CN112251378B - 一种苯系物降解菌及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种苯系物降解菌及其筛选方法和应用，所述筛选方法包括取污染土壤样品于密闭血清瓶中，经驯化、分离和纯化后获得，首次对棒状杆菌属(Corynebacterium)高效降解苯进行了系统性研究；AL‑5菌能在10h内完全降解100mg/L的苯，无毒性中间产物代谢积累，无二次污染物的产生；该菌为非致病菌，降解效果稳定，近50次转接和冷冻保藏后均能高效稳定降解苯；该操作成本较低，对环境产生的负面影响小，具有很好的开发利用前景。

Description

一种苯系物降解菌及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于微生物处理降解技术领域，涉及一种苯系物降解菌及其筛选方法和应用。

背景技术

苯，甲苯，乙苯和二甲苯(BTEX)化合物是重要的有机污染物，是汽油和燃料的组成部分，并广泛用于工业合成中。BTEX化合物是常见的环境污染物，通常是由于燃料，溶剂或化学物质的溢出以及不适当的废物处置而污染土壤。BTEX化合物对人体健康有害，长期接触可能导致呼吸系统疾病和心血管疾病，还影响免疫，代谢和生殖系统的功能和发育，短期暴露在高浓度BTEX环境中可能会触发循环系统死亡率，并且所有BTEX化合物均可引起神经功能障碍，而接触苯可致癌，对血液亦有影响，包括引发再生障碍性贫血和急性骨髓性白血病，乙苯和二甲苯可能引起急性眼睛和皮肤刺激。除了对健康有影响外，BTEX还是其他空气污染物的前体，例如对流层臭氧，多环芳烃，颗粒物和超细颗粒；因此，美国环境保护署将其归类为环境优先污染物，使其从污染场地中的去除非常关键。

BTEX化合物中的苯相比甲苯、乙苯、二甲苯等具有更加严格的限值，在地下水质量标准(GB/T14848-2017)中规定了Ⅲ类地下水工农业用水中苯、甲苯、乙苯、二甲苯的限值分别为10、700、300、500μg/L，甲苯、乙苯、二甲苯的浓度限值为苯的30倍-70倍，土壤环境质量建设用地土壤风险管控标准(GB36600-2018)中明确规定了苯在第一类用地中的筛选值为1mg/kg，而甲苯、乙苯、邻二甲苯、间/对二甲苯的筛选值是苯的7.2-1200倍，分别为1200、7.2、222、163mg/kg，并且苯环上的6个等价碳原子处于最稳定的状态，因此更难进行相关反应，而甲苯等苯环上的取代基影响了所连的碳原子以及环上邻对位的碳原子的性质，使它们更为活泼，因此更容易发生反应。苯的高标准以及难去除给环境修复过程带来不小的挑战。

现有的土壤及地下水修复处理技术主要分为化学法、物理法及生物法，化学法主要通过氧化的手段，在修复的过程中往往会破坏土壤和水体的理化性质，容易造成二次污染，物理法不能完全破坏污染物，并且在转运污染物的过程中也容易造成二次污染。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种苯系物降解菌及其筛选方法和应用，以克服上述技术存在对土壤及水体环境造成破坏，对低浓度苯污染物去除不够彻底，需要高成本，并且容易造成二次污染等问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一方面，本发明提出了一种苯系物降解菌，其为棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)，菌株代码为AL-5，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M2020503，保藏时间为2020年9月14日。

进一步的，其革兰氏染色呈阳性，菌株形态无荚膜、棒状杆菌，且在1％LB上菌落形态规则，呈黄色、凸起、不透明和光滑。同时，对其进行了16S rDNA测序，所测得的16S rDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，菌株AL-5的16S rDNA的核苷酸序列与棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性。

另一方面，本发明还提出了一种苯系物降解菌的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和苯溶液混合，得到液体培养基；

(2)取来源于农药厂污染土壤的土壤样品置于一份液体培养基中，混合，得到含菌的第一混合液，培养后取10％的液体(即第一混合液，此处为体积量)再转移至另一份液体培养基中，得到第二混合液，如此重复若干次，直至得到第n混合液，其中，n＝6-8；

(3)将所得第六混合液进行划线分离培养，即得到苯系物降解菌。

进一步的，步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分至少包含：0.2g/L NH₄Cl，7.95g/L NaCl，0.77g/L MgCl₂·6H₂O，1.05g/L MgSO₄·7H₂O，0.076g/L CaCl₂，0.22g/L KCl，0.01g/L NaHCO₃，0.026g/L NaBr，0.25g/L K₂HPO₄。。

进一步的，步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分至少包括：0.15g/LZnSO₄·7H₂O，0.26g/L MnSO₄·H₂O，0.03g/L CoCl₂·6H₂O，4.5g/L FeSO₄·7H₂O，0.02g/LNiCl₂·6H₂O，0.01g/L CuCl₂，0.1g/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.06g/L H₃BO₃。

进一步的，步骤(1)中，所述的苯溶液(50g/L)所用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。步骤1中所述的无机盐培养基，微量元素溶液，苯溶液添加体积比为10⁶:10³:2。

进一步的，这里从农药厂获得的土壤样品和液体培养基的用量可以根据实际要求进行调节。例如，步骤(2)中，制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比可以为(3-6)g：20mL。同样的，从第一混合液中转移至第二混合液的量与第一混合液体积比可以是1:20至1:10，本发明不局限于此。

进一步的，步骤(2)的整个驯化过程中，所用工具可以根据实际情况具体选择，这里筛选所用的瓶子为150mL钳口血清瓶，用铝盖加垫片密封，其中所加液体为20-30mL，当然，本发明不局限于此。

进一步的，步骤(2)中，驯化条件可以根据实际情况具体选择。比如，这里适用的摇床转速可以是180r/min，培养过程在密闭条件下进行，温度为28℃，每次培养的时间为2-3d。

进一步的，步骤(3)中，划线分离培养过程具体为：用接种环蘸取第n混合液并在LB平板上划线分离，培养至LB平板长出单菌落后，再用接种环蘸取单菌落在另一干净的LB平板上继续划线分离，如此重复2-3次，即得到苯系物降解菌。

再另一方面，本发明还提出了一种苯系物降解菌在降解苯系物体系中的应用。

本发明提供的苯降解菌是Corynebacterium sp.AL-5，该菌株是一株新的苯降解菌株，在其它文献中未见该菌属降解苯的报道，GenBank登录号为MT967914，保藏编号为CCTCC No：M2020503。所述筛选方法包括：从农药厂周边污染土壤样品中，经驯化、分离和纯化后得到。本发明通过从农药厂周围提取污染土壤，并从中筛选出苯降解菌AL-5，该菌不仅能高效降解苯，对甲苯也有较好的降解效果。通过上述苯降解菌AL-5对水中的苯系物进行降解，能达到去除污染物的目的，并且中间产物被彻底降解。该操作成本较低，对环境产生的负面影响小，具有很好的开发利用前景。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1为本发明提供的在150mL血清瓶中菌株降解苯的过程培养基随时间变浑浊的图片。

图2为本发明提供的一种苯降解菌株AL-5的菌落形态图。

图3为本发明提供的一种苯降解菌株AL-5的扫描电镜图。

图4为本发明中提供的一种苯降解菌株AL-5的系统发育树。

图5为本发明中提供的一种苯降解菌株AL-5降解苯的生长曲线与降解曲线图。

图6为本发明中提供的一种苯降解菌株AL-5降解苯过程的HPLC色谱图。

图7为本发明中提供的一种苯降解菌株AL-5的降解底物图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

特别的，在本文中所披露范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，即表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。

一方面，本发明提出了一种苯系物降解菌，其为棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)，菌株代码为AL-5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020503，保藏时间为2020年9月14日。

进一步的，其革兰氏染色呈阳性，菌株形态无荚膜、棒状杆菌，且在1％LB上菌落形态规则，呈黄色、凸起、不透明和光滑。同时，对其进行了16SrDNA测序，所测得的16S rDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，菌株AL-5的16S rDNA的核苷酸序列与棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性。

另一方面，本发明还提出了一种苯系物降解菌的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和苯溶液混合，得到液体培养基；

(2)取来源于农药厂污染土壤的土壤样品置于一份液体培养基中，混合，得到含菌的第一混合液，培养后取10％的液体再转移至另一份液体培养基中，得到第二混合液，如此重复若干次，直至得到第n混合液，其中，n＝6-8；

(3)将所得第六混合液进行划线分离培养，即得到苯系物降解菌。

进一步的，步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分至少包含0.2g/LNH₄Cl，7.95g/L NaCl，0.77g/L MgCl₂·6H₂O，1.05g/L MgSO₄·7H₂O，0.076g/L CaCl₂，0.22g/L KCl，0.01g/L NaHCO₃，0.026g/L NaBr，0.25g/L K₂HPO₄。

进一步的，步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分至少包括：0.15g/LZnSO₄·7H₂O，0.26g/L MnSO₄·H₂O，0.03g/L CoCl₂·6H₂O，4.5g/L FeSO₄·7H₂O，0.02g/LNiCl₂·6H₂O，0.01g/L CuCl₂，0.1g/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.06g/L H₃BO₃。

进一步的，步骤(1)中，所述的苯溶液(50g/L)所用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。

步骤1中所述的无机盐培养基，微量元素溶液，苯溶液添加体积比为10⁶:10³:2。

进一步的，这里从农药厂获得的土壤样品和液体培养基的用量可以根据实际要求进行调节。例如，步骤(2)中，制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比可以为(3-6)g：20mL。同样的，从第一混合液中转移至第二混合液的量与第一混合液体积比可以是1:20至1:10，本发明不局限于此。

进一步的，步骤(2)的整个驯化过程中，所用工具可以根据实际情况具体选择，这里筛选所用的瓶子为150mL钳口血清瓶，用铝盖加垫片密封，其中所加液体为20-30mL，当然，本发明不局限于此。

进一步的，步骤(2)中，驯化条件可以根据实际情况具体选择。比如，这里适用的摇床转速可以是180r/min，培养过程在密闭条件下进行，温度为28℃，每次培养的时间为2-3d。

进一步的，步骤(3)中，划线分离培养过程具体为：用接种环蘸取第n混合液并在1％盐度LB平板上划线分离，培养至1％盐度LB平板长出单菌落后，再用接种环蘸取单菌落在另一干净的1％盐度LB平板上继续划线分离，如此重复2-3次，即得到苯系物降解菌。

再另一方面，本发明还提出了一种苯系物降解菌在降解苯系物体系中的应用。

实施例1：菌株的获得

从扬州某农药厂采取污染土壤装于棕色瓶中运回实验室，将土壤添加于培养基中制得混合物，通过筛选、驯化获得一株高效苯系物降解菌，对该菌株进行苯系物降解验证，发现该菌株能高效降解苯、甲苯，特别是对苯系物中降解难度较大的苯具有十分好的降解效率，并且该菌株具有稳定的传代特性。

该菌株革兰氏染色呈阳性，菌株形态无荚膜、棒状杆菌。在1％LB上菌落形态规则，黄色，微凸起，不透明的和光滑。

对其进行了16S rDNA测序，所测得的16S rDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，菌株AL-5的16S rDNA的核苷酸序列与棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性。

该菌株已于2020年9月保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株代码：AL-5，保藏编号为CCTCC NO：M2020503。

菌株的具体获得过程如下：

(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和苯溶液混合，得到液体培养基；

(2)取来源于农药厂污染土壤的土壤样品置于一份液体培养基中，混合，得到含菌的第一混合液，培养后移取10％的第一混合液再转移至另一份液体培养基中，得到第二混合液，如此重复若干次，直至得到第n混合液，其中，n＝6-8；

(3)将所得第六混合液进行划线分离培养，即得到苯系物降解菌。

步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分至少包含：0.2g/L NH₄Cl，7.95g/L NaCl，0.77g/L MgCl₂·6H₂O，1.05g/L MgSO₄·7H₂O，0.076g/L CaCl₂，0.22g/LKCl，0.01g/L NaHCO₃，0.026g/L NaBr，0.25g/L K₂HPO₄。

步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分至少包括：0.15g/L ZnSO₄·7H₂O，0.26g/L MnSO₄·H₂O，0.03g/L CoCl₂·6H₂O，4.5g/L FeSO₄·7H₂O，0.02g/L NiCl₂·6H₂O，0.01g/L CuCl₂，0.1g/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.06g/L H₃BO₃。

步骤(1)中，所述的苯溶液(50g/L)所用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。

步骤(1)中所述的无机盐培养基，微量元素溶液，苯溶液添加体积比为10⁶:10³:2。

步骤(2)中，制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比为(3-6)g：20mL。同样的，从第一混合液中转移至第二混合液的量与第一混合液的体积比可以是1:20至1:10，本发明不局限于此。

步骤(2)的整个驯化过程中，所用工具为150mL钳口血清瓶，用铝盖加垫片密封，其中所加液体一般为20-30mL。

步骤(2)中，驯化条件可以是180r/min，培养过程在密闭条件下进行，温度为28℃，每次培养的时间为2-3d左右。

步骤(3)中，划线分离培养过程具体为：用接种环蘸取第n混合液并在1％盐度LB平板上划线分离，培养至1％盐度LB平板长出单菌落后，再用接种环蘸取单菌落在另一干净的1％盐度LB平板上继续划线分离，如此重复2-3次，即得到苯系物降解菌，菌落形态如图2所示，形态规则，黄色，微凸起，不透明的和光滑。AL-5菌的主要形态如图3所示，AL-5菌呈棒状、无鞭毛。图4展示了AL-5与棒状杆菌属其它菌的亲缘关系，AL-5与JY02在发育树的同一支，表明其有较近的亲缘关系。

实施例2：

菌株对水体中苯系物的降解研究

将20mL含有100mg/L酵母粉、40mg/L苯系物(苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯、间/对二甲苯)的无机盐培养基置于150mL血清瓶中，AL-5于1％LB培养基扩大培养后，8000r/min离心5min，并用1％无机盐培养基重悬，洗去酵母粉等碳源，重复2次后总体积不变，在600nm波长条件下测定吸光值，保证降解体系中初始吸光值为0.05。为防止苯挥发加盖密封，于28℃，180rpm，避光条件下振荡培养，定时取样，测定苯系物的残留浓度，图1显示了不同时间下培养基中变浑浊的现象，这主要是因为微生物利用苯生长和繁殖造成的。

图7显示AL-5能够降解苯和甲苯，苯在6h内被完全消耗掉，并且在36h内能去除80％的甲苯。

表1显示了AL-5转接近50次后对苯和甲苯的降解效果，数据表明在1d内，50mg/L苯被完全降解，50mg/L甲苯在2d内有96％的降解，说明AL-5菌降解效果稳定，具有很好的利用前景。

表1 AL-5降解稳定性研究

实施例3：

菌株对水体中高浓度苯的降解研究

取AL-5菌株在以含苯100mg/L的1％LB培养基中生长过夜。通过将洗涤过的细胞重悬于不含碳源的无机盐培养基中，并将悬浮液在28℃下搅拌后添加至20mL降解无机盐培养基中，培养基中含苯100mg/L、酵母粉100mg/L，初始在600nm波长条件下吸光值为0.05。视情况1-2h间隔取样分别测定苯残留浓度与产物分布情况，离心除去细胞，并用等体积的乙酸乙酯萃取上清液三次。合并的萃取物用无水硫酸钠干燥，并通过氮气流蒸发至干。然后将浓缩的样品重新溶解在乙酸乙酯中，通过孔径为0.22μm的耐溶剂过滤器过滤。并使用带有Eclipse XDB-C18(5μm，4.6×250mm)的岛津HPLC-10ATVP进行分析。流动相由CH₃OH/0.1％乙酸(比率50/50)组成，流速为1mL/min。

图5显示在最初的2h内，菌株存在一个短暂的迟滞期，从第2h起进入对数生长期，苯被快速降解，同时中间产物快速生成(如图6所示)，中间产物在第8h有最大的累积量，到第10h，苯已经被降解完全，同时对应最大的生物生长量，10h后在600nm波长条件下吸光值有所下降，推测是由于中间产物的快速消耗导致的，而在14-24h内，随着中间代谢产物的彻底消耗，在600nm波长条件下吸光值最终有所增加。

表2对比了其他菌株对苯的降解速度，发现AL-5菌在降解速度上具有明显的优势，AL-5菌降解速度最快能达到10mg/(L.h)。

表2 不同微生物对苯的降解情况

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种苯系物降解菌及其筛选方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1372

<212> DNA

<213> Corynebacterium sp.

<400> 1

tgcagtcgac gatgaagctt agcttgctag gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac 60

gtaggtaatc tgccctgcac tttgggataa gcctgggaaa ctgggtctaa taccgaatag 120

gacacactat ctttacggtg gtgtgtggaa agcttttgcg gtgtgggatg agcctgcggc 180

ctatcagctt gttggtgggg taatggccta ccaaggcgtc gacgggtagc cggcctgaga 240

gggtgtacgg ccacattggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300

ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtggggg atgaaggcct 360

tcgggttgta aactcctttc gctagggacg aagagttata ttgacggtac ctggagaaga 420

agcaccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcgag cgttgtccgg 480

aattactggg cgtaaagagc tcgtaggtgg tttgtcgcgt cgtctgtgaa atcccggggc 540

ttaactccgg gcgtgcaggc gatacgggca taacttgagt gctgtagggg agactggaat 600

tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accaatggcg aaggcaggtc 660

tctgggcagt aactgacgct gaggagcgaa agcatgggta gcgaacagga ttagataccc 720

tggtagtcca tgccgtaaac ggtgggcgct aggtgtaggg gacttccacg tcttctgtgc 780

cgcagctaac gcattaagcg ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag 840

gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgtggat taattcgatg caacgcgaag 900

aaccttacct gggcttgaca tataccggat cggcgtagag atacgttttc ccttgtggtc 960

ggtatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020

gcaacgagcg caacccttgt cttatgttgc catcacgtga tggtgggcac tcatgagaaa 1080

ctgccggggt taactcggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgtc 1140

cagggcttca cacatgctac aatggtcggt acagcgagtt gccacaccgt aaggtggagc 1200

taatctctta aagccggcct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg 1260

gagtcgctag taatcgcaga tcagcaacgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1320

caccgcccgt cacgtcatga aagttggtaa cacccgaagc cagtggccca ac 1372

Claims (3)

1.一种苯系物降解菌，其特征在于，其为棒状杆菌(Corynebacterium sp.)，菌株代码为AL-5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020503，保藏时间为2020年9月14日。

2.根据权利要求1所述的一种苯系物降解菌，其特征在于，其革兰氏染色呈阳性，菌株形态无荚膜、棒状杆菌，且在1％LB上菌落形态规则，呈黄色、凸起、不透明和光滑。

3.如权利要求1或2所述的一种苯系物降解菌的应用，其特征在于，该苯系物降解菌用于降解苯和甲苯。

Images