CN104673707B - “真菌-细菌”复合微生态制剂、其制备方法及其在VOCs混合废气处理中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种“真菌‑细菌”复合微生态制剂，包括烯烃类降解菌长喙壳霉菌Ophiostoma sp.LLC（CCTCC NO：M 2014531）；酯类降解菌烟曲霉菌Aspergillus sp.HD‑2（CCTCC NO：M 2014175）和木霉菌Trichoderma sp.LW‑1（CCTCC NO：M 2014176）；苯系物降解菌动胶菌Zoogloea sp.HJ1（CCTCC NO：M2012235）和氯代烃类降解菌潘多拉菌Pandoraeasp.FLX‑1（CCTCC NO:M2011242）。该复合微生态制剂制备过程简单，价格低廉，菌剂活性保存时间长，使用方便，体积小运输便利，能实现商业产品化。

Description

“真菌-细菌”复合微生态制剂、其制备方法及其在VOCs混合废 气处理中的应用
技术领域
本发明涉及一种“真菌-细菌”复合微生态制剂，具体涉及该制剂的成分组成、制备过程及其在处理多组分VOCs废气中的应用。
背景技术
废气生物处理装置在应用过程中多采用活性污泥接种启动反应器，存在启动时间长、启动期去除效率不高、性质不稳定等缺点。活性污泥中虽然含有大量微生物，但不具备“靶标”特点，即活性污泥中可能不含对拟处理废气组分具有高效降解能力的微生物。尤其是在多组分混合废气生物净化过程中，采用活性污泥接种反应器往往无法获得预期效果。此外，活性污泥多为泥水状，体积较大，携带、运输不便，且长时间保存容易使活性污泥厌氧发臭导致活性下降等。上述缺点在一定程度上限制了活性污泥接种法在废气生物净化领域的应用。
微生物菌剂在环保技术领域的应用主要集中在难降解废水处理、粪便无害化处理等方面，用于气态污染物的菌剂构建方法国内外鲜有报道。专利号ZL200810163160.2的专利“降解‘三苯’VOCs废气复合微生物菌剂的制备方法”，公开了一种复合固态复合菌剂的构建方法及其在三苯废气治理中的应用。该制备方法存在一些弊端，如制备采用的材料仍为活性污泥，只不过是经“三苯”驯化过的活性污泥，因而制备所得的菌剂单位体积所含的活性微生物数量不多、降解活力不大等。
通常微生物菌剂所选用的微生物多为细菌，采用真菌进行菌剂制备的报道较少，而采用“细菌-真菌”这两大类微生物进行共制备的报道就更少。相对于细菌，真菌降解VOCs的研究起步较晚，但研究意义重大。真菌所产生的菌丝体比表面积大，容易捕捉气相中的疏水性VOCs，同时又具备耐低 pH 值和适应干燥环境等特性，在处理VOCs尤其是疏水性VOCs方面发挥越来越大的作用。
专利号为201210543657.3，专利名称为“一体化复合生物处理难溶难降解有机废气的工艺”的中国专利中公开了一种一体化复合生物处理难溶难降解有机废气的工艺，适合于低浓度难溶难降解有机废气的净化处理。采用高浓度、低速率的进气方式，低流量循环液的驯化方式，在驯化过程中采用变pH的方式构建以假单胞杆菌和优势菌种的真菌-细菌复合生物系统。上述现有技术在驯化过程中逐步形成细菌和真菌组成的混合体系，严格意义上其目的不是制备菌剂，而是处理污染物，这种方法在目前应用中是比较常见的。该技术的缺陷是不同处理条件下获得的细菌-真菌体系成分和含量均不同，且形成的具有活性的体系无法保存，无法再次使用。如果要使用，就需要重新进行培养和驯化。本发明专利的目的是获得一种固态微生物制剂，是一种可以商品化的产品，可以直接投加到反应器中，在较短时间内获得较好的去除效果，不存在驯化过程。
专利号为：201010218533.9，专利名称为“用于难降解废水处理的复合高效微生物制剂及制备和应用”的中国专利中公开了一种复合高效微生物制剂，该复合高效微生物制剂的活性成分包括：芽孢杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、曲霉和酵母菌。对传统活性污泥法难以处理的含有大分子、难降解、有毒有害成分的高浓度有机污水和高氨氮污水有独特的处理效果。上述现有技术其缺陷是：①菌种选择具有盲目性，菌种来源不明，因为该现有技术没有提供具体的菌种名，申请文件里指出的芽孢杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、曲霉和酵母菌等都属于一大类，每一类都包括许多种，是不是每一种类都具有降解大分子、难降解、有毒有害成分的高浓度有机污水和高氨氮污水的能力不得而知，若没有具体的菌种，则该制备技术无法实现；②真菌和细菌的培养体系差别很大，且对pH的要求也不同，现有技术采用统一的培养基和方法进行培养，是否能获得大量培养物不得而知，且不同的真菌和真菌之间、细菌和真菌之间、细菌和细菌之间可能存在生长抑制现象，这些现有技术都未考虑到；③现有技术制备过程中真菌和细菌是在各自获得固体发酵物后混合而成菌剂，只是简单地机械混合，且制备的菌剂在使用过程中需要多次投加，投加量较大，可以理解为该制备过程制备的菌剂所含的活菌数量和活性不是很高，且使用过程不便捷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足而提供一种可替代活性污泥实现快速接种启动的“真菌-细菌”复合微生态制剂，该复合微生态制剂制备过程简单，制备价格低廉，菌剂活性保存时间长，使用方便，体积小运输便利，能实现商业产品化。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：该“真菌-细菌”复合微生态制剂，其特征在于：包括烯烃类降解菌长喙壳霉菌Ophiostoma sp. LLC（CCTCC NO：M 2014531）；酯类降解菌烟曲霉菌Aspergillus sp. HD-2（CCTCC NO：M 2014175）和木霉菌Trichodermasp. LW-1（CCTCC NO：M 2014176）；苯系物降解菌动胶菌Zoogloeasp. HJ1（CCTCC NO：M2012235）和氯代烃类降解菌潘多拉菌Pandoraeasp. FLX-1（CCTCC NO: M2011242）；其中动胶菌Zoogloeasp. HJ1和潘多拉菌Pandoraeasp. FLX-1均为细菌，长喙壳霉菌Ophiostoma sp. LLC、木霉菌Trichoderma sp. LW-1和烟曲霉菌Aspergillus sp. HD-2为真菌。选择上述菌株的好处是这些菌株都有降解不同种类污染物的能力，菌株的底物广谱性较大，且相互之间不存在生长影响，这样混合在一起就能降解多组分的VOCs废气。
本发明所述的复合微生态制剂为固体粉末，每克中活菌数达到108-109个以上。技术效果是固体粉末方便保存运输，且每克活菌数量多，使用过程中能减少使用量。
本发明还提供一种“真菌-细菌”复合微生态制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）、将所述的动胶菌Zoogloeasp. HJ1和潘多拉菌Pandoraeasp. FLX-1的种子试管斜面分别接种于无机盐液体培养基进行活化，对应的唯一碳源分别为甲苯和二氯甲烷，活化后采用发酵罐进行高密度发酵培养；
（2）、将所述的长喙壳霉菌Ophiostoma sp. LLC的种子平板接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基进行活化，活化后采用发酵罐进行高密度发酵培养，对应的唯一碳源为α-蒎烯；
（3）、将步骤（1）和（2）经高密度发酵后所获得的菌体混合均匀后，接种至灭过菌的固态发酵培养基上进行固态发酵，发酵温度为30-40℃，发酵时间为24-60h；
（4）、将步骤（3）所述经固态发酵所得的产品在40℃进行真空干燥处理，烘干温度为40℃，烘干时间为24-48h，烘干后碾磨成粉末待用；
（5）、将所述的烟曲霉菌Aspergillus sp. HD-2和木霉菌Trichoderma sp. LW-1的种子平板接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基进行活化，活化后分别接种加有乙酸丁酯和乙酸乙酯的改良型察氏平板培养基，培养3-5d后，可从平板上获得大量孢子；
（6）、将步骤（4）获得的粉末和步骤（5）获得孢子以质量比（3-5）:1比例均匀混合，即得复合微生态制剂。上述制备过程中的技术要点是不同的菌株要采用不同的培养体系进行培养，以确保获得大量菌株并保证菌株的活性，并且要掌握好烘干时间和温度。创新点在于采用真菌孢子与固态发酵粉末混合，能最大限度地保留真菌和细菌各自的降解活性。
本发明所述步骤（1）无机盐液体活化培养基和发酵罐内培养基均为（g/L）：KH2PO4 0.376，K2HPO4 0.456，(NH4)2SO4 0.48，NaNO3 0.68，Mg(NO3)2 0.25，CaCl2·2H2O 0.011，微量元素（MnCl2·H2O 0.06，ZnCl2 0.088，KI 0.01，NaMoO4·2H2O 0.1，H3BO3 0.05），pH 7.0-7.2；上述培养基均需121℃湿热灭菌30~ 40min；活化和高密度发酵培养二种菌采用的碳源依次为甲苯和二氯甲烷；所述步骤（1）中活化菌株和发酵培养温度均为30-35℃，溶解氧浓度控制在2-3mg/L。采用上述技术参数的技术效果是该培养体系和培养环境适合细菌生长，能在较短时间内获得较多的细菌菌体量。
本发明所述步骤（2）马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基为（g/L）：马铃薯200，葡萄糖(或蔗糖)20，琼脂20；pH6.5；高密度发酵罐内培养基为（g/L）：NH4Cl 2.0，Na2HPO4 0.47，KH2PO4 0.45，MgSO4 0.5，无水CaCl2 0.01；微量元素（Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+各0.001）；pH4.2-4.6，碳源为α-蒎烯；上述培养基均需121℃湿热灭菌30~ 40min；所述步骤（2）中活化菌株和发酵培养温度均为30-35℃，发酵培养中溶解氧浓度控制在2-3mg/L。采用上述技术参数的技术效果是该培养体系和培养环境适合真菌生长，能在较短时间内获得较多的真菌菌体量。
本发明所述步骤（3）中的固态发酵培养基为：麦麸、锯末和粉末活性炭，其重量百分数为 45-50%：25-30%：25-30%；加入1-2倍体积的含有下列物质的水溶液（g/L）：酵母提取物20，马铃薯20， NaCl 5；pH6.8-7.2，121℃湿热灭菌30~ 40min 冷却待用。采用上述技术参数的技术效果是该固态发酵培养基能在较短时间内获得较多的菌体量，且单位体积内吸附的菌体量较多。
本发明所述步骤（3）中的接种量为5%-20%。采用上述技术参数的技术效果是保证接种的菌体能在培养体系内良好地生长。
本发明所述步骤（5）中改良型察氏平板培养基为（g/L）：NaNO3 3，MgSO4 0.5，KCl0.5，FeSO4 0.01，琼脂 20g；pH6.0-6.5，碳源分别为乙酸丁酯和乙酸乙酯；以上培养基需121℃湿热灭菌30~ 40min。采用上述技术参数的技术效果是培养出的微生物对乙酸丁酯和乙酸乙酯具有较好的降解能力。
本发明所述步骤（6）中获得的复合微生态制剂为固态粉末状，在常温或4℃下保藏45d以上，活性不会衰减。采用上述技术效果是较好地保存了菌剂的降解活性。
本发明所述的“真菌-细菌”复合微生态制剂在含氯代烃类、烯烃类、芳香烃类、酯类混合废气处理中的应用，直接投至现场启动反应器的接种污泥中，投放比例为0.5-2kg复合微生态菌剂/m3填料。上述复合微生态制剂投加后，可明显缩短反应器启动时间，形成真菌和细菌共生体，加速生物膜形成。
本发明与现有技术相比具有以下优点：①菌种来源明确，菌种均具有降解不同种类污染物的能力，且相互之间不存在影响。本发明选择具有特定VOCs降解活性的细菌和真菌，制备复合微生态制剂，可有效解决传统活性污泥接种处理装置存在的弊端。不仅能显著提高单位体积含高活性降解菌的个数，缩短反应器启动时间，而且能极大地发挥真菌和细菌各自的优势，提升复合菌剂对环境的适应性，在废气生物净化的工程实践中极具开发潜力和应用前景。
②针对不同菌的特性，采用不同体系进行培养，以保证培养物具有较强的活性和降解能力。本发明所述的“真菌-细菌”复合菌剂制备过程简单，制备材料价格低廉；制备的复合菌剂单位体积活菌数量大、降解活力高、低温下保存时间长，且经过低温保存后复合菌剂在短时间内恢复降解活力，能应用于工业废气生物净化处理。
③制备过程中采用了吸附剂木屑和活性炭，能够最大限度地吸附真菌和细菌，以保证单位固态发酵剂的活体菌数量；后期采用真菌孢子和固态发酵物混合制备复合菌剂，使用过程中能形成真菌和细菌共生体系，能最大限度地保证每种菌的活性，保证两类微生物能充分发挥各自的特性，这在后期使用过程中效果是非常明显的。
附图说明
图1为本发明“真菌-细菌”复合菌剂的制备流程图。
图2a为本发明所述的复合菌剂的降解活性稳定性测试试验结果（测试时间48h）。
图2b为本发明所述的复合菌剂的降解活性稳定性测试试验结果（测试时间72h）。
图3为本发明所述的复合菌剂混合驯化活性污泥启动废气净化装置的试验结果。
图4为驯化活性污泥启动废气净化装置的试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：“真菌-细菌”复合菌剂的制备。
本发明涉及的各种微生物均保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。它们是：以α-蒎烯为碳源生长的降解菌长喙壳霉菌Ophiostoma stenocerasLLC,保藏号M 2014531，保藏日期2014年10月30日。
以乙酸丁酯为碳源生长的降解菌烟曲霉菌Aspergillus fumigatus HD-2，保藏号M 2014175，保藏日期2014年5月3日。
以乙酸乙酯为碳源生长的降解菌木霉菌Trichoderma viride LW-1，保藏号M2014176，保藏日期2014年5月3日。
以甲苯为碳源生长的降解菌动胶菌Zoogloea resiniphila HJ1，保藏号M2012235，保藏日期2012年6月18日。已在申请号201310281412.2的中国专利中公开。
以二氯甲烷为碳源生长的降解菌潘多拉菌Pandoraea pnomenusa strain FLX-1，保藏号M2011242，保藏日期2011年7月8日。已在申请号201110370070.2的中国专利中公开。
长喙壳霉菌Ophiostoma sp. LLC分离、纯化及其鉴定过程如下：
从处理α-蒎烯的生物滤塔中取生物膜，置于只含α-蒎烯的无机盐培养基中进行培养，α-蒎烯的浓度由低到高（50～200mg/L）逐渐升高。待明显出现α-蒎烯浓度下降的情况，取出200mL混合液涂布于只含有α-蒎烯的固体无机盐培养基上，连续划线分离，最终获得纯化菌株，接种到斜面培养基中，在4℃的冰箱中保存。
利用真菌ITS的通用引物对HD-2基因组DNA进行PCR扩增得到的目的DNA片段。将该序列同NCBI数据库中的基因序列进行Blast对比。结果表明LLC与菌株Ophiostoma stenoceras具有100% 的同源性。采用Clustal X2. 0 和MEGA4.0(1000次抽样分析) 软件构建系统发育树。通过遗传距离及ITS序列对比，鉴定为长喙壳霉菌（Ophiostoma sp.），命名为LLC。
烟曲霉菌Aspergillus sp. HD-2分离、纯化及其鉴定过程如下：
将某污水厂的污泥空气曝气三天后，取50ml上清液进行离心，将沉淀下来的污泥加入到装有50ml的无机盐培养基（经110℃，40分钟灭菌）的盐水瓶中，并且添加抗生素（链霉素和庆大霉素0.001）。盖上瓶塞后加入5μl乙酸丁酯（浓度约为88mg/L）。放置在30℃，160rpm的摇床中培养。逐步提高乙酸丁酯的浓度，待发现乙酸丁酯明显有被降解的趋势后，取2ml混合菌液,涂布于移除碳源的察氏培养基上，于培养皿盖中央置1cm直径的滤纸片并在其上加入5μl的乙酸丁酯，连续划线分离，最终获得纯化菌株，接种到PDA斜面培养基中，在4℃的冰箱中保存。
利用真菌ITS的通用引物对该菌基因组DNA进行PCR扩增得到的目的DNA片段。将该序列同NCBI数据库中的基因序列进行Blast对比。结果表明HD-2菌株的ITS 序列与菌株Aspergillus fumigatus的 ITS 序列区具有100% 的同源性。采用Clustal X2. 0 和MEGA4.0(1000次抽样分析) 软件构建系统发育树。通过遗传距离及ITS序列对比，鉴定为烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus），命名为HD-2。
木霉菌Trichoderma sp. LW-1分离、纯化及其鉴定过程如下：
取某污水处理厂曝气池中的活性污泥，自来水淘洗五次后，空曝48h，尽量去除残留的有机物。配制无机盐培养液，以乙酸乙酯为唯一碳源对活性污泥进行定向驯化，每3d更换新鲜无机盐培养液， 40d左右即可分离。从驯化瓶中取50ml上清液进行离心，将沉淀下来的污泥加入到装有50ml的无机盐培养基（已灭菌）的盐水瓶中，并且添加抗生素。盖上瓶塞后加入乙酸乙酯（浓度为50mg/L），放置在30℃，160rpm的摇床中培养。乙酸乙酯浓度逐步升高，待明显出现乙酸乙酯被降解后，取2ml混合菌液，涂布于含有乙酸乙酯的固体无机盐培养基上，连续划线分离，最终获得纯化菌株，接种到PDA斜面培养基中，在4℃的冰箱中保存。
以ITS基因序列同源性为基础，结合采用Clustal X2. 0 和MEGA4.0(1000次抽样分析) 软件构建系统发育树。通过遗传距离及ITS序列对比，鉴定为绿色木霉（Trichoderma viride）。通过Biolog FF鉴定，该菌株与系统内Trichoderma viride SIM index 符合度较好，表明分离得到的菌株LW-1属于Trichoderma viride。
图1为“真菌-细菌”复合菌剂的制备过程，具体如下。
①菌株活化。
将菌株Zoogloea sp. HJ1和Pandoraea sp. FLX-1的种子试管斜面分别接种于无机盐液体培养基进行活化。无机盐液体培养基为（g/L）：KH2PO4 0.376，K2HPO4 0.456，(NH4)2SO4 0.48，NaNO3 0.68，Mg(NO3)2 0.25，CaCl2·2H2O 0.011，微量元素（MnCl2·H2O 0.06，ZnCl2 0.088，KI 0.01，NaMoO4·2H2O 0.1，H3BO3 0.05）; pH 7.0。培养基均需121℃湿热灭菌30~ 40min。待培养基冷却后，分别接入菌株，并分别以甲苯和二氯甲烷为碳源，摇床振荡培养，温度32℃。培养5d后获得接种液。
将Ophiostoma sp. LLC、Aspergillus sp. HD-2和Trichoderma sp. LW-1的种子平板接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基进行活化。PDA培养基为（g/L）：马铃薯200，葡萄糖(或蔗糖)20，琼脂20；pH6.5。培养基均需121℃湿热灭菌30~ 40min。待培养基冷却后，将菌株分别接种涂布于该固体平板培养基，培养温度32℃。培养5d后获得接种体。
②菌体获得。
将活化后的菌株Zoogloea sp. HJ1和Pandoraea sp. FLX-1的接种液分别接种于装有无机盐液体培养基的发酵罐进行高密度培养。碳源分别为甲苯和二氯甲烷为碳源，采用流加的方式持续供给。温度、pH和溶解氧浓度采用在线监测调节，分别控制在32℃、7.0和2-3mg/L。培养3d后获得大量菌体，经离心富集后待用。
将活化后的菌株Ophiostoma sp. LLC的接种液接种于装有无机盐液体培养基的发酵罐进行高密度发酵培养，碳源为α-蒎烯，采用流加的方式持续供给。无机盐液体培养基培养基为（g/L）：NH4Cl 2.0，Na2HPO4 0.47，KH2PO4 0.45，MgSO4 0.5，无水CaCl2 0.01；微量元素（Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+各0.001）。温度、pH和溶解氧浓度采用在线监测调节，分别控制在32℃、4.4和2-3mg/L。培养3d后获得大量菌体，经离心富集后待用。
将活化后的菌株Aspergillus sp. HD-2和Trichoderma sp. LW-1的接种液分别接种到改良型察氏平板培养基进行高密度培养。碳源分别乙酸丁酯和乙酸乙酯。改良型察氏平板培养基为（g/L）：NaNO3 3，MgSO4 0.5，KCl 0.5，FeSO4 0.01，琼脂 20g；pH6.0。放置在温度30-35℃培养箱中培养， 5d后，可从平板上获得大量孢子备用。
③复合菌剂制备。
将经高密度发酵后所获得的菌体Zoogloea sp. HJ1、Pandoraea sp. FLX-1和Ophiostoma sp. LLC混合均匀后，接种至灭过菌的固态发酵培养基上进行固态发酵，发酵温度为35℃，发酵时间为40h。固态发酵培养基主要成分为麦麸、锯末和粉末活性炭，其重量百分数分别为 50%：25%：25%，然后加入1-2倍体积的含有下列物质的水溶液（g/L）：酵母提取物20，马铃薯20， NaCl 5；pH6.8-7.2，121℃湿热灭菌30~ 40min，冷却后接种上述菌体的悬浮液，进行培养。
经固态发酵所得的产品在40℃进行真空干燥处理，烘干温度为40℃，烘干时间为24h，烘干后碾磨成粉末与菌株Aspergillus sp. HD-2和Trichoderma sp. LW-1的孢子粉进行混合，混合质量比为4:1。
实施例2：“真菌-细菌”复合菌剂的性能测定。
对构建的“真菌-细菌”复合菌剂进行生物量和降解活性稳定性测试。生物量测定方法具体如下：取1g复合菌剂分别接入灭过菌的LB固体培养基（用于测定细菌数目）和PDA固体培养基（用于测定真菌重量），分别在30℃和35℃培养24h和48h后测定生物量。测定细菌个数时采用稀释涂布法，即采用梯度稀释后计算菌落个数；真菌生物量测定采用干重法：用PDA培养基培养的菌体刮下后于80℃烘干称重。LB固体培养基（g/L）：胰化蛋白胨 10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，pH7.2。PDA培养基为（g/L）：马铃薯200，葡萄糖(或蔗糖)20，琼脂20；pH6.5。
结果表明，培养24h后LB平板（稀释10-6）上有效活菌落数为298个，培养48h后LB平板（稀释10-7）上有效活菌数为31个。经过换算，复合菌剂中含有6.08×108个有效细菌/g干菌剂。培养24h PDA平板有效增重0.057g，培养48h后PDA平板有效增重0.248g。经过换算，复合菌剂含有真菌生物量0.4296g真菌/g干菌剂。
降解活性稳定测试方法如下：取冰箱4℃保藏0h、1d、5d、15d、30d和45d的“真菌-细菌”复合菌剂各2g，接种于灭过菌的无机盐液体培养基，依次加入α-蒎烯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、甲苯和二氯甲烷，使它们浓度分别达到50mg/L，密封后振荡培养，48h和72h后测定每种污染物的去除率。
结果如图2a、图2b所示。在冰箱保存0h、1d和5d的复合菌剂在培养48h后培养液中可以明显看到大量菌生长。降解活性测试表明，复合菌剂对五种污染物均有一定的去除效果，且对于α-蒎烯、乙酸乙酯和乙酸丁酯的去除效果较好（平均在85%以上），对于甲苯和二氯甲烷的去除率稍差（大约在60%）；而在冰箱保存时间较长的菌剂48h时未表现出太强的降解性能，对5种污染物的去除率仅为10%-20%左右。培养72h后，在冰箱保存15d、30d和45d的复合菌剂在培养液中生长情况较好，此时测得的五种污染的去除率均明显上升，α-蒎烯、乙酸乙酯和乙酸丁酯的去除率在80%以上，对于甲苯和二氯甲烷的去除率在50%以上。以上结果表明，构建的“真菌-细菌”复合菌剂在低温时降解活性能得到较好的保存，随着保存时间的延长，其降解活性恢复需要一定的时间。
实施例3：“真菌-细菌”复合菌剂混合活性污泥启动生物反应器。
按照每m3填料加入1.5kg“真菌-细菌”复合菌剂，并加入一定量驯化过的活性污泥，接种启动反应器。同时以驯化过的活性污泥作为对照。废气源为α-蒎烯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯和二氯甲烷，浓度均为50mg/m3，停留时间45s。
结果如图3和图4所示。可以看出，混合有复合菌剂的活性污泥启动反应器，3d后对于乙酸乙酯和乙酸丁酯的去除率就达到85%以上并保持稳定，4d后对于α-蒎烯的去除率达到85%以上并保持稳定，6d后对甲苯的去除率达到75%以上并保持稳定，8d后对二氯甲烷的去除率达到70%以上并保持稳定，且填料表面能明显看到生物膜，表明挂膜基本成功。而对于仅依靠活性污泥接种的反应器，各种污染物的去除效果上升非常缓慢，20d后对α-蒎烯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯和二氯甲烷的去除率稳定在80%、85%、85%、65%和50%，说明生物膜基本形成，挂膜完成。以上结果表明，采用复合菌剂混合驯化活性污泥接种生物反应器，能明显缩短生物膜形成时间，且对于各种污染物组分的去除率高于采用单一活性污泥接种的反应器。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种“真菌-细菌”复合微生态制剂，其特征在于：为烯烃类降解菌长喙壳霉菌Ophiostoma sp. LLC，保藏号为CCTCC NO：M 2014531；酯类降解菌曲霉菌Aspergillus sp.HD-2和木霉菌Trichoderma sp. LW-1，保藏号分别为CCTCC NO：M 2014175和CCTCC NO：M2014176；苯系物降解菌动胶菌Zoogloea sp. HJ1，保藏号为CCTCC NO：M2012235；氯代烃类降解菌潘多拉菌Pandoraea sp. FLX-1，保藏号为CCTCC NO: M2011242；其中动胶菌Zoogloea sp. HJ1和潘多拉菌Pandoraea sp. FLX-1均为细菌，长喙壳霉菌Ophiostoma sp. LLC、木霉菌Trichoderma sp. LW-1和曲霉菌Aspergillus sp. HD-2为真菌；所述“真菌-细菌”复合微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）、将所述的动胶菌Zoogloeasp. HJ1和潘多拉菌Pandoraeasp. FLX-1的种子试管斜面分别接种于无机盐液体培养基进行活化，对应的唯一碳源分别为甲苯和二氯甲烷，活化后采用发酵罐进行高密度发酵培养；
（2）、将所述的长喙壳霉菌Ophiostoma sp. LLC的种子平板接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行活化，活化后采用发酵罐进行高密度发酵培养，对应的唯一碳源为α-蒎烯；
（3）、将步骤（1）和（2）经高密度发酵后所获得的菌体混合均匀后，接种至灭过菌的固态发酵培养基上进行固态发酵，发酵温度为30-40℃，发酵时间为24-60h；
（4）、将步骤（3）经固态发酵所得的产品在40℃进行真空干燥处理，烘干温度为40℃，烘干时间为24-48h，烘干后碾磨成粉末待用；
（5）、将所述的曲霉菌Aspergillus sp. HD-2和木霉菌Trichoderma sp. LW-1的种子平板接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行活化，活化后分别接种加有乙酸丁酯和乙酸乙酯的改良型察氏平板培养基，培养3-5d后，可从平板上获得大量孢子；
（6）、将步骤（4）获得的粉末和步骤（5）获得孢子以质量比（3-5）:1比例均匀混合，即得复合微生态制剂。
2.根据权利要求1所述的“真菌-细菌”复合微生态制剂，其特征在于：所述的复合微生态制剂为固体粉末，每克中活菌数达到108-109个以上。
3.如权利要求1所述的“真菌-细菌”复合微生态制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）、将所述的动胶菌Zoogloeasp. HJ1和潘多拉菌Pandoraeasp. FLX-1的种子试管斜面分别接种于无机盐液体培养基进行活化，对应的唯一碳源分别为甲苯和二氯甲烷，活化后采用发酵罐进行高密度发酵培养；
（2）、将所述的长喙壳霉菌Ophiostoma sp. LLC的种子平板接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行活化，活化后采用发酵罐进行高密度发酵培养，对应的唯一碳源为α-蒎烯；
（3）、将步骤（1）和（2）经高密度发酵后所获得的菌体混合均匀后，接种至灭过菌的固态发酵培养基上进行固态发酵，发酵温度为30-40℃，发酵时间为24-60h；
（4）、将步骤（3）经固态发酵所得的产品在40℃进行真空干燥处理，烘干温度为40℃，烘干时间为24-48h，烘干后碾磨成粉末待用；
（5）、将所述的曲霉菌Aspergillus sp. HD-2和木霉菌Trichoderma sp. LW-1的种子平板接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行活化，活化后分别接种加有乙酸丁酯和乙酸乙酯的改良型察氏平板培养基，培养3-5d后，可从平板上获得大量孢子；
（6）、将步骤（4）获得的粉末和步骤（5）获得孢子以质量比（3-5）:1比例均匀混合，即得复合微生态制剂。
4.根据权利要求3所述的“真菌-细菌”复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）无机盐液体培养基和发酵罐内培养基成分以g/L为单位，为KH2PO4 0.376，K2HPO40.456，(NH4)2SO4 0.48，NaNO3 0.68，Mg(NO3)2 0.25，CaCl2·2H2O 0.011，微量元素为MnCl2·H2O 0.06、ZnCl2 0.088、KI 0.01、NaMoO4·2H2O 0.1和H3BO3 0.05，pH 7.0-7.2；上述培养基均需121℃湿热灭菌30~ 40min；活化和高密度发酵培养二种菌采用的碳源分别为甲苯和二氯甲烷；所述步骤（1）中活化菌株和发酵培养温度均为30-35℃，溶解氧浓度控制在2-3mg/L。
5.根据权利要求3所述的“真菌-细菌”复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）马铃薯葡萄糖琼脂培养基成分以g/L为单位，为马铃薯200，葡萄糖或蔗糖20，琼脂20；pH6.5；高密度发酵罐内培养基成分以g/L为单位，为NH4Cl 2.0，Na2HPO4 0.47，KH2PO40.45，MgSO4 0.5，无水CaCl2 0.01；微量元素为Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+各0.001；pH4.2-4.6，碳源为α-蒎烯；上述培养基均需121℃湿热灭菌30~ 40min；所述步骤（2）中活化菌株和发酵培养温度均为30-35℃，发酵培养中溶解氧浓度控制在2-3mg/L。
6.根据权利要求3所述的“真菌-细菌”复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的固态发酵培养基为：麦麸、锯末和粉末活性炭，其重量百分数为 45-50%：25-30%：25-30%；加入1-2倍体积的含有下列物质的水溶液，其中各物质以g/L为单位，为酵母提取物20，马铃薯20， NaCl 5；pH6.8-7.2，121℃湿热灭菌30~ 40min 冷却待用。
7.根据权利要求3所述的“真菌-细菌”复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的接种量为5%-20%。
8.根据权利要求3所述的“真菌-细菌”复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中改良型察氏平板培养基成分以g/L为单位，为NaNO3 3，MgSO4 0.5，KCl 0.5，FeSO40.01，琼脂 20g；pH6.0-6.5，碳源分别为乙酸丁酯和乙酸乙酯；以上培养基需121℃湿热灭菌30~ 40min。
9.根据权利要求3所述的“真菌-细菌”复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中获得的复合微生态制剂为固态粉末状，在常温或4℃下保藏45d以上，活性不会衰减。
10.根据权利要求1所述的“真菌-细菌”复合微生态制剂在含α-蒎烯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯和二氯甲烷混合废气处理中的应用，直接投至现场启动反应器的接种污泥中，投放比例为0.5-2kg复合微生态菌剂/m3填料。
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