CN105670977B - 一株肠杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株肠杆菌及其应用。该菌株为肠杆菌（Enterobactersp.）FL，于2016年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.11993。该肠杆菌FL可应用于含氮有机废水的处理领域，在好氧的条件下通过反硝化作用去除废水中的硝酸盐氮；该肠杆菌脱氮过程中分泌产生以蛋白质、多糖等为主要成分的胞外聚合物，该类聚合物能引发细菌细胞自发聚集沉降，并实现菌水分离。该菌株具有好氧反硝化脱氮的能力，脱氮同时能自聚集形成沉淀，具有聚集自沉特性，使后期构建以该菌株为功能菌的反应器来实现好氧反硝化脱氮、以及泥水分离获得澄清的出水成为可能，具有广阔的应用前景和良好的社会环保效益。

Description

一株肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及环境微生物领域，具体涉及一株肠杆菌(Enterobacter sp.)FL及其应用。
背景技术
随着现代工业和社会经济的快速发展，由环境污染所引发的问题日益严重，其中水体污染成为环境污染的主要问题之一，而水体氮素失衡导致水体富营养化则是水体污染严重的重要表现。自然界的氮素平衡逐渐被打破，不仅造成严重的环境污染与经济损失，甚至威胁到人类健康与生态安全，随着污水处理技术的不断发展，污水脱氮技术已日趋成熟，而生物脱氮则是目前公认的废水脱氮技术中较为经济而又行之有效的方法之一。
传统的生物脱氮主要是利用自养硝化细菌的硝化作用和异养反硝化细菌的反硝化作用来协同完成。硝化作用和反硝化作用需要分别在好氧和缺(厌)氧条件下进行，也就是说反硝化作用需在缺(厌)氧的条件下才能完成，而前段的硝化过程却是好氧的。这样严苛的反应条件往往使得脱氮工艺复杂且条件难于控制，从而导致脱氮效率低、管理难度大、运行成本高等问题。
近年来，众多学者研究发现环境中存在一类可以在好氧条件下进行反硝化的微生物。王宏宇等(好氧反硝化菌株的鉴定及其反硝化特性研究，环境科学，2007，07)从污水处理厂的活性污泥中筛选分离得到一株具有好氧反硝化特性的假单胞菌(Pseudomonassp.)，该细菌能在好氧条件下去除培养液中的硝酸盐氮，且脱氮效率可达90％以上。李卫芬等(1株好氧反硝化菌的分离鉴定及反硝化特性研究，环境科学，2011，08)采用BTB培养基初筛和反硝化性能测定两种方式，从养殖草鱼的池水中分离获得一株具有高效好氧反硝化脱氮能力的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，并将其命名为好氧反硝化菌F1；该细菌分别以乙酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖和蔗糖作为碳源时，在好氧条件下对硝酸盐氮的去除率均能达到100％，且当C/N(碳氮比)大于10时，反应过程几乎不累积亚硝酸盐氮。如上有关好氧反硝化脱氮特性的研究不胜枚举，众多研究也表明好氧反硝化在生物脱氮方面有着不可忽视的优势和应用潜力，是未来废水生物脱氮的发展趋势之一。
近年来有关研究指出，某些纯种好氧反硝化菌株在实验室试验中表现出聚集自沉特性。Ren等(The characteristics of a novel heterotrophic nitrifying andaerobic denitrifying bacterium,AcinetobacterjuniiYB,Bioresource Technology,2014,08)在对Acinetobacterjunii YB进行研究时发现，该菌株在摇瓶中能形成絮状聚合体，具有一定的自沉效果；Soumesh等(Characterisation of heterotrophic nitrifyingand aerobic denitrifying Klebsiellapneumoniae CF-S9strain for bioremediationofwastewater,International Biodeterioration&Biodegradation,2013,02)前期的研究也发现Klebsiellapneumoniae CF-S9具有絮凝自沉特性。此类研究均指出，菌体的絮凝聚集能一定程度上实现脱氮反应后的菌水分离。
但至今为止对此类好氧反硝化菌的研究尚未完善，好氧反硝化作用的广泛性还需要进一步确定。而且，针对具有絮凝聚集性能的好氧反硝化菌的研究更为缺乏。因此，仍需要从自然环境中分离纯化得到更多高效、稳定的好氧反硝化菌株。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明提供一株肠杆菌(Enterobacter sp.)FL，该肠杆菌FL应用在好氧的条件下能高效去除废水中NO3 --N(硝酸盐氮)，且在脱氮反应同时可自发形成聚集体，实现菌水分离。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的肠杆菌(Enterobacter sp.)FL，于2016年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为CGMCC No.11993。本发明的肠杆菌FL的16S rDNA基因序列见序列表，序列长度为1383bp，在GenBank中基因序列登陆号为KU866460。
该肠杆菌(Enterobacter sp.)FL在含氮有机废水的脱氮处理领域有良好的应用前景。在完全好氧的条件下，该菌株能实现好氧条件下废水中NO3 --N的高效去除；菌株在脱氮同时自发形成聚集体，实现脱氮反应后的菌水分离。
上述肠杆菌FL用于处理含氮有机废水时，所述废水碳氮比为5～25，较优条件为10～20。
上述肠杆菌FL用于处理含氮有机废水时，所述废水pH值为5～10，较优条件为7～9。
上述肠杆菌FL用于处理含氮有机废水时，所述废水温度为20～40℃，较优条件为25～35℃。
上述肠杆菌FL用于处理含氮有机废水时，处理条件优选为废水碳氮比10～20；废水pH值为7～9；废水温度为25～35℃。其最大聚集沉降率约为40％，其分泌产生蛋白质含量约为10～100mg/g细胞干重，并产生极其少量的多糖。
与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、肠杆菌FL能在好氧条件下完成反硝化过程，从而去除废水中的NO3 --N，且反应过程只累积极少量的NO2 --N(亚硝酸盐氮)、NH4 +-N(氨氮)。该菌株的应用能有效缓解传统两段式硝化-反硝化脱氮工艺对于溶解氧需求不同的矛盾，使得反应条件易控制、工艺管理更加方便，进而节约运行成本。
2、肠杆菌FL在好氧条件下反硝化去除NO3 --N性能稳定，对NO3 --N的去除率在80％以上，TN(总氮)去除率约为70％或以上。这一高效的脱氮效率，可有效的解决污水厂处理效率低的问题，具有良好的环境保护效益和较为广阔的应用前景。
3、肠杆菌FL在好氧反硝化脱氮同时分泌胞外聚合物，使菌体细胞能自发聚集形成聚集体，实现反硝化脱氮反应后的菌水分离。且该类胞外聚合物的主要组成为蛋白质类、多糖类等的高分子物质，无任何毒害作用。鉴于该细菌的聚集自沉特性，使得后期构建以该菌株为功能菌的反应器，并实现处理后的泥水分离、获得较为澄清的出水成为可能。
附图说明
图1为肠杆菌(Enterobacter sp.)FL细胞扫描电镜图。
图2为肠杆菌(Enterobacter sp.)FL细胞聚集沉淀扫描电镜图。
图3为肠杆菌(Enterobacter sp.)FL在NO3 --N(硝酸盐氮)废水中的生长以及其对NO3 --N、TN(总氮)的降解和NO2 --N(亚硝酸盐氮)、NH4 +-N(氨氮)的累积情况图。
图4为肠杆菌(Enterobacter sp.)FL胞外聚合物分泌与细菌细胞生长、细胞聚集自沉的关系曲线。
图5为肠杆菌(Enterobacter sp.)FL细胞聚集自沉特性曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一
1、菌株的筛选
本发明提供的好氧反硝化细菌分离自活性污泥，所用活性污泥来自重庆市鸡冠石污水厂A2/O工艺二沉池，菌株的筛选采用稀释平板划线法，具体按如下步骤操作：
1)将1mL从污水厂二沉池取来的污泥接种到LB液体培养基中富集培养12～24h。
2)配制含NO3 --N(硝酸盐氮)的选择培养基Ⅰ，取上述LB富集培养液1mL接种到选择培养基Ⅰ中，置于30℃、120rpm恒温振荡培养箱中培养48h。
3)另取选择培养基Ⅰ，并向其中加入1.5～2.0％的琼脂粉，制成固体培养基Ⅱ；取步骤2)中培养液1mL梯度稀释后接种于含有固体培养基Ⅱ的平板上，并按“之”形划线；然后倒置平板于30℃下培养2～3d；
4)挑取平板上长势相对较好的单个菌落逐一分装于含10mL选择培养基Ⅰ的试管中，并将其置于30℃、120rpm恒温振荡培养箱中培养48h；取各试管中培养液测定OD600(溶液在600nm波长处的吸光值)，离心后测上清液中的NO3 --N、TN(总氮)的含量。
5)选取步骤4)中对NO3 --N和TN去除效果最好的一组，取1mL进行梯度稀释后接种于含有固体培养基Ⅱ的平板上，并按“之”形划线；然后倒置培养2～3d；
6)重复步骤4)、5)，直至每次测得的OD600、NO3 --N、和TN均分别维持在同一个相对稳定的值为止。至此，即可认为分离得到的具有好氧反硝化脱氮能力的菌株为单一纯种菌株。
后续16S rDNA基因测序鉴定为肠杆菌(Enterobacter sp.)，并命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)FL。
其中涉及的培养基的构成分别为：
LB液体培养基构成为(每L)：酵母粉5g；蛋白胨10g；NaCl 5g；采用Na2HPO3、NaH2PO3调节pH至7.0～8.0。
选择培养基Ⅰ的构成为(每L)：KNO30.58g；二水合柠檬酸三钠3.27g；NaCl 4g；六种微量元素溶液各3mL；采用Na2HPO3、NaH2PO3调节pH至7.0～8.0。
固体培养基Ⅱ的构成为：于选择培养基Ⅰ中加入15～20g/L的琼脂粉制成。
所述六种微量元素溶液由MgSO4·7H2O 3.01g、MnSO4·H2O 3.36g、H3BO31.12g、ZnSO4·7H2O 3g、FeSO4·7H2O 0.3g、CaCl20.6g分别溶于1L去离子水所得。
2、菌株的鉴定
经鉴定，菌株FL为革兰氏阴性粗短杆菌，菌体宽为0.6～1.0μm、长为1.0～2.2μm，有周身鞭毛、无芽孢，其扫描电镜形态见图1；在pH为7.0～8.0的蛋白胨-酵母粉固体培养基上易生长形成菌落，菌落呈规则圆形、大而湿润、表面光滑呈黏液状、直径约为1～4mm、中心凸起且有核。
该菌株的16S rDNA基因序列见序列表，序列长度为1383bp。在Genbank中其基因序列的登陆号为KU866460。将该序列输入Genbank进行比对，比对结果显示其与Enterobactersp.的序列相似度最高为99％，结合该细菌的形态特征及各项生理特征，确认该菌株属于肠杆菌(Enterobacter sp.)，并将其命名为Enterobacter sp.FL。
本发明所提供的肠杆菌(Enterobacter sp.)FL，于2016年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为CGMCC No.11993。
实施例二
肠杆菌(Enterobacter sp.)FL对NO3 --N的降解情况
将肠杆菌(Enterobacter sp.)FL置于以KNO3为唯一氮源、二水合柠檬酸三钠为唯一碳源的人工模拟废水中，考察菌株对NO3 --N、TN的去除以及反应过程中NO2 --N(亚硝酸盐氮)、NH4 +-N(氨氮)的累积情况。配水初始TOC(总有机碳)浓度约为800mg/L，TN浓度约为80mg/L，pH控制在7.0～8.0。接种后于30℃、120rpm条件下恒温振荡培养72h，每隔12h取样测定相关指标。由图3可以看出，菌株能以柠檬酸三钠为有机碳源，实现对NO3 --N、TN的高效去除，去除率最高分别可达85％、70％，且反应过程累积极少量的NO2 --N和NH4 +-N。表明菌株FL在好氧条件下对NO3 --N具有良好的去除效果。
实施例三
肠杆菌(Enterobacter sp.)FL的胞外聚合物分泌特性分析
检验肠杆菌(Enterobacter sp.)FL的胞外聚合物分泌特性，以肠杆菌(Enterobacter sp.)FL的胞外聚合物分泌与细菌细胞生长、细胞聚集自沉的关系为例。将肠杆菌FL在人工模拟废水中连续培养84h，每隔12h取样测定OD600、细胞干重以及胞外蛋白质、多糖含量。
其中模拟废水水质情况为(每L)：KNO30.58g；二水合柠檬酸三钠3.27g；NaCl 4g；酵母粉1g；牛肉膏2g；六种微量元素溶液(与实施例中相同)各3mL；于30℃、120rpm条件下恒温振荡培养。
肠杆菌FL在培养液中的生长及胞外聚合物的分泌情况如图4所示。由图4可知菌株FL在该培养条件下生长良好，表现为OD600以及细胞干重在一定时间内的增加。48h后，随着时间的增长细胞干重基本保持不变，即整个培养液中细胞含量基本维持不变，而上层培养液的OD600逐渐下降，表明细胞发生聚集自沉从而使得上层培养液中细胞浓度值降低。此时细菌分泌产生的胞外蛋白含量也逐渐增加而多糖含量基本维持不变，表明培养液中细胞聚集自沉作用的发生与胞外蛋白分泌量的增加密切相关。上述实验表明肠杆菌FL分泌产生胞外聚合物，从而促使细胞发生聚集沉降以实现菌水分离。
实施例四
肠杆菌(Enterobacter sp.)FL的聚集自沉特性分析
采用以下聚集沉降性能测定实验来分析肠杆菌(Enterobacter sp.)FL应用于含NO3 --N废水处理过程中的聚集自沉特性：
将肠杆菌FL在如实施例三的人工模拟废水中培养48h，形成如图2所示的聚集体，将该聚集体吹散，并将培养液摇匀，取一定量摇匀后的培养液用0.9％生理盐水调节OD600值约为0.6左右；取上述调节后的培养液30mL于50mL离心管中，上下颠倒摇匀后静置，细胞聚集并沉至容器底部，分别于1、2、3、4、5h后取上层液体测定OD600。按下式计算聚集沉降率：
式中：At—t时刻的聚集沉降率，％；OD600，0—0时刻液体OD600值；OD600，t—t时刻液体OD600值；t—静置沉降时间，h，取1、2、3、4、5。
因微生物的絮凝聚集过程是一个可逆的生理过程，符合伪一级反应动力学方程，故可按下式拟合并计算聚集沉降速率常数：
式中：At—t时刻的聚集沉降率，％；Ae—达到平衡时的聚集沉降率，％；k1—聚集沉降速率常数，h-1；t—静置沉降时间，h，取1、2、3、4、5。
实验结果如图5所示，结果表明肠杆菌FL培养48h后，细菌的聚集沉降速率常数最大为23.3h-1，其最大聚集沉降率约40％。表明菌株FL具有良好的聚集自沉能力，能一定程度上实现脱氮反应后的菌水分离。
本发明提供的肠杆菌FL具有在好氧条件下进行反硝化高效去除废水中NO3 --N的特性，反应只积累极少量的NO2 --N、NH4 +-N，可有效缓解传统两段式硝化-反硝化脱氮工艺对于溶解氧需求不同的矛盾；且脱氮过程中能自发形成聚集体，具有自沉特性，能实现脱氮反应后的菌水分离。基于该细菌的这两大特性，将其投入实际运行，可以提高污水处理的脱氮效率、简化反应工艺运行管理程序、节约污水处理运行成本，具有良好的社会环境保护效益和较为广阔的应用前景。
本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
<110> 重庆大学
<120> 一株肠杆菌及其应用
<130> 说明书
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1383
<212> DNA
<213> Enterobacter sp.
<400> 1
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acattactca cccgtccgcc actcgtcacc cgagagcaag ctctctgtgc taccgtcgac 1380
tgc 1383

Claims (9)

1.一株肠杆菌（Enterobacter sp.）FL，保藏编号为CGMCCNo.11993，所述肠杆菌FL的16S rDNA基因序列具有序列表中SEQIDNO.1所示，所述肠杆菌FL在好氧反硝化脱氮的同时分泌胞外蛋白，使菌体细胞能自发聚集形成聚集体，同步实现好氧反硝化脱氮和脱氮后的菌水分离。
2.保藏号为CGMCCNo.11993的肠杆菌FL对含氮有机废水处理的应用，其特征在于，肠杆菌FL在好氧条件下，通过反硝化作用去除废水中的硝酸盐氮。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的含氮有机废水的碳氮比为5~25。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的含氮有机废水的碳氮比为10~20。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的含氮有机废水pH值为5~10。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的含氮有机废水pH值为7~9。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的含氮有机废水的温度为20~40℃。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的含氮有机废水的温度为25~35℃。
9.根据权利要求3~8所述的任一应用，其特征在于，所述的含氮有机废水的碳氮比为10~20、pH值为7~9、温度为20~30℃；所述的肠杆菌FL的最大聚集沉降率为40%，其分泌产生蛋白质和多糖，所述蛋白质的含量为10~100mg/g细胞干重。
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