CN102533595B - 一株1,2-二氯乙烷降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株1，2-二氯乙烷降解菌——Starkeya sp.T-2，及其在微生物降解1，2-二氯乙烷中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期：2011年07月25日，保藏编号：CCTCC NO：M 2011263。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株1，2-二氯乙烷的高效降解菌，该菌株为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能够以1，2-二氯乙烷为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底物，本发明为生物法净化含1，2-二氯乙烷废水及废气的工程应用奠定了基础。
Description
(一)技术领域
一株1，2-二氯乙烷降解菌——Starkeya sp.T-2，及其在微生物降解1，2-二氯乙烷中的应用。
(二)背景技术
1，2-二氯乙烷(1，2-dichloroethane，C2H4Cl2)是一种无色、易挥发、具有氯仿气味的油状可燃性液体，是工业上常用的一种有机溶剂，广泛应用于化学合成的原料、工业试剂、脱脂剂、金属清洁剂和粘合剂等。在使用过程中，1，2-二氯乙烷可以通过废气和废水的形式排放进入环境中，对环境造成严重而长期的污染。1，2-二氯乙烷能刺激和引起肝、肾和肾上腺损害，对皮肤、黏膜、胃肠道也有刺激作用，可引起胃肠道反应、接触性皮炎及肺水肿等，该物质还是一种潜在的诱变剂和致癌物质，对人类健康产生严重的威胁。1，2-二氯乙烷对大气臭氧层也有着极强的破坏力。
由于1，2-二氯乙烷的广泛应用以及它的高毒性和持久性，研发出经济又有实效的处理1，2-二氯乙烷的方法已经成为国际上环境污染控制领域的研究热点。1，2-二氯乙烷的生物降解已被证明是可行的，如利用颗粒污泥在UASB反应器中可降解1，2-二氯乙烷，采用硝化生物膜反应器降解1，2-二氯乙烷达到70％-90％的降解率。尽管如此，迄今为止仅分离到少数几株可以以1，2-二氯乙烷为唯一碳源和能源生长并实现降解的菌株，如Xanthobacter autotrophicus GJ10、Ancylobacter aquaticus AD25和Pseudomonas sp.strain DCA。2007年，Olaniran等在纸浆厂的废液中，分离出三株能同时降解1，2-二氯乙烷和1，3-二氯丙烷的菌株Paenibacillusamylolyticus、Bacillus megaterium和Microbacterium oxydans。
目前国内对1，2-二氯乙烷的生物降解研究较少。本发明从环境中筛选到一株能高效降解1，2-二氯乙烷的菌株，为含该类污染物的废水和废气的生物净化工程应用奠定基础。
(三)发明内容
本发明的目的在于针对工程实践中的问题和需求，从环境中分离出一株能够降解1，2-二氯乙烷的新菌株——Starkeya sp.T-2，并提供菌体扩大培养方法，可用于环境中含1，2-二氯乙烷的废水和废气的处理。
本发明采用的技术方案是：
一株1，2-二氯乙烷降解菌——Starkeya sp.T-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期：2011年07月25日，保藏编号：CCTCC NO：M 2011263。
该菌株菌落特征如下：菌体呈短杆状，大小为(0.4～0.8)μm×(0.8～2.0)μm，无芽孢，无鞭毛；菌落呈小圆状、半透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；好氧，氧化酶反应为阳性，吲哚反应、接触酶反应、柠檬酸盐为阳性；M.R反应、V.P.反应为阴性；糖发酵实验为阴性，革兰氏染色为阴性。
本发明所述菌株T-2的筛选过程如下：
(1)采集浙江某化工厂污水处理池的活性污泥，经静置后，除去上层清液和悬浮杂质，留下颗粒细小的污泥，取静置后的下层污泥与新鲜营养液按1∶1(v/v)混合接入至污泥驯化罐，对污泥进行驯化，驯化实验期间对驯化罐进行稳定曝气，控制驯化罐的pH值维持在7.0～8.0，每天加入一定量1，2-二氯乙烷，每隔3天更换一次营养液。
(2)将长期驯化后的活性污泥接种到含50mL无机盐培养基(BSM)的250mL密封盐水瓶中。经过多次传代富集后，进行稀释涂布，依据菌体群落的差异性，挑取单菌落。对单菌落进行多次划线分离后，再接至以1，2-二氯乙烷为唯一碳源和能源的BSM中，测试降解活性。选择具有1，2-二氯乙烷降解能力的单菌落，进一步分离纯化，获得有1，2-二氯乙烷降解活性的纯菌T-2。
本发明所述菌株T-2的鉴定：
(1)所述1，2二氯乙烷降解菌T-2菌落特征如下：菌体呈短杆状，大小为(0.4～0.8)μm×(0.8～2.0)μm，无芽孢，无鞭毛；菌落呈小圆状、半透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；好氧，氧化酶反应为阳性，吲哚反应、接触酶反应、柠檬酸盐为阳性；M.R反应、V.P.反应为阴性；糖发酵实验阴性，革兰氏染色阴性。
(2)所述的菌株T-2的16S rRNA序列分析
细菌总DNA的提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)使用说明进行，对细菌的DNA基因组进行全序列PCR扩增，选用细菌引物BSF27/20和BSR1492/20，序列分别为：BSF27/20<5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′>；BSR1492/20<5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′>，扩增出来的全序列DNA大约在1500bp左右，测序工作由杭州华大基因研发中心完成。菌株的16S rDNA序列如DEQ IDNo.1所示。
对菌株的形态特征及生理生化特征进行研究和分析，将上述特征与《Bergry’s Manual of Systematic Bacteriology》编录的菌属进行比较，结合该菌株的16S rRNA同源性分析，从而确定该菌为Starkeya sp.。该菌株16S rDNA序列的Genebank登录号为JN606070。
本发明还涉及所述的Starkeya sp.T-2在微生物降解1，2-二氯乙烷中的应用。Starkeya sp.T-2能利用1，2-二氯乙烷作为唯一的碳源和能源生长，将1，2-二氯乙烷矿化成CO2和H2O。在25-35℃，120-160r/min纯培养条件下，Starkeya sp.T-2不需要经过诱导即可在24-48h内能将无机盐培养基中200mg/L的1，2-二氯乙烷完全降解。
优选的，所述降解在pH 5～9、20℃～37℃下进行。
所述无机盐培养基(BSM)每1000mL含有：Na2HPO4·12H2O 4.5g、KH2PO41.0g、(NH4)2SO41.8g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl2·2H2O 0.03g，微量元素母液1mL，溶剂为水，pH 7.0。微量元素母液浓度组成：FeSO4·7H2O 1.0g/L、CuSO4·5H2O 0.02g/L、H3BO30.014g/L、MnSO4·4H2O0.10g/L、ZnSO4·7H2O 0.10g/L、Na2MoO4·2H2O 0.02g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L，溶剂为水。
进一步所述的Starkeya sp.T-2菌体扩大培养方法：
(1)斜面培养：将Starkeya sp.T-2活化接种至R2A固体斜面培养基，30～32℃培养36～48h，获得斜面菌体，所述R2A固体斜面培养基终浓度组成为：酵母粉0.50g/L、干酪素0.50g/L、可溶性淀粉0.50g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、胰蛋白胨0.50g/L、葡萄糖0.50g/L、丙酮酸钠0.30g/L、KH2PO40.45g/L，琼脂15～18g/L；pH7.2，溶剂为水；先按如上组成配制成液体培养基，然后再制成斜面；
(2)种子培养：挑取步骤(1)制备的斜面菌体接种至R2A液体培养基，30～35℃培养24～36h，获得种子液，所述R2A富营养培养基为R2A固体培养基中去除琼脂其余各成分一致；
(3)发酵培养：将步骤(2)制备的种子液以5～10％体积比接种量接种至发酵培养基，发酵罐内30～35℃，pH值7.0～8.0，培养24～36h，获得含菌细胞发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母粉0.5g/L，Na2HPO4·12H2O 4.5g/L、KH2PO41.0g/L、(NH4)2SO41.8g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、CaCl20.023g/L，微量元素母液1mL/L，溶剂为水，初始pH值为7.0～7.5；微量元素母液终浓度组成为：FeSO4·7H2O 1.0g/L、CuSO4·5H2O0.02g/L、H3BO30.014g/L、MnSO4·4H2O 0.10g/L、ZnSO4·7H2O 0.10g/L、Na2MoO4·2H2O 0.02g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L，溶剂为水。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株1，2-二氯乙烷的高效降解菌，该菌株为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能够以1，2-二氯乙烷为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底物，本发明为生物法净化含1，2-二氯乙烷废水及废气的工程应用奠定了基础。
(四)附图说明
图1为Starkeya sp.T-2的透射电镜照片；
图2为Starkeya sp.T-2的菌体生长、1，2-二氯乙烷降解、氯离子含量和pH变化曲线图；
图3为不同pH对Starkeya sp.T-2降解1，2-二氯乙烷降解率的影响；
图4为不同温度对Starkeya sp.T-2降解1，2-二氯乙烷降解率的影响；
图5为酵母粉预培养后的Starkeya sp.T-2对1，2-二氯乙烷的降解情况；
图6为Starkeya sp.T-2对不同初始浓度1，2-二氯乙烷的降解；A：50～250mg/L初始底物浓度下1，2-二氯乙烷的降解曲线；B：50～250mg/L初始底物浓度下菌体生长曲线；C：300～1000mg/L初始底物浓度下1，2-二氯乙烷的降解曲线；D：300～1000mg/L初始底物浓度下菌体生长曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中所用无机盐培养基浓度组成为：Na2HPO4·12H2O 4.5g/L、KH2PO41.0g/L、(NH4)2SO41.8g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl20.023g/L，微量元素母液1mL/L，pH 7.0，溶剂为水；微量元素母液组成：FeSO4·7H2O1.0g/L、CuSO4·5H2O 0.02g/L、H3BO30.014g/L、MnSO4·4H2O 0.10g/L、ZnSO4·7H2O 0.10g/L、Na2MoO4·2H2O 0.02g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L，溶剂为水。
所用R2A富营养培养基浓度组成为：酵母粉0.50g/L、干酪素0.50g/L、可溶性淀粉0.50g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、胰蛋白胨0.50g/L、葡萄糖0.50g/L、丙酮酸钠0.30g/L、KH2PO40.45g/L，pH7.2，溶剂为水。
所用发酵培养基浓度组成为：酵母粉0.5g/L，Na2HPO4·12H2O 4.5g/L、KH2PO4 1.0g/L、(NH4)2SO41.8g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2 0.023g/L，微量元素母液1mL/L，溶剂为水，初始pH值为7.0～7.5，微量元素母液组成为：FeSO4·7H2O 1.0g/L、CuSO4·5H2O 0.02g/L、H3BO3 0.014g/L、MnSO4·4H2O 0.10g/L、ZnSO4·7H2O 0.10g/L、Na2MoO4·2H2O 0.02g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L，溶剂为水。
实施例1：Starkeya sp.T-2的分离与鉴定
(1)样品采集及驯化
现场采集浙江某化工厂污水处理池的活性污泥，经静置沉降2h后，除去上层清液和悬浮杂质，留下颗粒细小的污泥，取静置后的下层污泥与新鲜营养液按1∶1(v/v)混合接入至污泥驯化罐，对污泥进行驯化，驯化实验期间对驯化罐进行稳定曝气，控制驯化罐的pH值维持在7.0左右，每天加一定量1，2-二氯乙烷，每隔3天更换一次营养液。数月后，将有降解效果的活性污泥接种到含50mL BSM培养基的250mL密封盐水瓶中，以1，2-二氯乙烷作为唯一碳源和能源，继续培养、富集。实验需恒温(30±1℃)，并保持在好氧条件下进行。
(2)菌株分离与鉴定
将在盐水瓶中经过多次传代富集的混合菌液，进行稀释涂布，依据菌体群落的差异性，挑取单菌落。对单菌落进行多次划线分离后，再接至以1，2-二氯乙烷为唯一碳源和能源的BSM中，测试降解活性。选择具有1，2-二氯乙烷降解能力的单菌落，进一步分离纯化，获得有1，2-二氯乙烷降解活性的纯菌——Starkeya sp.T-2。
菌株Starkeya sp.T-2细胞呈短杆状，大小为(0.4～0.8)μm×(0.8～2.0)μm，无芽孢，无鞭毛；菌落呈小圆状、半透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。
Starkeya sp.T-2的生理生化特征为：好氧，氧化酶反应为阳性，吲哚反应、接触酶反应、柠檬酸盐为阳性；M.R反应、V.P.反应为阴性；糖发酵实验阴性，革兰氏染色阴性。
所述的菌株Starkeya sp.T-2的16S rRNA序列分析
细菌总DNA的提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)使用说明进行，对细菌的DNA基因组进行全序列PCR扩增，选用细菌引物BSF27/20和BSR1492/20，序列分别为：BSF27/20<5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′>；BSR1492/20<5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′>，扩增出来的全序列DNA大约在1500bp左右，测序工作由杭州华大基因研发中心完成。菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
上述特征与文献(《常见细菌鉴定手册》)编录的Starkeya属的生理生化性状相吻合。该菌株经16S rDNA同源性分析，结合以上生理生化的菌学特征，将其鉴定为Starkeya sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2011263，Genebank登录号为JN606070。
实施例2：Starkeya sp.T-2(CCTCC NO：M 2011263)降解1，2-二氯乙烷的性能。
(1)菌株对1，2-二氯乙烷的降解进程
以1，2-二氯乙烷作为Starkeya sp.T-2的唯一碳源，从种子液(无机盐培养基富集培养)中接菌体至新鲜的50mL BSM培养基，使初始菌体浓度(以OD600计)为0.035；加入1，2-二氯乙烷使初始1，2-二氯乙烷浓度为200mg/L。放入温度为30℃、转数为160r/min的摇床中培养，实验过程中，设计2个平行样和一个空白对照(下同)。每隔一段时间取一次样，测定菌体OD、1，2-二氯乙烷降解率、氯离子含量和pH变化，结果见图2。
由图2可见，随着时间的延长，菌体浓度逐渐增大，至20h时，菌体浓度达到最大约为0.15(以OD600计)。本实施例说明降解菌Starkeya sp.T-2可利用1，2-二氯乙烷作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有稳定高效降解1，2-二氯乙烷的能力。
(2)pH对菌株降解性能的影响
用1mol/L NaOH或H2SO4溶液调节BSM培养基为不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，在初始1，2-二氯乙烷浓度为200mg/L的条件下，接入种子液，使各平行样中的初始菌体浓度(以OD600计)为0.01。将样品于30℃、160r/min恒温摇床里振荡培养，培养40h后取样，测反应液中1，2-二氯乙烷降解率，结果见图3。
可见，在pH5.0～9.0时，微生物均能降解1，2-二氯乙烷；随着pH从5.0增大到9.0，1，2-二氯乙烷的降解率先增大后减小，Starkeya sp.T-2降解1，2-二氯乙烷的较适宜的pH值为7.0～8.0。本研究表明菌株在pH5.0～9.0均能不同程度地降解1，2-二氯乙烷，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。
(3)温度对菌株降解性能的影响
在初始1，2-二氯乙烷浓度为200mg/L的BSM培养基中，接入种子液，使各平行样中的初始菌体浓度为0.01(以OD600计)。将各个样品分别置于温度为20℃、25℃、30℃、37℃摇床中恒温振荡培养(摇床转数均为160r/min)，培养48h后取样，测反应液中1，2-二氯乙烷降解率，结果见图4。
由图4可知，在20℃～37℃温度范围内，随着温度从20℃增大到37℃，1，2-二氯乙烷的降解率先增大后减小，Starkeya sp.T-2降解1，2-二氯乙烷较适宜的温度为30℃左右，随着温度的进一步升高或下降，菌株的降解能力开始下降。
(4)非底物诱导培养对菌株降解性能的影响
为了确定Starkeya sp.T-2是否需要经过诱导就可以稳定高效的降解1，2-二氯乙烷，将Starkeya sp.T-2接种到以酵母粉代替1，2-DCA作为碳源的无机盐培养基中，传代培养1代后，将菌体制成菌悬液，该菌悬液作为种子液接种于以1，2-DCA作为唯一碳源和能源的无机盐培养基中，使各平行样中的初始菌体浓度为0.04(以OD600计)，初始1，2-二氯乙烷浓度为250mg/L，于30℃、转数为160r/min的摇床中培养，定时取样测定Starkeya sp.T-2的生长OD600和1，2-二氯乙烷降解速率，结果如图5。
由图5可知，经过酵母粉预培养后的Starkeya sp.T-2仍然能在30h内将初始浓度为250mg/L的1，2-二氯乙烷完全降解，降解前期没有延滞期，说明Starkeya sp.T-2降解1，2-二氯乙烷不需要经过诱导。
(5)底物浓度对菌株降解性能的影响
在较适宜的培养条件(pH7.0，温度30℃)下，研究Starkeya sp.T-2对不同浓度1，2-二氯乙烷的降解。在新鲜无机盐培养基中接种种子液，使各平行样中的初始菌体浓度为0.046(以OD计)，加入不同浓度的底物1，2-二氯乙烷，使底物初始浓度分别为50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L，250mg/L，300mg/L，400mg/L，500mg/L，800mg/L，1000mg/L，30℃、转数为160r/min的摇床中培养，定时取样测定Starkeya sp.T-2的生长OD和1，2-二氯乙烷降解速率，结果如图6。
由图6可知，Starkeya sp.T-2降解1，2-二氯乙烷的降解速率受底物初始浓度的影响较小，可见1，2-二氯乙烷对菌株的毒性较小，且在较高浓度下仍可将其完全降解矿化，但降解至一定浓度后不能再将1，2-二氯乙烷完全降解。
实施例3：Starkeya sp.T-2净化1，2-二氯乙烷废水
在含200mg/L 1，2-二氯乙烷的废水中接种Starkeya sp.T-2菌液(初始菌体浓度以OD600计为0.1)，经过24h的处理后，1，2-二氯乙烷的净化效率达100％。
实施例4：Starkeya sp.T-2净化1，2-二氯乙烷废气
在生物滴滤塔中接种Starkeya sp.T-2菌液(初始菌体浓度以OD600计为0.1)，连续处理浓度为100mg/m3的1，2-二氯乙烷废气。经过20天的挂膜启动后，在停留时间为36s的条件下，1，2-二氯乙烷去除率达92％以上，此后系统能一直稳定运行。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 一株1,2-二氯乙烷降解菌及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 1328
<212> DNA
<213> Starkeya sp.
<400> 1
ggcggggcgg agcttacaca tgcaagtcga acgcaccgca aggtgagtgg cagacgggtg 60
agtaacacgt ggggatctgc ccaatggtac ggaatagctc cgggaaactg gaattaatac 120
cgtatgtgcc cgcaagggga aagatttatc gccattggat gaacccgcgt cggattagct 180
agttggtgtg gtaaaggcgc accaaggcga cgatccgtag ctggtctgag aggatgatca 240
gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 300
gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt 360
aaagctcttt cgccgacgaa gataatgacg gtagtcggag aagaagcccc ggctaacttc 420
gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg ctagcgttgt tcggaatcac tgggcgtaaa 480
gcgcacgtag gcggattgtt aagtcagggg tgaaagcctg gagctcaact ccagaactgc 540
ccttgatact ggcaatctcg agtccggaag aggtaagtgg aactgcgagt gtagaggtga 600
aattcgtaga tattcgcaag aacaccagtg gcgaaggcgg cttactggtc cggtactgac 660
gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 720
aacgatggag gctagccgtt ggtgagcatg ctcatcagtg gcgcagctaa cgcattaagc 780
ctcccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 840
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agcctttgac 900
atgtctcgga attggaccag agatggacca agctcttcgg agccgggaac acaggtgctg 960
catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1020
ctcgccctta gttgccatca ttaagttggg cactctaggg ggactgccgg tgataagccg 1080
agaggaaggt ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta cgggctgggc tacacacgtg 1140
ctacaatggc ggtgacagtg ggatgcgaac ccgcgagggt gagcaaatct ccaaaagccg 1200
tctcagttcg gattgcactc tgcaactcga gtgcatgaag ttggaatcgc tagtaatcgt 1260
gggagttggc tttacccgaa ggcgctgcgc taacccgcaa gggaggcagc gaccatcgta 1320
tttccggt 1328
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (5)
1.一株1,2-二氯乙烷降解菌Starkeya sp. T-2，其特征在于，菌株保藏号为CCTCC NO：M 2011263， 2011年07月25日在中国典型培养物保藏中心保藏。
2.如权利要求1所述的Starkeya sp. T-2，其特征在于所述Starkeyasp. T-2菌落特征如下：菌体呈短杆状，大小为（0.4~0.8）μm×（0.8~2.0）μm，无芽孢，无鞭毛；菌落呈小圆状、半透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；好氧，氧化酶反应为阳性，吲哚反应、接触酶反应、柠檬酸盐为阳性；M.R反应、V.P.反应为阴性；糖发酵实验为阴性，革兰氏染色为阴性。
3.如权利要求1所述的Starkeya sp. T-2，其特征在于所述Starkeyasp. T-2 16S rDNA序列如SEQ ID No. 1所示。
4.如权利要求1所述的Starkeya sp. T-2在微生物降解1,2-二氯乙烷中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述降解在pH 5~9、20℃~37℃下进行。
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