JP2005034783A - 微生物を利用してｎｈ４＋とｎｏ３−とを同時除去する硝化・脱窒方法 - Google Patents

Abstract

【課題】NH₄ ⁺とNO₃ ^-とを同時に除去する能力を有する微生物を見出し、排水処理などにおける窒素除去に利用すること。また、高温下においてもこのような硝化・脱窒能を有する耐熱性菌を得ること。
【解決手段】本発明者が今回土壌から分離したバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）T-7-2株（FERM P-19418）は、50℃のような高温下において生育環境中のNH₄ ⁺とNO₃ ^-とを同時に除去する能力を有し、また、30℃においてもNH₄ ⁺とNO₃ ^-とを同時に除去する耐熱性菌としての性質を有する。よって、このT-7-2株を排水処理などに利用する場合は、高温・低温両条件下、および温度変化の激しい条件下においても使用可能である。
【選択図】なし

Description

本発明は、微生物を利用して対象物中のアンモニウムイオン（ＮＨ₄ ⁺）と硝酸イオン（ＮＯ₃ ^-）とを同時に除去する硝化・脱窒方法、同方法に使用する硝化・脱窒処理剤、及び同方法に利用可能な新規微生物株に関するものである。

近年、産業の発展に伴い、環境汚染は地球規模へと拡大してきている。汚染物質は多種多様であり、その量も多量で汚染範囲も広がっている。環境浄化を物理的、化学的手法のみで行うことはエネルギーやコスト面から見ても有利とは言い難い。一方、生物、特に微生物は汚染物質を炭素源、窒素源、エネルギー源として分解・利用して生育することができるので、微生物を利用して環境浄化を行う方法がより効率的であると考えられる。微生物の分解能は生体反応を基盤としているので、物理的、化学的手法と比較して、温和な反応条件で汚染物質の処理を行うことが可能である。また、微生物を利用した環境浄化は、複雑な装置を必要とせず、副産物も少なく省エネルギーでできるので、物理的、化学的手法と比較してきわめて有利である。

現在、直面している環境問題の一つは工業排水、家庭排水、農地などから流入した窒素、リン、有機物の蓄積による河川、湖沼、内海の富栄養化である。近年、霞ケ浦、琵琶湖などの湖沼や東京港、伊勢湾などの内湾や瀬戸内海などでは、赤潮やアオコの発生など富栄養化による被害が多発している。富栄養化は窒素、リンなど、微生物の生育制限物質の濃度が上昇するため藻類などが繁殖し、光合成による有機物が蓄積され、水の色は緑色から褐色を呈する。また、微生物活動も旺盛になるため、有機物の分解速度が早く、溶存酸素の欠乏による魚介類の生育が阻害される。富栄養化を防止するためには、工業、生活排水などが湖沼などへ流入する前に処理し、窒素、リン、有機物などを除去することが必要である。特に窒素は、現在までに有効な除去法が確立されておらず、新しい窒素除去法の確立は緊急の課題となっている。

現在、排水処理施設で行われている窒素の除去法としては、イオン交換法、逆浸透膜を用いたろ過法、アンモニアストリッピング法などの物理化学的処理法と、微生物を利用した硝化・脱窒プロセスである生物学的処理法とがある（後記の非特許文献１・２参照）。物理化学的処理法においては、コスト、環境へ及ぼす影響、使用した樹脂の再生方法の未確立などの問題点が指摘されている。このため、微生物を用いた生物学的処理法が広く利用されている。

微生物を用いた硝化・脱窒法は硝化菌（アンモニア酸化細菌、亜硝酸酸化細菌）と脱窒菌の作用により、排水中のNH₄ ⁺やNO₂ ^-、NO₃ ^-をN₂として除去する方法である。この方法においては、硝化菌によりNH₄ ⁺はNO₂ ^-を経てNO₃ ^-に酸化され、生成したNO₃ ^-は脱窒菌によりN₂として大気中に還元される。硝化過程は一般に、好気条件で生育する化学合成独立栄養菌によってなされ、脱窒過程は嫌気条件で生育する脱窒菌によって行われる。したがって、現在行われている硝化・脱窒法では、少なくとも3種の微生物（硝化菌2、脱窒菌1）と2つの処理槽（好気槽、嫌気槽）が必要である。また、硝化菌は生育速度が非常に遅いため、処理に長時間要するなどの欠点が生じており、これらの問題を改善する新たな技術の開発が求められている。

最近、NH₄ ⁺をNO₂ ^-やNO₃ ^-に酸化する好気性の従属栄養菌の存在が報告された（後記の非特許文献３参照）。また、好気条件で脱窒作用を示す微生物も見出された（後記の非特許文献４参照）。これらの微生物を排水処理に応用することができれば1つの処理槽で硝化・脱窒を行うことが可能である。しかし、これらの微生物の硝化能や脱窒能は、従来の微生物に比べて劣り、また、高濃度の窒素化合物条件下では生育しないことなどが報告されている（後記の非特許文献５〜７参照）。

また、チューブ状のゲルを作製して硝化菌と脱窒菌を固定化し、チューブ内に好気的および嫌気的環境を作り出し、硝化・脱窒プロセスを1つの処理槽で行うことが試みられている（後記の非特許文献８・９参照）。しかし、生育の遅い硝化菌を用いているため、根本的な解決には至っていない。

中村和憲, 微生物の環境保存への理解. In"環境と微生物" 産業図書, 東京, pp. 61-69(1998). 若松盈, 汚染物への対策-処理と処分. In "環境講座 環境を考える", eds 大学等廃棄物処理施設協議会環境教育部会, 科学新聞社,東京, pp. 145-147(1999). Kuenen, J. G. and Robertson, L. A., Combined nitrification-denitrification processes. FEMS Microbiol. Rev., 15, 109-117 (1994). Robertson, L. A. and Kuenen, J. G., Aerobic denitrification: a controversy revived. Arch. Microbiol., 139, 351-354 (1984). Robertson, L. A. and Kuenen, J. G., Combined heterotrophic nitrification and aerobic denitrification in Thiosphaera pantotropha and other bacteria. Antonie van Leeuwenhoek., 57, 139-152 (1990). Yamada, T., Somiya, I., and Tsuno, H., Screening of aerobic denitrifying bacteria and their physiological characteristics. Gesuido Kyoukaishi., 30, 118-130 (1992). Till, B. A., Weathers, L. J., and Alvarez, P. J. J., Fe(0)-Sopported autotrophic denitrification. Environ. Sci. Technol., 32, 634-639 (1998). Uemoto, H. and Saiki, H., Nitrogen removal reactor using packed gel envelopes containing Nitrosomonas europaea and Paracoccus denitrificans. Biotechnol. Bioeng., 67, 80-86 (2000). Uemoto, H. and Saiki, H., Nitrogen removal by tubular gel containing Nitrosomonas europaea and Paracoccus denitrificans. Appl. Environ. Microbiol., 62, 4224-4228 (1996). Kim, Y., Yoshizawa, M., Takenaka, S., Murakami, S., and Aoki, K., Isolation and culture conditions of a Klebsiella pneumoniae strain that can utilize ammonium and nitrate ions simultaneously with controlled iron and molybdate ion concentrations. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 996-1001 (2002)

本発明は、上述した従来の問題点に鑑みなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は以下のとおりである。

１．上述のように、排水中に含まれるアンモニア（NH₄ ⁺）や硝酸（NO₃ ^-）などの窒素化合物は、湖沼や閉鎖性海域における富栄養化の主要な原因物質である。我が国では1985年より特定湖沼に対して、また、1993年より閉鎖性海域に対して排水中の窒素化合物の規制が行われているが、富栄養化の問題は解決されていない。このため、閉鎖性海域等に流入する排水中の窒素化合物、特にNH₄ ⁺とNO₃ ^-の効率的な除去技術の開発は緊急を要する課題になっている。

２．硝酸アンモニウム（硝安、NH₄NO₃）は、希土類酸化物の生産過程で副産物として生成する。生成したNH₄NO₃を含む工業排水は、一般にNH₄NO₃以外の物質を殆ど含まないが、微生物を活用したこのNH₄NO₃排水中の効率的な窒素除去法の開発も富栄養化対策として重要な課題の１つである。

３．従来の生物学的窒素除去法では、上述のように、少なくとも3種の微生物（硝化菌2、脱窒菌1）と2つの処理槽（好気槽、嫌気槽）を必要とする。NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去できる微生物を分離することができれば、処理槽１つで硝化・脱窒処理することができ、時間とコストの両面で有利である。

４．本発明者はこれらの課題に鑑み、以前に、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する微生物（Klebsiella pneumoniae F-5-2株）を土壌から分離し、その特性等について報告した（上記非特許文献１０参照）。本発明は、この研究をさらに進展させ、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する能力を有し、排水処理など産業上利用可能な他の微生物を見出すことをその課題とする。また、我が国において夏期はかなり高温になるため、高温条件下でも十分生育してNH₄ ⁺とNO₃ ^-を除去することができ、かつ、常温下でも同様の生物活性を示すいわゆる耐熱性菌が得られれば、その実用性は高いものになる。そこで本発明は、このような耐熱性菌の探索・分離をもその課題とする。

本発明者は、上記の課題に鑑み、各地から土壌を採取して、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する能力を有する微生物を探索した結果、50℃という高温下においてもNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去し得る耐熱性菌としての性質をもった新規微生物株（後述のT-7-2株）を分離・同定すると共に、バチルス属、シュードモナス属、エンテロバクター属等に分類される保存株の中からもNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する能力を有する菌株を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、産業上有用な発明として、以下のＡ）〜Ｍ）の発明を含むものである。

Ａ） 以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を用いて、対象物中のＮＨ₄ ⁺とＮＯ₃ ^-とを同時に除去する硝化・脱窒方法。
（ａ）バチルス属に属する菌株
（ｂ）シュードモナス属に属する菌株
（ｃ）エンテロバクター属に属する菌株
（ｄ）クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 3318株

Ｂ） 上記（ａ）の菌株として、以下の（ａ１）〜（ａ３）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を用いることを特徴とする、上記Ａ）記載の硝化・脱窒方法。
（ａ１）バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）T-7-2株（FERM P-19418）
（ａ２）バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）IFO 13719株
（ａ３）バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）IFO 3022株

Ｃ） 上記（ｂ）の菌株として、以下の（ｂ１）〜（ｂ６）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を用いることを特徴とする、上記Ａ）記載の硝化・脱窒方法。
（ｂ１）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 12689株
（ｂ２）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 13738株
（ｂ３）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 3080株
（ｂ４）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 13130株
（ｂ５）シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）IFO 15833株
（ｂ６）シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）IFO 13301株

Ｄ） 上記（ｃ）の菌株として、以下の（ｃ１）〜（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を用いることを特徴とする、上記Ａ）記載の硝化・脱窒方法。
（ｃ１）エンテロバクター・エアロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 13534株
（ｃ２）エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）IFO 13535株

Ｅ） 耐熱性の菌株を用いることを特徴とする、上記Ａ）記載の硝化・脱窒方法。

Ｆ） 排水処理などにおける水中の窒素除去、工場の排水処理その他無機物中の窒素除去、又は、糞尿その他有機物中の窒素除去に用いることを特徴とする、上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載の硝化・脱窒方法。

Ｇ） 以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を含有し、対象物中のＮＨ₄ ⁺とＮＯ₃ ^-とを同時に除去する硝化・脱窒処理剤。
（ａ）バチルス属に属する菌株
（ｂ）シュードモナス属に属する菌株
（ｃ）エンテロバクター属に属する菌株
（ｄ）クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 3318株

Ｈ） 上記（ａ）の菌株として、以下の（ａ１）〜（ａ３）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を含有することを特徴とする、上記Ｇ）記載の硝化・脱窒処理剤。
（ａ１）バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）T-7-2株（FERM P-19418）
（ａ２）バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）IFO 13719株
（ａ３）バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）IFO 3022株

Ｉ） 上記（ｂ）の菌株として、以下の（ｂ１）〜（ｂ６）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を含有することを特徴とする、上記Ｇ）記載の硝化・脱窒処理剤。
（ｂ１）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 12689株
（ｂ２）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 13738株
（ｂ３）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 3080株
（ｂ４）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 13130株
（ｂ５）シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）IFO 15833株
（ｂ６）シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）IFO 13301株

Ｊ） 上記（ｃ）の菌株として、以下の（ｃ１）〜（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を含有することを特徴とする、上記Ｇ）記載の硝化・脱窒処理剤。
（ｃ１）エンテロバクター・エアロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 13534株
（ｃ２）エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）IFO 13535株

Ｋ） 耐熱性の菌株を含有することを特徴とする、上記Ｇ）記載の硝化・脱窒処理剤。

Ｌ） 排水処理などにおける水中の窒素除去、工場の排水処理その他無機物中の窒素除去、又は、糞尿その他有機物中の窒素除去に用いることを特徴とする、上記Ｇ）〜Ｋ）の何れかに記載の硝化・脱窒処理剤。

Ｍ） バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）T-7-2株（FERM P-19418）。

本発明によれば、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去できる微生物を使用するため、処理槽一つで窒素化合物を処理できる。したがって、処理槽が二槽必要であった従来の方法に比べて、設備投資費用および運転費用ともコスト削減を図ることができ、処理時間を短縮でき、処理施設の規模も縮小することができる。また、耐熱性菌を使用した場合は、高温条件下での処理も可能になるので、処理可能条件が広がり、例えば気温変化の激しい屋外での窒素除去処理も可能になる。

以下、本発明の実施の一形態について説明する。
本発明者は、各地より採取した土壌の中からＮＨ₄ ⁺とＮＯ₃ ^-とを同時に除去する新規菌株を今回新たに分離し、その菌学的性質などについて詳細な検討を行った。その結果、この新規菌株はBacillus licheniformisに分類することが妥当と判断し、「バチルス・リケニフォルミスT-7-2株（Bacillus licheniformis strain T-7-2：以下、単にT-7-2株という。）」と命名した。このT-7-2株は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターにFERM P-19418として寄託されている。

上記T-7-2株は、50℃のような高温下においても、生育環境中のNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する能力を有し、またそれより低温の例えば30℃においてもNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する能力を有する（図２・図３参照。詳細は後述の実施例において説明する）。つまり、T-7-2株は、高温下においてのみ生育し、その生物活性を示すいわゆる高温菌とは異なり、高温・低温両条件下で生育する「耐熱性菌」であると考えられる。T-7-2株は、およそ25〜55℃（好ましくはおよそ30〜50℃）で生育し、かつNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去できるため、この菌株を排水処理などに利用する場合は、高温・低温両条件下、および温度変化の激しい条件下においても使用可能である。

上記T-7-2株の分離法、およびその菌学的性質などについては、後述の実施例において説明するが、ここでは図１を参照してその分離法について簡単に説明する。

まず、採取した土壌（Soil）を例えば0.8%塩化ナトリウム溶液に懸濁し、静置後、その上澄み適当量（例えば0.5ml）を0.1%硝酸アンモニウム（NH₄NO₃）液体培地を含む試験管に加える。培地は例えば下記表１に示す組成のものを使用する。但し、NH₄NO₃は水1,000ml当たり1.0gであり、FeSO₄・7H₂Oはこの場合0.5mMであるが、これより低濃度（例えば0.1mM）であってもよい。また、例えば濃度8μMとなるようNa₂MoO₄・2H₂Oを加えてもよい。

その後、試験管をブチルゴム栓等で密封した後、50℃で静置培養する。数日間培養後、気泡の発生が盛んに見られた試料を0.1%硝酸アンモニウム固体培地に塗抹する。培地は、固形化のため寒天（Agar）を加える以外は上記の液体培地と同様の組成のものを使用すればよい。この固体培地において各試料を30℃、好気的条件で培養し、生育した菌株を次に0.1%硝酸アンモニウムを含む傾斜培養に移し、スクリューキャップで試験管を密栓後、再び50℃で培養し、良好な生育を示す菌株を選択する。本発明者は、このような方法により、30℃及び50℃でも0.1%硝酸アンモニウム培地において良好な生育を示すT-7-2株を得た。

勿論、上記と異なる方法でT-7-2株あるいはこれと類似の性質をもつ菌株を土壌等から単離することは可能であるし、温度条件や各添加物の濃度条件など単離条件を様々に変更することにより、それぞれ異なる環境下でNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時除去する菌株を得ることが可能である。例えば、上記の方法は50℃という高温においてもNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時除去し得る耐熱性菌を得るため、50℃で培養する工程と30℃で培養する工程とを含んでいる。耐熱性菌を取得する目的でなければ、高温培養工程は必要ではない。勿論、培養時の温度は50℃、30℃以外の温度に設定してもよいし、その他の条件（例えば、培地中の鉄イオン（Fe²⁺）やモリブデン酸イオン（MoO₄ ^2-）の濃度、炭素源の種類や濃度など）も目的に応じて任意に設定すればよい。

本発明者は、上記のように、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時除去する微生物株（即ち、T-7-2株）をバチルス（Bacillus）属からはじめて見出した。そこで、Bacillus属に分類される保存株のうち、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時除去する菌株が存在するかどうかを調査した（調査方法は後述の実施例において説明する）ところ、下記の２つの菌株にNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時除去する性質が見出された。
１．バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）IFO 13719株
２．バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）IFO 3022株

尚、これら菌株に付されている番号は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）の保存株番号である。上記２つの菌株のうち、IFO 3022株は、30℃及び45℃の両条件下でNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去できる耐熱性菌の性質を示した。したがって、T-7-2株と同様、このIFO 3022株についても高温下での利用が可能である。

また同様の調査方法によって、既存のバチルス属菌の中からNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時除去する性質をもった菌株を選択することが可能である。本発明は、このような菌株選択法により得られたバチルス属菌株を利用するものであってもよい。

さらに上記と同様の調査方法によって、バチルス属以外の保存株についても調査した結果、下記のシュードモナス（Pseudomonas）属６株、エンテロバクター（Enterobacter）属２株、及びクレブシエラ（Klebsiella）属１株の計９つの菌株についてNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時除去する性質が見出された。
１．シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 12689株
２．シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 13738株
３．シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 3080株
４．シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 13130株
５．シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）IFO 15833株
６．シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）IFO 13301株
７．エンテロバクター・エアロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 13534株
８．エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）IFO 13535株
９．クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 3318株

本発明は、これら９つの菌株を利用するものであってもよいし、同様の菌株選択法により得られたシュードモナス属菌、エンテロバクター属菌、又はクレブシエラ属菌の菌株を利用するものであってもよい。

本発明の硝化・脱窒方法は、前記T-7-2株その他上述した少なくとも１種類の微生物株を用いて、対象物中のＮＨ₄ ⁺とＮＯ₃ ^-とを同時に除去する方法であり、複数の種類の菌株を組み合わせて使用するものであってもよい。また、「ＮＨ₄ ⁺とＮＯ₃ ^-とを同時に除去する」とは、ＮＨ₄ ⁺およびＮＯ₃ ^-の両方を除去し得る微生物を用いて硝化・脱窒処理を行うことを意味する。

本発明の硝化・脱窒処理剤は、基本的に、前記T-7-2株その他上述した少なくとも１種類の微生物株を含むものであればよく、そのほかに、保護剤、ＰＨ調整剤、培地成分などを含むものであってもよい。

本発明は、排水処理（下水処理、廃水処理、汚水処理など広く含む意味）に有用であり、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去できる微生物を使用するため、処理槽一つで窒素化合物を処理できる。したがって、処理槽が二槽必要であった従来の方法に比べて、低コスト化および処理時間の短縮を図ることができ、処理施設の規模も縮小することができる。また、耐熱性菌を使用した場合は、高温条件下での処理も可能になるので、処理可能条件が広がり、例えば気温変化の激しい屋外での処理、夏季期間中空調なしでの処理も可能になる。

また本発明は、工場の排水処理その他無機物中の窒素除去、家畜などの糞尿処理、汚泥処理、その他有機物中の窒素除去に利用可能であり、さらには、水族館やイカ・タコなど魚介類の養殖場における水中の窒素（特にアンモニア）除去にも利用可能である。このように、本発明は産業上幅広く利用できる。

本発明において微生物を使用する際の使用条件（使用温度、培地組成、培養条件（例えば好気性、嫌気性のいずれにするか）など）は特に限定されるものではなく、使用する微生物の性質・特徴に応じて窒素除去に最適な使用条件を選択すればよい。

以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。

〔実施例Ａ：NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する耐熱性菌の分離、その菌学的性質および同菌を用いたNH₄ ⁺とNO₃ ^-の同時除去試験〕
（Ａ−１）耐熱性菌の分離
各地から採取した土壌1gを9mlの0.8%（w/v）塩化ナトリウム溶液に懸濁し、静置後、上澄1mlを7mlの硝酸アンモニウム液体培地（培地の組成は前記表１参照）を含む試験管に加えた。ブチルゴム栓で密封した後、50℃で静置培養した。数日間培養後、気泡の発生が盛んに見られた試料を硝酸アンモニウム固体培地（培地の組成は下記表２参照）に塗抹した。これら各試料を30℃、好気的条件で培養し、生育した菌株を硝酸アンモニウム固体培地を含むスラント（傾斜培養）に移し、スクリューキャップで試験管を密栓後、再び50℃で培養し、良好な生育を示す菌株を選択した。その結果、30℃及び50℃でも同培地において良好な生育を示すT-7-2株を得た（図１参照）。

（Ａ−２）T-7-2株の菌学的性質とその同定
上記方法により分離したT-7-2株（以下、本菌という。）の菌学的性質について調査した結果を以下に示す。

（１）形態的性質
本菌の栄養細胞の大きさは0.64×1.6〜3.2μmで桿菌である。多形性は見られない。
本菌は運動性を示す。本菌は周鞭毛を有する。
本菌は肉汁寒天培地で2日培養すると栄養細胞のほぼ中央部に胞子を形成する。本菌の胞子はDorner法を用いて染色すると赤色に染まる。胞子の形はほぼ楕円状で、その大きさは0.6×0.8μmである。

（２）各種培養条件における性状
本菌は肉汁寒天培地やグルコースを炭素源及びエネルギー源、硝酸アンモニウムを窒素源とする合成培地などに良く生育する。
本菌は肉汁液体培地において、〜55℃で生育する。
本菌は肉汁寒天平板培養において、コロニーの形状は不規則円形であり、コロニーの表面隆起の状態は台状を示し、コロニーの周縁は波状であり、コロニー表面の形状は粗面である。また、コロニーの表面は鈍い光沢があり、バター状である。コロニーの色は植菌数日後は白灰色であるが、1週間後には褐色に変化する。
本菌は肉汁液体培養において、綿状又は羊毛状を示す。
本菌は肉汁ゼラチン穿刺培養において嚢状に生育し、ゼラチンを液化する。
本菌はリトマス・ミルクを用いた培養において、酸性を示し、培養液は凝固する。

（３）生理学的性質
グラム染色性：陽性
硝酸塩の還元：陽性
脱窒反応：陽性
MRテスト：陰性
VPテスト：陽性
インドールの生成：陰性
硫化水素の生成：陽性
デンプンの加水分解：陽性
クエン酸の利用：陽性
無機窒素源（硝酸塩及びアンモニウム塩）の利用：両塩を利用する。
色素の生成：不溶性の褐色色素を生成
ウレアーゼ：陰性
オキシダーゼ：陰性
カタラーゼ：陽性
生育の範囲：25〜55℃、pH6〜9
O-Fテスト(Hugh Leifson法)：発酵型
糖類からの酸及びガスの生成の有無：D-グルコース、L-アラビノースは酸を生成、ガスは生成せず。

（４）化学分類学的性質
本菌の16SリボゾームRNA遺伝子1,544塩基の分析の結果、ヌクレオチド配列はDNAデータベースの検索により、次に示す菌株と高い相同値を示す（B.はバチルス（Bacillus）の略。以下同じ）。
B. licheniformis strain B16 99.7%
B. licheniformis strain PR-1 99.7%
B. licheniformis strain KL-185 99.4%
B. licheniformis strain Mo1 99.1%
B. subtilis strain 09 98.1%

（５）分離源
菌株を分離した年月：平成14年8月
分離源：土壌
採取地：神戸

（６）本菌の同定
以上の結果から、本菌はバージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Volume 2）の記載事項に基づき、Bacillus属に属するものと同定された。さらに、16SリボゾームRNA遺伝子の解析から、本菌はB. licheniformis又はB. subtilisに属すると考えられるが、本菌は通性嫌気性菌であり、55℃でも生育可能であることから判断して、本菌をB. licheniformisと同定するのが妥当である。よって、本発明者は、本菌を「Bacillus licheniformis strain T-7-2」と命名した。

（Ａ−３）本菌によるNH₄ ⁺とNO₃ ^-の除去試験
図２に示すように、0.1％NH₄NO₃、3％グルコース、0.5mM Fe²⁺を含む前記表１の培地において、本菌は50℃、24時間でNH₄ ⁺（図中、Ammonia）とNO₃ ^-（図中、Nitrate）をほぼ培地中から除去した。また、図３に示すように、30℃においても48時間で同培地中のNH₄ ⁺をほぼ除去し、NO₃ ^-は40％まで除去した。この結果から、本菌は50℃のときに30℃に比べて急速に両イオンを培地から除去することが分かった。

（Ａ−４）NH₄ ⁺とNO₃ ^-の同時除去に与えるFe²⁺とMoO₄ ^2-の濃度の影響
0.1〜0.2％NH₄NO₃、3〜5％グルコースを含む培地において、NH₄ ⁺とNO₃ ^-の同時除去に与えるFe²⁺とMoO₄ ^2-の濃度の影響を調べた。図４は、二価鉄イオン（Fe²⁺）の影響を調べた結果であり、培養3日目（72時間後）の本菌（T-7-2株）の生育（OD₆₆₀）培地中のNH₄ ⁺、NO₃ ^-、NO₂ ^-の残存量（％）を示す。また同図（ａ）は50℃で培養した結果、（ｂ）は30℃で培養した結果である。同図に示すように、Fe²⁺の添加は、両イオンを除去するために非常に重要であった。特に、50℃においてこの傾向は顕著であった。すなわち、0.1％NH₄NO₃を含む培地において、Fe²⁺が存在しないと両イオンは殆ど除去されないが、0.2mM以上のFe²⁺存在下では、3日間で両イオンを完全に除去することが分かった。また、NH₄NO₃の濃度を0.2％に増加させた培地では、0.5mM Fe²⁺において、50℃培養下NH₄ ⁺とNO₃ ^-の両イオンが除去された。

図５は、モリブデン酸イオン（MoO₄ ^2-）の影響を調べた結果であり、（ａ）は本菌（T-7-2株）を50℃で培養した結果、（ｂ）は30℃で培養した結果である。同図に示すように、NH₄ ⁺とNO₃ ^-の除去に与えるMoO₄ ^2-の影響は、Fe²⁺ほど顕著ではなかった。また、10nM以上のMoO₄ ^2-が存在すると、本菌による両イオン除去はむしろ阻害される傾向が認められた。MoO₄ ^2-の濃度を適切に調整することによって、本菌による両イオンの効果的な除去が達成できることが分かった。

（Ａ−５）本菌培養液中の全窒素量の変化
次に、本菌培養液中の全窒素量の変化について検討した。全窒素の定量法は、次の方法によって行った。

ケルダール分解で有機態窒素をアンモニア態窒素に変換し、生成したアンモニア態窒素の定量はConwayの微量拡散分析法により行った。吸収剤は2 g boric acidを20 mlの99%（w/w）ethanolに溶かし、2 mlのpH指示薬（0.2%（w/v）methyl red- 0.2%（w/v）bromocresol green（1:5））を加えた後、0.05 N HCl溶液でpH 3.5〜3.6に調整し、脱イオン水で計100 mlとして調製した。1 mlの試料を外室に、1 mlの吸収剤を内室に、それぞれ加えた。1 mlの12%（w/v）MgO light懸濁液を外室に加え、直ちに蓋をし、30℃で1夜静置して発生したアンモニアを内室に吸収させた。1 mlの脱イオン水を内室に加えた後、1/500 N HCl溶液で滴定を行い、アンモニア態窒素を定量した。

50℃の培養条件において行った上記実験結果を図６に示す。同図に示すように、培養液中のNH₄ ⁺とNO₃ ^-が減少するに従って、培地中の全窒素量は減少し、菌体中の全窒素量は増加する。培地中のNH₄ ⁺とNO₃ ^-が完全に消費された時点で培地中と菌体中の全窒素量を合計すると、その量は始めに培地に加えた全窒素量の70％に減少している。残りの30％は脱窒されたものと考えられる。また、30℃培養においても、本菌の生育とともに培地中のNH₄ ⁺とNO₃ ^-が消費され、培養48時間の時点で全窒素量は、培養開始時の80％に減少している（図７参照）。よって、30℃においても消費された窒素化合物の一部は脱窒されていると考えられる。

以上のように、今回分離・同定した本菌（即ち、Bacillus licheniformis strain T-7-2）は、（１）50℃のような高温においても、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去することができ、また、（２）50℃のみならず、30℃でもNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去することができる。この結果は、本菌が、常温ではあまり生育せずに高温においてのみ生育し、その生物活性を示すいわゆる高温菌とは異なる「耐熱性菌」であることを示すものである。このように本菌はおよそ30〜50℃で生育し、かつNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去できるため、気温変化の激しい条件下でも使用することが可能である。

〔実施例Ｂ：Bacillus属に属する保存株のうち、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する菌株の選択と同菌株によるNH₄ ⁺とNO₃ ^-の同時除去試験〕
上記のように、本発明者は、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する微生物（即ち、T-7-2株）をBacillus属菌からはじめて見出した。そこで次に、Bacillus属に分類される保存株のうち、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する菌株が存在するかどうかを以下の実験により調査した。

（Ｂ−１）使用菌株
本実験においては、下記の表示によって特定され、微生物保存機関に保存されている(1)〜(10)の菌株を使用した。
(1) B.subtilis IFO 13721 (2) B.subtilis IFO 3013 (3) B.subtilis IFO 13719
(4) B.subtilis IFO 3335 (5) B.subtilis IFO 3009 (6) B.subtilis IFO 3022
(7) B.megaterium (8) B.sphaericus IFO 3525 (9) Bacillus. sp. AM-23
(10) Bacillus. sp. FL-90 （以下、IFOの文字は省略することがある。）

（Ｂ−２）培地の調製
本実験に使用した培地の組成を下記表３に示す。0.8pM、0.8nM、又は8μMの濃度のNa₂MoO₄・2H₂Oを含む7 mlの0.1％（w/v）NH₄NO₃培地を調製し、それぞれに0.1 mMとなるようFeSO₄・7H₂Oを添加した。

（Ｂ−３）培養
各菌を植菌後、30℃にて好気条件下で振盪培養し、１日ごとに培養液の濁度と培地中に残存するNH₄ ⁺、NO₃ ^-、NO₂ ^-を定量した。

（Ｂ−４）NO₂ ^-の定量
0-0.6 mMのNO₂ ^-を含む0.15 mlの溶液に、H₂O 0.35 ml、0.1 M potassium-sodium phosphate buffer（pH 7.1）0.5 mlを加えた後、0.5 mlの1%(w/v)スルファニルアミド-9% HCl溶液および0.02% N-ナフチルエチレンジアミン・2 HCl溶液を加え、室温にて10分間放置後、540 nmにて吸光度を測定した。

（Ｂ−５）NO₃ ^-の定量
0.25-3 mMのNO₃ ^-を含む溶液に、2%(w/v)サリチル酸-濃硫酸0.2mlを加えた後、3.7ｍlの10%(w/v)NaOH溶液を加えた後、410 nmにて吸光度を測定した。

（Ｂ−６）NH₄ ⁺の定量
0.01-0.30 mMのNH₄ ⁺を含む1 mlの溶液に、0.4 mlのフェノール・ニトロプルシドナトリウム溶液（下記表４参照）を加えた後、0.6 mlのアンチホルミン溶液（下記表５参照：アンチホルミン４mlと1N NaOH 40mlを混合しH₂Oで100mlにメスアップしたものを使用した。）を加え、栓をした後、室温にて45分間放置後、635 nmにて吸光度を測定した。

（Ｂ−７）実験結果
本実験結果を以下の表６にまとめた。

表６に示すように、今回調査した(1)〜(10)のバチルス属菌のうち、(3) B.subtilis 13719および(6) B.subtilis 3022 の2株において NH₄ ⁺, NO₃ ^-の減少が見られた。また、(3) B.subtilis 13719 に関しては、MoO₄ ^2-の濃度が0.8pMのとき最もNH₄ ⁺, NO₃ ^-が減少した（その結果を図８に示す）。一方、(6) B.subtilis 3022 に関しては、MoO₄ ^2-の濃度が0.8nMのとき最もNH₄ ⁺, NO₃ ^-が減少した（その結果を図９に示す）。

次に、0.8pM、0.8nM、又は8μMの濃度のNa₂MoO₄・2H₂Oを含む7 mlの0.1％（w/v）NH₄NO₃培地を調製し、それぞれに0.1 mMのFeSO₄・7H₂Oを添加した。これに(6) B.subtilis 3022を植菌後、45℃にて振盪培養し、１日ごとに培養液の濁度と培地中に残存するNH₄ ⁺、NO₃ ^-、NO₂ ^-を定量した。その結果、0.8nMのMoO₄ ^2-のとき最もNH₄ ⁺, NO₃ ^-が減少していた（図１０に0.8nMのときの結果を示す。尚、図４、８〜１０において、NO2、NO3、NH4はそれぞれNO₂ ^-、NO₃ ^-、NH₄ ⁺を示す）。

以上のように、（１）今回調査したBacillus属菌の中では、B.subtilis IFO 13719 とB.subtilis IFO 3022が30℃でNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去した。また、（２）B.subtilis IFO 3022は45℃においてもNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去した。即ち、この菌株は30℃及び45℃の両条件下でNH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去できるいわゆる耐熱性菌の性質を示した。

〔実施例Ｃ：Enterobacter属、Pseudomonas属などの保存株のうち、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する菌株の選択と同菌株によるNH₄ ⁺とNO₃ ^-の同時除去試験〕
本発明者は、さらに、Enterobacter、Pseudomonas、Klebsiella、Serratia、Proteus、Alcaligenes、又はAcetobacter属に分類される保存株のうち、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去する菌株が存在するかどうかを以下の実験により調査した。

（Ｃ−１）使用菌株
本実験においては、下記の表示によって特定される保存菌株を使用した。
Enterobacter aerogenes IFO 13534
Enterobacter cloacae IFO 13535
Pseudomonas aeruginosa IFO 12689
Pseudomonas aeruginosa IFO 13738
Pseudomonas aeruginosa IFO 3080
Pseudomonas aeruginosa IFO 13130
Pseudomonas putida IFO 3738
Pseudomonas fluoresscens IFO 15833
Pseudomonas denitrificans IFO 13301
Klebsiella pneumoniae IFO 3318
Klebsiella planticola IFO 3317
Serratia marcescens IFO 3736
Proteus vulgaris IFO 3851
Alcaligenes faecalis IFO 13111
Alcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans IFO 15125

（Ｃ−２）培地の調製
本実験に使用した培地の組成を下記表７に示す。NH₄NO₃は0.1〜0.4％（w/v）、Na₂MoO₄・2H₂Oは0.8pM、0.8nM、又は8μMの濃度のものを使用した。

（Ｃ−３）培養
各菌を植菌後、30℃にて好気条件下で振盪培養し、１日ごとに培養液の濁度と培地中に残存するNH₄ ⁺、NO₃ ^-、NO₂ ^-を定量した。

（Ｃ−４）NO₂ ^-、NO₃ ^-、NH₄ ⁺の定量、及び全窒素の定量法
NO₂ ^-、NO₃ ^-、NH₄ ⁺の各定量は、前記（Ｂ−４）（Ｂ−５）（Ｂ−６）に記載の方法と同様に行った。また、全窒素の定量法は、前記（Ａ−５）に記載の方法と同様に行った。

（Ｃ−５）実験結果
本実験の結果、調査したEnterobacter属2株、Pseudomonas属7株、Klebsiella属2株、Serratia属1株、Proteus属1株、Alcaligenes属2株のうち、Enterobacter属2株、P. putida IFO 3738を除くPseudomonas属6株、およびKlebsiella pneumoniae IFO 3318の計９株が、0.1％NH₄NO₃培地において、NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去することができた。これら菌株によるNH₄ ⁺およびNO₃ ^-の同時除去の結果を下記表８に示す。

上記の結果は、培養2日目（48時間）の結果であり、NH₄ ⁺とNO₃ ^-は培地中に残存する量（ｍM）を示す。

また、代表的な例としてE. cloacae IFO 13535の結果を図１１に、P. denitrificans IFO 13301の結果を図１２にそれぞれ示す。尚、E.はエンテロバクター（Enterobacter）の略、P.はシュードモナス（Pseudomonas）の略である。

NH₄ ⁺とNO₃ ^-を同時に除去することができた菌株の中でも、P. aeruginosa IFO 12689、P. aeruginosa IFO 13738、P. aeruginosa IFO 3080、P. aeruginosa IFO 13130 の4株は0.4％NH₄NO₃培地において、培養開始2日で、NH₄ ⁺とNO₃ ^-をほぼ完全に除去することができた。またこのとき、NO₂ ^-の蓄積は見られなかった。代表的な例としてP. aeruginosa IFO 3080の結果を図１３（ａ）に示す。

また図１３（ｂ）に示すように、培養液中のNH₄ ⁺とNO₃ ^-が減少するに従って、培地中の全窒素量（Total Nitrogen）は減少し、菌体中の全窒素量は増加する。培地中のNH₄ ⁺とNO₃ ^-が完全に消費された時点（2日目）で培地中と菌体中の全窒素量を合計すると、その量は始めに培地に加えた全窒素量の45％に減少している。残りの55％は脱窒されたものと考えられる。

上記P. aeruginosa IFO 3080の結果をまとめると、（１）Fe²⁺とMoO₄ ^2-の濃度を調整することにより、0.4％という高濃度のNH₄NO₃を培地中から除去できた、また、（２）NH₄ ⁺とNO₃ ^-が除去された時点において、窒素化合物は培地中（培養上清中）に殆ど存在しなかった。加えた全窒素量の45％は菌体に蓄積し、残りの55％は脱窒されたものと考えられる。

以上のように、本発明は、微生物を利用してＮＨ₄ ⁺とＮＯ₃ ^-とを同時除去する硝化・脱窒方法に関するものであり、前述したとおり、排水処理に利用できるほか、家畜などの糞尿処理、さらには、水族館や養殖場における水中のアンモニア除去などにも利用可能であり、産業上幅広く利用できる。

本発明に係る微生物（T-7-2株）の分離法の概略を示す図である。 上記T-7-2株の50℃培養下での硝化・脱窒能を示すグラフである。 上記T-7-2株の30℃培養下での硝化・脱窒能を示すグラフである。 上記T-7-2株のNH₄ ⁺およびNO₃ ^-の同時除去に与えるFe²⁺濃度の影響を調べた結果を示すグラフであり、（ａ）は50℃で培養した結果、（ｂ）は30℃で培養した結果である。 上記T-7-2株のNH₄ ⁺およびNO₃ ^-の同時除去に与えるMoO₄ ^2-濃度の影響を調べた結果を示すグラフであり、（ａ）は50℃で培養した結果、（ｂ）は30℃で培養した結果である。 上記T-7-2株の50℃培養下での培養液中の全窒素量の変化を調べた結果を示すグラフである。 上記T-7-2株の30℃培養下での培養液中の全窒素量の変化を調べた結果を示すグラフである。 B.subtilis IFO 13719株の硝化・脱窒能を示すグラフである。 B.subtilis IFO 3022株の30℃培養下での硝化・脱窒能を示すグラフである。 B.subtilis IFO 3022株の45℃培養下での硝化・脱窒能を示すグラフである。 E. cloacae IFO 13535株の硝化・脱窒能を示すグラフである。 P. denitrificans IFO 13301株の硝化・脱窒能を示すグラフである。 （ａ）は、P. aeruginosa IFO 3080株の硝化・脱窒能を示すグラフであり、（ｂ）は、その過程における培養液中の全窒素量の変化を調べた結果を示すグラフである。

Claims (13)

1. 以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を用いて、対象物中のＮＨ₄ ⁺とＮＯ₃ ^-とを同時に除去する硝化・脱窒方法。
   （ａ）バチルス属に属する菌株
   （ｂ）シュードモナス属に属する菌株
   （ｃ）エンテロバクター属に属する菌株
   （ｄ）クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 3318株
2. 上記（ａ）の菌株として、以下の（ａ１）〜（ａ３）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を用いることを特徴とする、請求項１記載の硝化・脱窒方法。
   （ａ１）バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）T-7-2株（FERM P-19418）
   （ａ２）バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）IFO 13719株
   （ａ３）バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）IFO 3022株
3. 上記（ｂ）の菌株として、以下の（ｂ１）〜（ｂ６）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を用いることを特徴とする、請求項１記載の硝化・脱窒方法。
   （ｂ１）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 12689株
   （ｂ２）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 13738株
   （ｂ３）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 3080株
   （ｂ４）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 13130株
   （ｂ５）シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）IFO 15833株
   （ｂ６）シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）IFO 13301株
4. 上記（ｃ）の菌株として、以下の（ｃ１）〜（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を用いることを特徴とする、請求項１記載の硝化・脱窒方法。
   （ｃ１）エンテロバクター・エアロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 13534株
   （ｃ２）エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）IFO 13535株
5. 耐熱性の菌株を用いることを特徴とする、請求項１記載の硝化・脱窒方法。
6. 排水処理などにおける水中の窒素除去、工場の排水処理その他無機物中の窒素除去、又は、糞尿その他有機物中の窒素除去に用いることを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載の硝化・脱窒方法。
7. 以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を含有し、対象物中のＮＨ₄ ⁺とＮＯ₃ ^-とを同時に除去する硝化・脱窒処理剤。
   （ａ）バチルス属に属する菌株
   （ｂ）シュードモナス属に属する菌株
   （ｃ）エンテロバクター属に属する菌株
   （ｄ）クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 3318株
8. 上記（ａ）の菌株として、以下の（ａ１）〜（ａ３）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を含有することを特徴とする、請求項７記載の硝化・脱窒処理剤。
   （ａ１）バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）T-7-2株（FERM P-19418）
   （ａ２）バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）IFO 13719株
   （ａ３）バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）IFO 3022株
9. 上記（ｂ）の菌株として、以下の（ｂ１）〜（ｂ６）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を含有することを特徴とする、請求項７記載の硝化・脱窒処理剤。
   （ｂ１）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 12689株
   （ｂ２）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 13738株
   （ｂ３）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 3080株
   （ｂ４）シュードモナス・エアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 13130株
   （ｂ５）シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）IFO 15833株
   （ｂ６）シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）IFO 13301株
10. 上記（ｃ）の菌株として、以下の（ｃ１）〜（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種類の微生物を含有することを特徴とする、請求項７記載の硝化・脱窒処理剤。
    （ｃ１）エンテロバクター・エアロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 13534株
    （ｃ２）エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）IFO 13535株
11. 耐熱性の菌株を含有することを特徴とする、請求項７記載の硝化・脱窒処理剤。
12. 排水処理などにおける水中の窒素除去、工場の排水処理その他無機物中の窒素除去、又は、糞尿その他有機物中の窒素除去に用いることを特徴とする、請求項７〜１１の何れか１項に記載の硝化・脱窒処理剤。
13. バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）T-7-2株（FERM P-19418）。
    
    

Images