CN104388334A - 一种液态复合菌剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种液态复合菌剂的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及液态复合菌剂的制备：1）取 Pseudomonasveronii ZW， Ralstoniapickettii L2， Pandoraeapnomenusa LX-1， Zoogloearesiniphila HJ1， Staphylococcuspasteuri LWX接种至无机盐液培养基，分别以α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷、邻二甲苯、乙酸为唯一碳源培养得各菌悬液；2）各菌悬液离心洗涤稀释后等体积混合得接种液；3）配制无机盐培养液pH6.8-7.5，在α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷、邻二甲苯的混合物中接入接种液，30℃培养24-48h；4）加入酵母粉和蛋白胨4℃保存。本发明制备简单，自动调节pH。

Description

一种液态复合菌剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于环境污染治理领域，涉及了一种液态复合菌剂的制备方法及其应用。 
背景技术
近年来，挥发性有机污染物（Volatile organic compounds, VOCs）引起的环境污染问题日益严重。特别是工业生产过程排放的多组分VOCs，具有毒性高、难降解等特点，危害着生态环境和人类健康。因此，防治VOCs污染具有非常重要的意义。 
目前处理VOCs的技术主要有吸附法、燃烧法、吸收法等，但这些技术均存在投资费用高、操作过程复杂、能耗大等弊端。生物净化能有效处理低浓度大气量的VOCs，且不产生二次污染问题，近年来受到了研究者的广泛重视。特定的降解菌对单一废气净化效果较好，但对于那些成分复杂的工业废气，单一微生物无法完全净化。因此，构建由几种微生物组成的复合菌剂，对于净化多组分工业废气，具有非常重要的现实意义。 
复合菌剂的概念最早是在生物学领域提出的，最初复合菌剂主要应用于农业，其目的是为了达到现代农业生产的优质、高产、低耗、高效，实现农业生产及其环境的稳定平衡。菌剂在环保领域的应用最早是用来处理一些较容易降解的污染物，如禽畜粪便、居民生活废水和市政管网污水等等。随着一些难降解有机物的特征降解菌获得，构建的复合微生物菌剂开始应用于垃圾渗滤液、炼油废水的无害化处理。 
专利号为201210573242.0，名称为“苯系物复合降解菌和固定化苯系物复合菌剂及其制备方法”的中国专利中公开了一种复合菌剂及其制备方法：恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）RW10S2、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ND6和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）BIRD-1的混合物，将上述苯系物复合降解菌固定在可漂浮易降解的固定化载体上，得固定化苯系物复合菌剂，可以广泛应用于去除垃圾渗滤液中的苯系物，还可以用于治理苯系物污染的水体。上述现有技术属于固态复合菌剂，其包含的多种降解菌都只用于降解苯系物，对其他污染物无效。而且因为所选用的菌剂载体为木片等固形漂浮物，尺寸较大，无法直接运用在气态污染物的处理，所以只适合处理液态污染物如垃圾渗滤液等。另外，所制备的固态菌剂只能净化苯系物，因而其应用范围有限。 
用于气态污染物的复合菌剂构建方法国内外鲜有报道。专利号ZL200810163160.2的专利“降解‘三苯’VOCs废气复合微生物菌剂的制备方法”，公开了一种复合固态复合菌剂的构建方法及其在三苯废气治理中的应用。固态菌剂保存时间长，保存方法简单，但也存在一些弊端，如制备方法复杂、单位体积菌剂所含的活性微生物数量不多、使用过程特别是微生物活性复原阶段时间较长等。 
专利号为201110218629.X，专利名称为“一种复合微生物菌剂及其固定化方法与应用”的中国专利中公开了一种复合微生物菌剂及其固定化方法和应用,所述的复合微生物菌剂由人苍白杆菌B3(Ochrobactrum sp.B3)含菌细胞菌悬液和根瘤杆菌T3(Rhizobium sp.T3)含菌细胞菌悬液组成,所述的复合微生物菌剂中人苍白杆菌B3菌体浓度为0.15～0.2g/L,所述的根瘤杆菌T3的菌体浓度为0.15～0.2g/L，其制备方法：用固定化方法以海藻酸钠-PVA的水溶液为复合载体，以人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液为复合微生物菌剂，于交联剂中进行细胞固定化，获得人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂的固定化细胞；所述的复合载体中海藻酸钠与PVA和水的投料质量比为1:3.5：:45.5，所述的复合载体与复合微生物菌剂质量比为200~300:1；所述的复合微生物菌剂为菌体浓度0.4~0.5g/L人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与菌体浓度0.4~0.5g/L根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液等体积混合的菌剂，所述的交联剂为氯化钙、硼酸钙混合水溶液，所述交联剂中氯化钙、硼酸钙的质量浓度分别为10g/L、40g/L。所述的复合微生物菌剂重复使用多次仍能保持对H2S废气的高效降解。上述复合微生物菌剂虽然用于净化气态污染物，但是制备过程中采用注射器或滴管，无法在短时间内制备大量菌剂，限制了其在实际中的应用；制备过程中采用了交联剂PVA等化学药品，可能会对微生物产生毒害效应，影响微生物的活性；同时，由于降解菌是被包裹在由海藻酸钠、PVA等形成的凝胶小球中，不是和污染物直接接触，因此会影响污染物的传质效果，进而影响降解效率；此外，该菌剂由硫化氢的降解菌组成，只能净化硫化氢废气，因而其应用范围有限。 
通常，菌株在降解有机污染物时所需的环境要求为弱酸性或中性（pH6.5-7.5），但由于菌株在代谢这些有机污染物的时候会产生一定量的小分子有机酸（如甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸等），使得培养体系呈酸性，因此需要在代谢过程中人为额外定期调整体系的pH值，否则无法维持正常的代谢活动。这是目前生物降解中普遍存在的弊端。若菌剂制备过程中能选取具有代谢小分子有机酸的菌株，则能很好地解决这一问题。在使用过程中该菌株能立即代谢其他菌株产生的小分子有机酸，维持整个体系呈弱酸性或中性，保证其他菌株正常的代谢活动，无需额外添加碱液调节体系的pH。 
因此，能自动调节pH的液态菌剂若能研制成功，即可弥补固态菌剂的不足（制备过程复杂、菌剂降解活性不高、单位体积菌剂活菌数有限等），对于气态污染物的高效处理具有重要的现实意义。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足而提供一种制备过程简单，降解活性保持时间长，且活性复原时间短，能自动调节pH的适合工业规模化应用的液态复合菌剂的制备方法。 
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：该液态复合菌剂的制备方法,其特征在于：1）选取菌株接种至无机盐液培养基，所述的菌株为以α-蒎烯为碳源筛选得到的降解菌Pseudomonas veronii ZW，以1-氯苯为碳源筛选得到的降解菌Ralstonia pickettii L2，以二氯甲烷为碳源筛选到的降解菌Pandoraea pnomenusa LX-1，以邻二甲苯为碳源筛选到的降解菌Zoogloea resiniphila HJ1，以小分子有机酸为碳源筛选到的降解菌Staphylococcus pasteuri LWX，分别以α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷、邻二甲苯和乙酸为唯一碳源进行培养，从而获得不同菌株的菌悬液；2）各种菌的菌悬液离心、洗涤、稀释后获得菌体浓度值相等的各种菌的菌液，将这些菌液等体积混合均一，获得液态复合菌剂的接种液；3）配制无机盐培养液，pH6.8-7.5，以α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷和邻二甲苯的混合化合物为底物，接入接种液，摇床振荡培养或发酵罐培养，温度控制在30℃，培养24-48h后获得处于生长对数期的菌液；4）加入酵母粉和蛋白胨,便得液态复合菌剂，冰箱4℃保存。上述制备方法的优点是能在短时间内获得大量目标降解菌，在低温情况下能长时间保持降解菌的活性，经低温保藏后能在短时间内菌剂能恢复降解活性，且后期使用过程中无需添加碱液来调节培养体系的pH。 
本发明所述的无机盐培养液其配方为（g/L）:KH2PO4 0.376，K2HPO4·3H2O 0.456，(NH4)2SO4 0.484，NaNO3 0.68，Mg(NO3)2 0.256，CaCl2 0.011，MnCl2·H2O 0.06，ZnCl2 0.088，KI 0.01，NaMoO4·2H2O 0.1，H3BO3 0.05，pH=7.2。上述配方的优点是仅由一些无机盐组成，能快速促进微生物的生长。 
本发明所述的各种菌的菌悬液在12000g条件下离心后，收集菌体，并用无菌水洗涤3次，加入一定体积的无菌水，获得菌体浓度值相等的各种菌的菌液，浓度范围为500mg/L-2g/L的，将这些菌液以等体积混合均一，获得液态复合菌剂的接种液。上述工艺条件制得的液态复合菌剂的接种液其优点是单位体积内所含的有效活菌数量多。 
本发明所述的酵母粉添加浓度为500mg/L-2g/L，蛋白胨添加浓度为500mg/L-2g/L,上述浓度的酵母粉及蛋白胨其作用和好处是能在保藏温度下作为菌种的有效碳源，保持菌种的活性；同时，低浓度的酵母粉及蛋白胨能保证菌种较慢的生长速率，不会因较快的生长速率而出现菌株大量衰亡的情况。 
本发明所述的菌株Staphylococcus pasteuri LWX降解其他共存菌株代谢有机物产生的小分子有机酸，小分子有机酸包括甲酸、乙酸、丙酸等。本发明所述制备的液态复合菌剂在选择菌株方面具有特殊性，除了选择具有工业常见污染物降解能力的菌株外，还选择了一株具有小分子有机酸降解能力的菌株。该菌株能以其他共存菌株代谢有机污染物产生的有机小分子酸为底物，维持整个培养体系呈弱酸性或中性，保证其他共存菌株的正常代谢活性。 
本发明所述方法制备的液态复合菌剂在苯类及含氯VOCs气体的污染治理中的应用，反应器启动时间与采用活性污泥的反应器相比缩短50%以上，在使用过程中无需调节体系的pH。本发明所述方法制备的液态复合菌剂单位体积活菌数多、活性高，能广泛用于工业废气的高效净化，加快生物膜的形成，缩短反应器的启动时间。 
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明所述的液态复合菌剂制备过程简单，无需菌剂载体，菌株培养液即为菌剂载体，且制备过程中不添加任何化学药品，对菌株的生长及降解活性影响较小；制备的液态复合菌剂单位体积活菌数量大、降解活力高、低温下保存时间长，且经过低温保存后液态菌剂在短时间内恢复降解活力，能应用于工业废气生物净化处理，使用过程中无需调节pH，特别适合需要在短时间内达到一定去除效果的废气生物净化反应器。 
附图说明
图1为本发明制备流程图。 
图2为本发明所述的液态复合菌剂的降解活性稳定性测试试验结果。 
图3为本发明所述液态复合菌剂结合驯化活性污泥启动废气净化装置的试验结果。 
图4为驯化活性污泥启动废气净化装置的试验结果。 
具体实施方式
本发明涉及的各种微生物均保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉）。它们是：以α-蒎烯为碳源筛选得到的降解菌Pseudomonas veronii ZW，保藏号M209313，其在公开号为101838623A的中国专利中已公开。 
以1-氯苯为碳源筛选得到的降解菌Ralstonia pickettii L2，保藏号M209313，其在公开号为101880642A的中国专利中已公开。 
以二氯甲烷为碳源筛选到的降解菌Pandoraea pnomenusa LX-1，保藏号M2011242，其在申请号为 102533586A的中国专利中已公开。 
以邻二甲苯为碳源筛选到的降解菌Zoogloea resiniphila HJ1，保藏号M2012235，其在公开号为103451127A的中国专利中已公开。 
以小分子有机酸为碳源筛选到的降解菌Staphylococcus pasteuri LWX，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：M 2014259，保藏日期：2014年6月15日。 
降解菌Staphylococcus pasteuri LWX的分离、纯化和鉴定过程如下。 
将某城市污水处理厂污泥空气曝气三天后，取50mL上清液进行离心，将底部活性污泥置于只含乙酸的无机盐培养基中进行驯化培养，乙酸的浓度由低到高（50～200mg/L），使乙酸为其主要生长碳源，让其逐渐适应酸性环境。驯化一个月左右，每隔一定时间，测水中乙酸根离子及水中总有机碳的数量，以判断菌种是否能降解乙酸。待明显出现乙酸浓度下降的情况，取出200mL混合液涂布于只含有乙酸的固体无机盐培养基上，连续划线分离，最终获得纯化菌株，接种到斜面培养基中，在4℃的冰箱中保存。 
利用16S rRNA技术对菌株进行基因序列同源性分析，并构建系统发育树进行鉴定。将测得的基因序列同NCBI数据库中的基因序列进行Blast对比。结果表明LWX菌株的序列与菌株Staphylococcus sp.PSB-21(KF761522.1)、Staphylococcuspasteuri strain NM71-3(HM218325.1)序列具有100% 的同源性。从结果中选取Staphylococcus genera 具有代表性的菌株，以基因序列同源性为基础，结合采用Clustal X2. 0 和MEGA4.0(1000次抽样分析) 软件构建系统发育树。通过遗传距离及序列对比，鉴定为葡萄球菌（Staphylococcus genera），Genebank登录号KM243643。 
该菌株的其他基本特性如下：菌落呈白色，边缘整齐，光滑湿润，圆形；透射电镜下观察该菌体的形态为短杆菌，没有鞭毛，革兰氏染色阳性，甲基红阳性，淀粉水解和吲哚试验阴性。 
实施例1 
参见图1，本发明所述复合菌剂制备方法如下：
（1）菌株菌悬液获得
从保藏培养基上挑取上述菌落接种至无机盐液培养基，分别以α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷、邻二甲苯和乙酸为唯一碳源培养48-64h后，获得不同菌株的菌悬液。
所述的无机盐培养液（g/L）:KH2PO4 0.376，K2HPO4·3H2O 0.456，(NH4)2SO4 0.484，NaNO3 0.68，Mg(NO3)2 0.256，CaCl2 0.011，微量元素（MnCl2·H2O 0.06，ZnCl2 0.088，KI 0.01，NaMoO4·2H2O 0.1，H3BO3 0.05），pH=7.2。 
（2）混合菌种液的获得 
各种菌的菌悬液在12000g条件下离心后，收集菌体，并用无菌水洗涤3次，加入一定体积的无菌水，获得菌体浓度值相等的各种菌的菌液，浓度范围为50 mg/L-100mg/L，将这些菌液以等体积混合均一，获得液态复合菌剂的接种液。
（3）液态复合菌剂的制备 
按照步骤（1）中配方，配制一定体积的无机盐培养液，调整pH6.8-7.5，以混合化合物（α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷、邻二甲苯）为底物，接入接种液，摇床振荡培养（或发酵罐培养），温度控制在30℃，培养24-48h后获得处于生长对数期的菌液。此时加入酵母粉800mg/L，蛋白胨600mg/L，便得液态复合菌剂，放于冰箱4℃保存。上述浓度的酵母粉和蛋白胨，既能作为碳源保持各个菌株的活性，又能避免菌株因较快的生长速率而出现大量衰亡的情况。
实施例2 
将制备的液态复合菌剂放置冰箱（4℃）中，分别保存1周、2周、4周和8周，通过平板计数法考察液态菌剂中活性菌的数量，结果如表1所示。刚制备好的液态菌剂所含的有效活菌数分别为7.6×109 CFU/mL。经过不同时间保存后对应的活菌数量略微下降，且随着保存时间的增加，下降趋势明显，但总体上维持在108CFU/mL以上。复合液态菌剂活菌数量衰减较小，这可能是由于低温时菌活性较小，同时酵母粉和蛋白胨能作为碳源在低温时维持菌株的活性，使菌剂活性得到最大的保留、有效保存时间得到延长。
表1 复合微生物菌剂活菌数量随时间变化情况。 
  初始 1周 2周 4周 8周
菌落数（×108 CFU/g ） 76 32 14 8 2.4
实施例3 
将制备的液态复合菌剂放置冰箱（4℃）中，分别保存1周、2周、4周和8周后测试菌剂的降解活性。具体步骤如下：将液态复合菌剂取出后，室温放置至常温，在12000g条件下离心后，收集菌体，并用无菌水洗涤3次，接种至无机盐液体培养基，加入混合有机污染物（α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷、甲苯），每种污染物浓度100mg/L。置于摇床振荡培养，温度30℃，培养48h后分析液体中各污染物的浓度，结果如图2所示。
可以看出，液态菌剂在4℃保存1周和2周后，降解活性几乎没有变化，表明降解稳定性较好；保存4周和8周后，对于1-氯苯的降解活性下降得较为明显，而其他污染物的降解活性略微下降。总体上，液态复合菌剂还是较好得保存了各菌株的降解活性。同时，对培养体系的pH进行了监测，发现pH先下降至5.7，后始终维持在6.9-7.2，说明了前期选择的Staphylococcus pasteuri LWX发挥了作用，代谢了其他菌株在降解α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷、甲苯过程中产生的小分子有机酸。而没有该菌株的培养体系，需要定期调节pH至弱酸性或中性，否则其代谢污染物的能力会受到严重的影响。 
实施例4 
将制备的液态复合菌剂放置冰箱（4℃）中，保存1周后取出，测试其对其它VOCs的净化效果。选择的VOCs有苯、乙苯、二氯乙烷、1,2-二氯苯。具体步骤如下：将液态复合菌剂取出后，室温放置至常温，在12000g条件下离心后，收集菌体，并用无菌水洗涤3次，接种至无机盐液体培养基，分别加入有机污染物（苯、乙苯、二氯乙烷、1,2-二氯苯），每种污染物浓度100mg/L。置于摇床振荡培养，温度30℃，培养48h后分析液体中各污染物的浓度，结果如表2所示。
可以看出，液态复合菌剂对于这四种底物均有一定的降解效果：对苯和乙苯的降解效果要优于二氯乙烷和1,2-二氯苯，其原因可能是二氯乙烷和1,2-二氯苯的可生物降解性极差。总体上，液态复合菌剂还是对苯、乙苯、二氯乙烷、1,2-二氯苯等VOCs有一定的去除效果，可广泛用于工业废气中苯类及含氯VOCs的有效处理。 
表2 液态复合菌剂对工业废气中常见物质的去除效果。 
  苯 乙苯 二氯乙烷 1,2-二氯苯
去除率/% 85 80 54 52
实施例5 
将制备的液态复合菌剂放置冰箱（4℃）中，保存1周后取出，进行废气净化装置的启动考察。废气净化装置由配气系统、生物滴滤塔（床）和检测分析系统三部分组成。生物滴滤塔（床）采用有机玻璃制成，内置PU填料。标准载气分为五路，一路进入装有α-蒎烯液体的吹脱瓶，一路进入装有邻二甲苯液体的吹脱瓶，一路进入装有二氯甲烷液体的吹脱瓶，一路进入装有1-氯苯液体的吹脱瓶，产生的四路气体与另一路空气混合后即得不同浓度的模拟废气，直接进入生物滴滤塔（床）。气体流量由质量流量计和转子流量计控制。
具体步骤如下：将液态复合菌剂取出后，室温放置至常温，与驯化后的活性污泥（以α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷、邻二甲苯等驯化2周）以1:5混合，接种生物滴滤塔。废气源为含α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷、邻二甲苯，每种物质的浓度为100(初始)-200（最终）mg/m3。同时以单一的活性污泥为接种物的生物滴滤塔作为对比。启动运行期考察试验结果如图3、4所示。 
与采用单一活性污泥相比，液态复合菌剂加快了生物膜的形成，缩短了反应器的启动时间。第5d，采用液态复合菌剂的生物滴滤塔对α-蒎烯和甲苯的去除率达到90%，第8d对1-氯苯和二氯甲烷的去除率达到85%以上；第9d，把各种污染物的浓度提升至200mg/m3，α-蒎烯和甲苯的去除率1d后就达到90%以上，1-氯苯和二氯甲烷的去除率也在3d后恢复至85%以上，表明了反应器已成功启动，生物膜形成。而采用单一活性污泥接种的反应器，生物膜形成就比较缓慢，经历20d后对α-蒎烯和甲苯的去除率90%以上、1-氯苯和二氯甲烷的去除率85%以上。上述结果表明，采用液态复合菌剂对废气净化装置进行接种，启动时间大约能缩短2/5以上。 
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。 

Claims (6)

1.一种液态复合菌剂的制备方法,其特征在于：1）选取菌株接种至无机盐液培养基，所述的菌株为以α-蒎烯为碳源筛选得到的降解菌Pseudomonas veronii ZW，以1-氯苯为碳源筛选得到的降解菌Ralstonia pickettii L2，以二氯甲烷为碳源筛选到的降解菌Pandoraea pnomenusa LX-1，以邻二甲苯为碳源筛选到的降解菌Zoogloea resiniphila HJ1，以小分子有机酸为碳源筛选到的降解菌Staphylococcus pasteuri LWX，分别以α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷、邻二甲苯和乙酸为唯一碳源进行培养，从而获得不同菌株的菌悬液；2）各种菌的菌悬液离心、洗涤、稀释后获得菌体浓度值相等的各种菌的菌液，将这些菌液等体积混合均一，获得液态复合菌剂的接种液；3）配制无机盐培养液，pH6.8-7.5，以α-蒎烯、1-氯苯、二氯甲烷和邻二甲苯的混合化合物为底物，接入接种液，摇床振荡培养或发酵罐培养，温度控制在30℃，培养24-48h后获得处于生长对数期的菌液；4）加入酵母粉和蛋白胨，得液态复合菌剂，冰箱4℃保存。
2.根据权利要求1所述的液态复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述的无机盐培养液其配方为（g/L）:KH2PO4 0.376，K2HPO4·3H2O 0.456，(NH4)2SO4 0.484，NaNO3 0.68，Mg(NO3)2 0.256，CaCl2 0.011，MnCl2·H2O 0.06，ZnCl2 0.088，KI 0.01，NaMoO4·2H2O 0.1，H3BO3 0.05，pH=7.2。
3.根据权利要求1所述的液态复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述的各种菌的菌悬液在12000g条件下离心后，收集菌体，并用无菌水洗涤3次，加入一定体积的无菌水，获得菌体浓度值相等的各种菌的菌液，浓度范围为500mg/L-2g/L，将这些菌液以等体积混合均一，获得液态复合菌剂的接种液。
4.根据权利要求1所述的液态复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述的酵母粉添加浓度为500mg/L-2g/L，蛋白胨添加浓度500mg/L-2g/L。
5.根据权利要求1所述的液态复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述的菌株Staphylococcus pasteuri LWX降解其他共存菌株代谢有机物产生的小分子有机酸，维持整个体系的pH呈弱酸性或者中性。
6.一种如权利要求1所述方法制备的液态复合菌剂在苯类及含氯VOCs气体的污染治理中的应用，在使用过程中无需调节体系的pH。
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