体沉淀，将所述菌体沉淀用发酵培养基稀释，获得菌活力为103-104cfu/L的菌悬液，进行灌装，最终得到盐单胞菌菌剂。
所述发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L，酵母膏4g/L，氯化钠35g/L，余量为蒸馏水，pH值7.5，121℃灭菌20min，灭菌后冷却至室温。
实施例3：盐单胞菌菌剂的制备
将耐盐反硝化菌接种于种子培养基中，控制培养温度35℃，35rpm震荡培养48h，得到种子发酵液。
将盐单胞菌种子发酵液按10％接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度35℃，溶解氧<0.2mg/L,罐压0.03-0.10Mpa，40rpm震荡培养时间72h。
将所述盐单胞菌通过发酵培养后，4℃条件下，7500rpm，离心10min，弃去上清液，得到菌体沉淀，将所述菌体沉淀用发酵培养基稀释，获得菌活力为103cfu/L的菌悬液，进行灌装，最终得到盐单胞菌菌剂。
所述种子培养基组成为：KNO3 2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、K2HPO4 0.6g/L、酒石酸钾钠20g/L、氯化钠30g/L，余量为水，pH值7.2，121℃灭菌20min，
所述发酵培养基的组成为：蛋白胨8g/L，酵母膏4g/L，氯化钠30g/L，余量为蒸馏水，pH值7.5，121℃灭菌20min，灭菌后冷却至室温。
实施例4：盐单胞菌菌剂的制备
将耐盐反硝化菌接种于种子培养基中，控制培养温度30℃，30rpm震荡培养48h，得到种子发酵液。
将盐单胞菌种子发酵液按3％-10％接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度20℃℃，溶解氧<0.2mg/L,罐压0.03Mpa，30rpm震荡培养时间72h。
将所述盐单胞菌通过发酵培养后，8℃条件下，6000rpm，离心10min，弃去上清液，得到菌体沉淀，将所述菌体沉淀用发酵培养基稀释，获得菌活力约为104cfu/L的菌悬液，进行灌装，最终得到盐单胞菌菌剂。
所述种子培养基组成为：KNO3 2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、K2HPO4 0.5g/L、酒石酸钾钠20g/L、氯化钠35g/L，余量为水，pH值7.2，121℃灭菌20min，
所述发酵培养基的组成为：蛋白胨6g/L，酵母膏3g/L，氯化钠50g/L，余量为蒸馏水，pH值7.5，121℃灭菌20min，灭菌后冷却至室温。
实施例5：盐单胞菌菌剂的制备
将耐盐反硝化菌接种于种子培养基中，控制培养温度40℃，55rpm震荡培养72h，得到种子发酵液。
将盐单胞菌种子发酵液按10％接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度40℃，溶解氧<0.2mg/L,罐压0.10Mpa，55rpm震荡培养时间96h。
将所述盐单胞菌通过发酵培养后，5℃条件下，7500rpm，离心15min，弃去上清液，得到菌体沉淀，将所述菌体沉淀用发酵培养基稀释，获得菌活力约为8×103cfu/L的菌悬液，进行灌装，最终得到盐单胞菌菌剂。
所述种子培养基组成为：KNO3 4g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、K2HPO4 0.8g/L、酒石酸钾钠30g/L、氯化钠50g/L，余量为水，pH值7.2，121℃灭菌20min，
所述发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L，酵母膏6g/L，氯化钠45g/L，余量为蒸馏水，pH值7.5，121℃灭菌20min，灭菌后冷却至室温。
实施例6：盐单胞菌菌剂的制备
将耐盐反硝化菌接种于种子培养基中，控制培养温度36℃，45rpm震荡培养55h，得到种子发酵液。
将盐单胞菌种子发酵液按6％接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度25℃，溶解氧<0.2mg/L,罐压0.05Mpa，35rpm震荡培养时间80h。
将所述盐单胞菌通过发酵培养后，4℃条件下，7000rpm，离心12min，弃去上清液，得到菌体沉淀，将所述菌体沉淀用氯化钠浓度为40g/L的盐水稀释，获得菌活力为103cfu/L的菌悬液，进行灌装，最终得到盐单胞菌菌剂。
所述种子培养基组成为：KNO3 2.5g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、K2HPO4 0.6g/L、酒石酸钾钠26g/L、氯化钠40g/L，余量为水，pH值7.2，121℃灭菌20min，
所述发酵培养基的组成为：蛋白胨8g/L，酵母膏4g/L，氯化钠50g/L，余量为蒸馏水，pH值7.5，121℃灭菌20min，灭菌后冷却至室温。
实施例7：盐单胞菌菌剂的制备
按照实施例6的菌种培养方法发酵培养盐单胞菌，得到盐单胞菌发酵液，经过4℃，转速为7000rpm，离心时间为12min，弃去上清液，得到菌体沉淀，经冻干获得菌剂干粉。
实施例8盐单胞菌用于高盐高硝酸盐废液的处理
将本发明实施例3制备得到的菌剂产品，按与常规反硝化反应器内污泥体积量比1：10的比例混合投加进废液反应器内，停止进废液，避免菌剂流失，保证菌剂在反应器内停留时间为14小时，然后进废液，控制反应器进废液水反应温度控制在20-40℃，pH为6.5-7.5，等步幅逐步提高进水盐分和硝酸根浓度，最终进水中，氯化钠盐分浓度由1％提高至8％，硝酸根浓度由500mg/L提高至30000mg/L，废液的水力停留时间为22小时，无积累，经处理后，出水中，废液中硝酸盐氮降低至5mg/L，出水的NO- 3浓度保持在20mg/L以下。
实施例9盐单胞菌用于高盐高硝酸盐废液的处理
将本发明实施例4制备得到的菌剂产品，按与常规反硝化反应器内污泥体积量比1：10的比例混合投加进废液反应器内，停止进废液，避免菌剂流失，保证菌剂在反应器内停留时间为16小时，然后进废液，控制反应器进废液水反应温度控制在20-30℃，pH为4.5-5.5，等步幅逐步提高进水氯化钠盐分和硝酸根浓度，最终进水中，氯化钠盐分浓度由1％提高至10％，硝酸根离子浓度由1000mg/L提高至60000mg/L，水力停留时间为24小时，无积累，经处理后，废液中硝酸盐氮降低至50mg/L以下，出水的浓度保持在200mg/L以下。
实施例10盐单胞菌用于高盐高硝酸盐废液的处理
将本发明实施例5制备得到的菌剂产品，按与常规反硝化反应器内污泥体积量比15：100的比例混合投加进废液反应器内，停止进废液，避免菌剂流失，保证菌剂在反应器内停留时间为10小时，然后进废液，控制反应器进废液水反应温度控制在30-40℃，pH为5.5-6.5，等步幅逐步提高进水氯化钠盐分和硝酸根浓度，最终进水中，盐分浓度由1％提高至10％，硝酸根离子浓度由3000mg/L提高至60000mg/L，水力停留时间为36小时，无积累。经处理后，出水中，废液中硝酸盐氮降低至50mg/L以下，出水的浓度保持在200mg/L以下。
实施例11盐单胞菌用于高盐高硝酸盐废液的处理
将本发明实施例6制备得到的菌剂产品，按与常规反硝化反应器内污泥体积量比1：20的比例混合投加进废液反应器内，停止进废液，避免菌剂流失，保证菌剂在反应器内停留时间为16小时，然后进废液，控制反应器进废液水反应温度控制在30-35℃，pH为7.5-8.0，等步幅逐步提高进水氯化钠盐分和硝酸根浓度，最终进水中，氯化钠盐分浓度由1.5％提高至10％，硝酸根终离子浓度由2000mg/L提高至60000mg/L，水力停留时间为36小时，无积累。经处理后，出水中，废液中硝酸盐氮降低至50mg/L以下，出水的浓度保持在200mg/L以下。
实施例12盐单胞菌用于高盐高硝酸盐废液的处理
将本发明实施例7制备的菌剂干粉用无菌发酵培养基稀释至菌活力为104cfu/L的菌悬液，将菌体稀释液与污泥体积比14:100，混合投加进反应器内，停止进水避免菌剂流失，保证菌剂在反应器内停留时间为10小时，然后进废液，控制反应器进废液水反应温度控制在30-35℃，pH为7.5-8.0，等步幅逐步提高进水氯化钠盐分和硝酸根浓度，最终进水中，氯化钠盐分浓度由1.5％提高至10％，硝酸根离子浓度由1000mg/L提高至60000mg/L，水力停留时间为36小时，无积累。经处理后，出水中，废液中硝酸盐氮降低至50mg/L以下，出水的浓度保持在200mg/L以下。
实施例13盐单胞菌用于高盐高硝酸盐废液的处理
将盐单胞菌菌体用无菌发酵培养基稀释至菌活力约为104cfu/L的菌悬液，将菌体稀释液与污泥体积比1:10，混合投加进废液反应器内，停止进水避免菌剂流失，保证菌剂在反应器内停留时间为10小时。
所述废液采用两阶段厌氧处理方法，首先利用厌氧酸化菌群对所述废液进行酸化处理，快速将难降解的有机物进行开环断链将有机物转化为可生化性较好的VFA，控制厌氧酸化反应时间4-8h、内循环比100-300％，反应完成后，将经处理的废液与硝酸盐废液混合，经调节水质后，排入包含有上述盐单胞菌菌体和污泥混合物的废液反应器内进行厌氧反硝化阶段，控制反应器进废液水BOD/NO- 3、反应温度、pH进水盐分和硝酸根最浓度、废液的水力停留时间同实施例12。
盐单胞菌以硝态氮为电子受体，以厌氧酸化生成的VFA作电子供体，进行厌氧反硝化反应处理污水，控制内循环比100-300％。废液中硝酸盐氮降低至50mg/L以下，出水的浓度保持在200mg/L以下。
对比例1常规污泥对于高盐高硝酸盐废液的处理
按照实施例8的处理方法进行废液处理，向反应器终投加相同量的相同污泥，并按照实施8步骤进行操作，与实施例8的不同点在于：污泥不外接入菌剂，此外不同点还在于最终进水终，氯化钠盐分浓度由0.5％提高至3％，硝酸根离子浓度由500mg/L提高至6000mg/L，废液的水力停留时间同样为22小时，出水浓度为30mg/L，而积累明显，浓度为380mg/L，ORP升高至+150mv，导致处理效果持续恶化。依据该实验效果数据，已然不能通过常规污泥处理继续提高氯化钠盐分浓度以及硝酸根离子浓度的废液达到良好的脱氮效果。
序列表
<110> 中国科学院生态环境研究中心
<120> 一种耐盐反硝化细菌及其菌剂的制备方法与应用
<130> 1
<141> 2019-05-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1406
<212> DNA
<213> 盐单胞菌(Halomonas stevensiiCGMCC No.15311)
<400> 1
catgcaagtc gagcggtaac aggggnngct tgcancccgc tgacgagcgg cggacgggtg 60
agtaatgcat aggaatctgc ccgatagtgg gggataacct ggggaaaccc aggctaatac 120
cgcatacgtc ctacgggaga aagggggctc cggctcccgc tatcggatga gcctatgtcg 180
gattagctgg ttggtgaggt aaaggctcac caaggcgacg atccgtagct ggtctgagag 240
gatgatcagc cacatcggga ctgagacacg gcccgaactc ctacgggagg cagcagtggg 300
gaatattgga caatgggggg aaccctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggccct 360
cgggttgtaa agcactttca gtgaggaaga acgcctggtg gttaataccc atcaggaaag 420
acatcactca cagaagaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 480
gtgcgagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcgcg taggtggctt gataagccgg 540
ttgtgaaagc cccgggctca acctgggaac ggcatccgga actgtcaagc tagagtgcag 600
gagaggaagg tagaattccc ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatcggg aggaatacca 660
gtggcgaagg cggccttctg gactgacact gacactgagg tgcgaaagcg tgggtagcaa 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg tcgaccagcc gttgggtgcc 780
tagcgcactt tgtggcgaag ttaacgcgat aagtcgaccg cctggggagt acggccgcaa 840
ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 900
cgatgcaacg cgaagaacct tacctactct tgacatcctg cgaacttgtg agagatcact 960
tggtgccttc gggaacgcag agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa 1020
atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct tatttgccag cgcgtaaagg 1080
cgggaactct aaggagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc 1140
atcatggccc ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca aagggttgcc 1200
aactcgcgag agtgagccaa tcccgaaaag ccgatctcag tccggatcgg agtctgcaac 1260
tcgactccgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg gtgaatacgt 1320
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt ggactgcacc agaagtggtt 1380
agcctaacgc aagagggcga tcacca 1406

Claims (8)

1.一种耐盐反硝化菌，其特征在于：所述耐盐反硝化菌具体为盐单胞菌(Halomonasstevensii)，保藏编号为CGMCC No.15311。
2.含有权利要求1所述耐盐反硝化菌的菌剂，其特征在于：所述菌剂具体为菌体干粉或菌活力为103-104cfu/L的菌悬液。
3.权利要求2所述耐盐反硝化菌菌剂的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)发酵培养：将所述盐单胞菌经活化后按3％-10％接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度20℃-40℃，溶解氧<0.2mg/L,罐压0.03-0.10Mpa，30-55rpm震荡培养时间72-96h，得到发酵液；所述发酵培养基的组成为：蛋白胨6g/L-12g/L，酵母膏3g/L-6g/L，氯化钠30-50g/L，余量为蒸馏水，pH值7.5，121℃灭菌20min。
(2)将所述步骤(1)得到的发酵液经离心、冻干得到菌体干粉或经离心、稀释菌体得到菌悬液。
4.如权利要求3所述耐盐反硝化菌菌剂的制备方法，其特征在于：
所述盐单胞菌的活化步骤为：将所述盐单胞菌接种于种子培养基中，控制培养温度30℃-40℃，30-55rpm震荡培养48-72h。
5.如权利要求4所述耐盐反硝化菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述种子培养基组成为：KNO3 2g/L-4g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L-0.4g/L、K2HPO40.5g/L-0.8g/L、酒石酸钾钠20g/L-30g/L、氯化钠30-50g/L，余量为水，pH值7.2，121℃灭菌20min。
6.权利要求1所述耐盐反硝化菌在废液反硝化脱氮处理中的用途。
7.如权利要求6所述耐盐反硝化菌在废液反硝化脱氮处理中的用途，其特征在于：所述废液中氯化钠盐浓度为1-10％，硝酸根离子浓度为1000-60000mg/L；为(0.7-2.5)：1；所述废液处理温度为20-40℃，pH为4.5-8.0。
8.如权利要求7所述耐盐反硝化菌在废液反硝化脱氮处理中的用途，其特征在于：将所述耐盐反硝化菌经发酵后稀释成为菌活力为103-104cfu/L的菌悬液，将所述菌悬液按照与污泥体积比5-15:100混合作为接种物投加到废液中；所述废液的水力停留时间为20-36h。
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