CN104726363B - 产碱杆菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产碱杆菌菌株及其应用，属于环境微生物应用领域，该产碱杆菌菌株命名为产碱杆菌(Alkaligenes sp.)SY1，现保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2014619，保藏日期为2014年12月3日。本发明提供了一种高效降解甲硫醚的产碱杆菌菌株，该菌株为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，有较强的环境适应能力，能够以甲硫醚为唯一碳源和能源，将甲硫醚完全矿化成CO2和H2O；在培养基pH为6.0～8.0的条件下，该菌株能将90mg/L甲硫醚完全降解，可用于净化含甲硫醚的废水和废气，进行废水的修复和受污染后环境的生物处理。

Description

产碱杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及环境微生物应用领域，尤其涉及一种产碱杆菌菌株及其应用。
背景技术
甲硫醚，又称为二甲(基)硫(Dimethyl sulfide，(CH3)2S，DMS)，沸点为37.5℃，熔点为-83℃。甲硫醚是一种无色、易挥发、具有强烈特殊气味的可燃性液体，是工业上常用的一种有机溶剂，如有机合成、聚合反应、合成纤维纺丝等工业的溶剂等，广泛应用于化学合成的原料、工业试剂、医药中间体等；还可作为城市煤气、天然气的臭味剂(警戒气)、涂料脱膜剂、电池防腐剂等。
然而，在使用过程中，甲硫醚可以通过废气和废水的形式排放进入环境中，对环境造成严重而长期的污染。甲硫醚能够刺激和引起肝、肾和肾上腺的损害，对皮肤、黏膜、胃肠道也有刺激作用，可引起呼吸道反应、接触性皮炎及肺水肿等，该物质容易氧化成一种潜在的诱变剂和致癌物质DMSO，对人类健康产生严重的威胁。甲硫醚对大气臭氧层也有极强的破坏力。由于甲硫醚的广泛应用以及它的特殊性恶臭气味，研发出经济又有实效的处理甲硫醚的方法已经成为国际上环境污染控制领域的研究热点。
目前，甲硫醚的生物降解已被证明是可行的，例如：利用颗粒污泥在BTF反应器中可降解甲硫醚，采用生物滴滤反应器降解甲硫醚可达到70～90％的降解率。
授权公告号CN1089021C的专利文献公开了一种含硫恶臭气体的净化方法，该方法将废气通过一个装有固载化硫杆菌填料的填料塔，保持填料湿度20～80w％，使废气与硫杆菌充分接触降解硫化物。由于填料层处于非液相状态，有利于废气与硫杆菌的接触和扩散，因此，该方法不仅净化率高，而且净化过程中除喷淋营养液外不加任何化学药品，降低了原料消耗的二次污染。
申请公布号为CN104001413A的专利文献公开了一种化工区污水厂恶臭气体的处理方法，该方法包含了化学吸收、生物氧化和吸附；所述的化学吸收步骤包括将含化工区污水厂恶臭气体进入化学洗涤塔，与洗涤塔中的洗涤液并流或逆流接触，以吸收、氧化和增湿所述恶臭气体；所述生物氧化步骤包括将所述恶臭气体从洗涤塔排出，进入生物滤塔底部或顶部，在上升或下降过程中与接种在填料表面的微生物接触；所述吸附步骤包括将被生物降解后的所述恶臭气体从滤塔顶部或底部排出，进入吸收装置由吸附剂进一步净化后排放。该方法具有工艺流程简洁，操作简单，投资运行费用低，处理效率高，无二次污染等特点。
尽管如此，迄今为止在环境微生物应用领域中，研究者们仅分离到少数几株可以以甲硫醚为唯一碳源，并作为能源生长，实现甲硫醚降解的菌株，如：Methylotrophs sp.、Hyphomicrobium sulfidovorans和Methylomicrobium sp.。2010年，Chung等人在活性污泥中分离出两株能同时降解甲硫醚和二甲基亚砜的菌株Pseudomonas putida和Acinetobacter sp.。目前，国外内对甲硫醚的生物降解研究较少，有必要从环境中筛选能够降解甲硫醚的菌株，为含甲硫醚污染物的废水和废气的生物净化工程应用奠定基础。
发明内容
本发明提供了一种产碱杆菌菌株及其应用，该菌株能高效降解废水或废气中的甲硫醚，可应用于含甲硫醚的废水和废气的处理工艺中。
一种产碱杆菌菌株，命名为产碱杆菌(Alkaligenes sp.)SY1，保藏编号为CCTCCNO:M 2014619，保藏日期为2014年12月3日。
所述的产碱杆菌菌株于2014年12月3日保藏在中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2014619，保藏日期为2014年12月3日。
所述的产碱杆菌(Alkaligenes sp.)SY1的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
所述的产碱杆菌(Alkaligenes sp.)SY1的生物学特征为：菌体呈椭圆状，大小为(0.3～0.6)μm×(0.8～2.0)μm，无芽孢，有鞭毛；菌落呈小圆状、半透明、形态饱满、有荧光、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。
所述的产碱杆菌(Alkaligenes sp.)SY1的生理生化特征：好氧，氧化酶反应为阳性，吲哚反应、接触酶反应、柠檬酸盐为阳性；M.R反应、V.P.反应为阴性；糖发酵实验为阴性，革兰氏染色为阴性。
本发明提供了一种产碱杆菌菌株的培养方法，将所述的产碱杆菌菌株活化后，接种到温度为15～37℃、pH值为6.0～8.0的培养基中培养。该条件下培养得到的产碱杆菌菌株对甲硫醚的降解能力强。
本发明还提供了一种所述的产碱杆菌菌株在处理甲硫醚废水或甲硫醚废气中的应用。所述的应用，包括：将所述的产碱杆菌菌株制成菌液后接种到甲硫醚废水中，进行生化处理；或者，将所述的产碱杆菌菌株挂膜固定化后，进行生化处理。
本发明还提供了一种包含所述的产碱杆菌菌株的菌剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种能够高效降解甲硫醚的产碱杆菌菌株，该菌株为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，有较强的环境适应能力，能够以甲硫醚为唯一碳源和能源，将甲硫醚完全矿化成CO2和H2O；在培养基pH为6.0～8.0的条件下，该菌株能将90mg/L甲硫醚完全降解，可用于净化含甲硫醚的废水和废气，进行废水的修复和受污染后环境的生物处理。
附图说明
图1为本发明产碱杆菌菌株Alkaligenes sp.SY1的透射电镜照片；
图2为本发明产碱杆菌菌株Alkaligenes sp.SY1的菌体生长、甲硫醚降解变化曲线图；
图3为不同培养基pH值对产碱杆菌菌株Alkaligenes sp.SY1甲硫醚降解率的影响；
图4为不同培养温度对产碱杆菌菌株Alkaligenes sp.SY1甲硫醚降解率的影响；
图5为本发明产碱杆菌菌株Alkaligenes sp.SY1对不同初始浓度甲硫醚的降解情况。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
产碱杆菌Alkaligenes sp.SY1菌株的扩大培养方法：
(1)斜面培养：将产碱杆菌Alkaligenes sp.SY1活化接种至R2A固体斜面培养基中，30～32℃下培养36～48h，获得斜面菌体；所述R2A固体斜面培养基终浓度组成为：酵母粉0.50g/L、干酪素0.50g/L、可溶性淀粉0.50g/L、MgCl2·7H2O 0.05g/L、胰蛋白胨0.50g/L、葡萄糖0.50g/L、丙酮酸钠0.30g/L、KH2PO40.45g/L，pH7.2，溶剂为水；琼脂15～18g/L；
(2)种子培养：挑取步骤(1)制备的斜面菌体接种至R2A液体培养基，28～32℃培养24～36h，获得种子液，所述R2A富营养培养基为R2A固体培养基中去除琼脂其余各成分一致；
(3)发酵培养：将步骤(2)制备的种子液以5～10％接种量接种至发酵培养基，发酵罐内28～32℃，pH值6.0～8.0，培养24～36h，获得含菌细胞发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母粉0.5g/L,Na2HPO4·12H2O 4.5g/L、KH2PO41.0g/L、NH4Cl 1.8g/L、MgCl2·7H2O0.2g/L、CaCl20.023g/L，微量元素母液1mL/L，溶剂为水，初始pH值为7.0-7.5，微量元素母液终浓度组成为：FeCl2·7H2O 1.0g/L、CuCl2·5H2O 0.02g/L、H3BO30.014g/L、MnCl2·4H2O0.10g/L、ZnCl2·7H2O 0.10g/L、Na2MoO4·2H2O 0.02g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L。
无机盐培养基浓度组成为：Na2HPO4·12H2O 4.5g/L、KH2PO41.0g/L、NH4Cl 1.8g/L、MgCl2·7H2O 0.2g/L、CaCl20.023g/L，微量元素母液1mL/L，pH 7.0，溶剂为水，所述微量元素母液组成：FeCl2·7H2O 1.0g/L、CuCl2·5H2O 0.02g/L、H3BO30.014g/L、MnCl2·4H2O0.10g/L、ZnCl2·7H2O 0.10g/L、Na2MoO4·2H2O 0.02g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L。
实施例1产碱杆菌Alkaligenes sp.SY1的分离与鉴定
(1)样品的采集及驯化
现场采集浙江某制药化工厂污水处理池的活性污泥，经静置沉降2h后，除去上层清液和悬浮杂质，留下颗粒细小的污泥，取静置后的下层污泥与新鲜营养液按1:1(v/v)混合接入至污泥驯化罐，对污泥进行驯化，驯化实验期间对驯化罐进行稳定曝气，控制驯化罐的pH值维持在7.0左右，每天加一定量甲硫醚，每隔3天更换一次营养液。数月后，将有降解效果的活性污泥接种到含50mL MM培养基的250mL密封盐水瓶中，以甲硫醚作为唯一碳源和能源，继续培养、富集。实验需恒温(30±1℃)，并保持在好氧条件下进行。
(2)菌株分离与鉴定
将在盐水瓶中经过多次传代富集的混合菌液，进行稀释涂布，依据菌体群落的差异性，挑取单菌落。对单菌落进行多次划线分离后，再接至以甲硫醚为唯一碳源和能源的无机盐培养基(MM)中，测试降解活性。选择具有甲硫醚降解能力的单菌落，进一步分离纯化，获得有甲硫醚降解活性的纯菌。
菌株Alkaligenes sp.SY1细胞菌体呈椭圆状，大小为(0.3～0.6)μm×(0.8～2.0)μm，无芽孢，有鞭毛；菌落呈小圆状、半透明、形态饱满、有荧光、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。
Alkaligenes sp.SY1的生理生化特征为：好氧，氧化酶反应为阳性，吲哚反应、接触酶反应、柠檬酸盐为阳性；M.R反应、V.P.反应为阴性；糖发酵实验为阴性，革兰氏染色为阴性。
细菌总DNA的提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)使用说明进行，对细菌的DNA基因组进行全序列PCR扩增，选用细菌引物BSF27/20和BSR1492/20，序列分别为：
BSF27/20<5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'>(SEQ ID NO:2)；
BSR1492/20<5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'>(SEQ ID NO:3)；
经测序获得到长度为1437bp的16S rDNA序列(SEQ ID NO:1)，测序工作由杭州华大基因研发中心完成。
上述特征与文献(《常见细菌鉴定手册》)编录的Alkaligenes属的生理生化性状相吻合。该菌株经16S rDNA同源性分析，结合以上生理生化的菌学特征，将其鉴定为产碱杆菌属Alkaligenes sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年12月3日，保藏编号为CCTCC NO:M 2014619，Genebank登录号为KP162176。
实施例2 Alkaligenes sp.SY1(CCTCC NO：M 2014619)降解甲硫醚的性能
以甲硫醚作为Alkaligenes sp.SY1的唯一碳源，从种子液(无机盐培养基富集培养)中接菌体至新鲜的50mL MM培养基，使初始菌体浓度(以OD600计)为0.015；加入甲硫醚使初始甲硫醚浓度为60mg/L。放入温度为30℃、转数为180r/min的摇床中培养，每隔一段时间取一次样，测定菌体OD、甲硫醚降解率、氯离子含量和pH变化，结果见图2。实验过程中，设计2个平行样和一个空白对照(下同)。随着时间的延长，菌体浓度逐渐增大，至40h时，菌体浓度达到最大约为80mg/L(以OD换算)。本实施例说明降解Alkaligenes sp.SY1可利用甲硫醚作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有稳定高效降解甲硫醚的能力。
用1mol/L NaOH或HCl溶液调节MM培养基为不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，在初始甲硫醚浓度为50mg/L的条件下，接入种子液，使各平行样中的初始菌体浓度(以OD计)为0.01。将样品于30℃、180r/min恒温摇床里振荡培养，培养40h后取样，测反应液中甲硫醚降解率，结果见图3。可见，在pH 5.0～9.0时，微生物均能降解甲硫醚；随着pH从5.0增大到9.0，甲硫醚的降解率先增大后减小，Alkaligenes sp.SY1降解甲硫醚的较适宜的pH值为6.0～8.0。本研究表明菌株在pH 6.0～8.0均能不同程度地降解甲硫醚，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。
在初始甲硫醚浓度为50mg/L的MM培养基中，接入种子液，使各平行样中的初始菌体浓度为0.01(以OD计)。将各个样品分别置于温度为15℃、20℃、25℃、30℃、37℃摇床中恒温振荡培养(摇床转数均为180r/min)，培养12h后取样，测反应液中甲硫醚降解率。由图4可知，在15℃～37℃温度范围内，随着温度从15℃增大到37℃，甲硫醚的降解率先增大后减小，Alkaligenes sp.SY1降解甲硫醚较适宜的温度为30℃左右，随着温度的进一步升高或下降，菌株的降解能力开始下降。
为了确定Alkaligenes sp.SY1是否需要经过诱导就可以稳定高效的降解甲硫醚，将Alkaligenes sp.SY1接种到以酵母粉代替甲硫醚作为碳源的无机盐培养基中，传代培养1代后，将菌体制成菌悬液，该菌悬液作为种子液接种于以甲硫醚作为唯一碳源和能源的无机盐培养基中，使各平行样中的初始菌体浓度为0.04(以OD计)，初始甲硫醚浓度为25、50、75mg/L，于30℃、转数为180r/min的摇床中培养，定时取样测定Alkaligenes sp.SY1的生长OD和甲硫醚降解速率，结果如图5，由图可知，经过酵母粉预培养后的Alkaligenes sp.SY1仍然能在90h内将初始浓度为50mg/L的甲硫醚完全降解，降解没有明显延滞期，说明Alkaligenes sp.SY1降解甲硫醚不需要经过诱导。
在较适宜的培养条件(pH 7.0，温度30℃)下，研究Alkaligenes sp.SY1对不同浓度甲硫醚的降解。在新鲜无机盐培养基中接种种子液，使各平行样中的初始菌体浓度为0.015(以OD计)，加入不同浓度的底物甲硫醚，使底物初始浓度分别为25、50、75mg/L，30℃、转数为180r/min的摇床中培养，定时取样测定Alkaligenes sp.SY1的生长OD和甲硫醚降解速率。结果如图5可知，Alkaligenes sp.SY1降解甲硫醚的降解速率受底物初始浓度的影响较小，可见甲硫醚对菌株的毒性较小，且在较高浓度下仍可将其完全降解矿化，但降解至一定浓度后不能再将甲硫醚完全降解。
实施例3 Alkaligenes sp.SY1净化甲硫醚废水
在含50mg/L甲硫醚的废水中接种Alkaligenes sp.SY1菌液，经过24h的处理后，甲硫醚的净化效率达100％。
实施例4 Alkaligenes sp.SY1净化甲硫醚废气
在生物滴滤塔中接种Alkaligenes sp.SY1菌液，连续处理浓度为100mg/m3的甲硫醚废气。经过20天的挂膜启动后，在停留时间为36s的条件下，甲硫醚去除率达92％以上，此后系统能一直稳定运行。

Claims (8)

1.一种产碱杆菌菌株，其特征在于，命名为产碱杆菌(Alkaligenes sp.)SY1，保藏编号为CCTCC NO:M 2014619，保藏日期为2014年12月3日。
2.如权利要求1所述的产碱杆菌菌株，其特征在于，所述的产碱杆菌(Alkaligenessp.)SY1的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的产碱杆菌菌株，其特征在于，所述的产碱杆菌(Alkaligenessp.)SY1的生物学特征为：菌体呈椭圆状，大小为(0.3～0.6)μm×(0.8～2.0)μm，无芽孢，有鞭毛；菌落呈小圆状、半透明、形态饱满、有荧光、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；革兰氏染色反应呈阴性。
4.一种产碱杆菌菌株的培养方法，其特征在于，将权利要求1所述的产碱杆菌菌株活化后，接种到温度为15～37℃、pH值为6.0～8.0的培养基中培养。
5.如权利要求1所述的产碱杆菌菌株在处理甲硫醚废水或甲硫醚废气中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：将所述的产碱杆菌菌株制成菌液后接种到甲硫醚废水中，进行生化处理。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：将所述的产碱杆菌菌株挂膜固定化后，进行生化处理。
8.一种包含权利要求1所述的产碱杆菌菌株的菌剂。
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