CN112592855A

CN112592855A - 一株枯草芽孢杆菌及其处理铀、镉污染水体的方法

Info

Publication number: CN112592855A
Application number: CN202011493619.2A
Authority: CN
Inventors: 钟娟; 刘兴宇; 崔兴兰; 胡学武; 李红霞; 刘营; 袁学韬; 陈勃伟
Original assignee: GRINM Resources and Environment Technology Co Ltd
Current assignee: GRINM Resources and Environment Technology Co Ltd
Priority date: 2020-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2040-12-17
Also published as: CN112592855B

Abstract

本发明提供一株枯草芽孢杆菌，该菌株的分类命名为：Bacillus subtilis GRINML10；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2019年11月20日；保藏编号：CCTCC NO：M 2019958。本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GRINML10具有高效降解无机磷和有机磷的双重作用，且降解有机磷的效果优于无机磷。此外该菌对铀和镉的耐受性高，能在较宽的pH值条件下促进水中铀的沉淀和镉的吸附，适用于处理高浓度铀和镉复合污染水体。该方法以植酸钙作为磷源和碳源实现枯草芽孢杆菌对铀和镉的协同治理。本发明涉及的枯草芽孢杆菌对人、畜安全，没有环境污染问题，并且具有操作简单、效率高、适用范围广等优点。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其处理铀、镉污染水体的方法

技术领域

本发明属于微生物领域，特别是涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisGRINML10)、培养方法以及利用该菌将难溶性无机/有机磷源转化为可溶性磷酸盐，并高效处理铀、镉污染水体的方法。

背景技术

铀矿的开采和水冶过程中产生大量铀尾矿(渣)，鉴于大多数铀尾矿(渣)露天堆放，尾矿渣返酸或经过风化、雨水和地表水作用等，尾矿(渣)库中渗水铀和镉浓度超标。这些铀、镉污染水体不断向周围土壤以及地下水渗透、迁移，造成水生动物死亡甚至消失，严重情况甚至威胁到污染区域动植物和人类的生命安全。鉴于²³⁵U、²³⁸U的半衰期分别为7×10⁸年、4.4×10⁹年，导致污染的进一步加剧和持续，成为我国亟待治理的重要环境污染问题。

对已产生的铀、镉污染水体经收集后目前主要是采取化学处理的方法(沉淀法或吸附法)，向水中添加某些化学物质与铀和镉反应生成难溶性沉淀。这些处理方式虽然处理工艺简单，但是处理过程产生的沉淀产物量大，处理成本高，二次污染风险高。相比之下，采用微生物法，将放射性废水中的溶解态铀转化为难溶的磷酸铀酰沉积物，并且可以高效吸附废水中的镉，同步降低废水中铀和镉的浓度，具有投资成本低、效率高，操作简单，沉淀产物量少且稳定等优点。通过微生物的酶促作用促进无机/有机磷源中磷酸根的释放，从而将水体中的污染物转变为稳定的金属-磷酸盐矿物。

因此，开发一种对铀、镉污染水体治理效果好，价格低廉，操作简便，可规模化应用，且无二次污染的微生物菌剂成为该技术领域急需解决的迫切要求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种枯草芽孢杆菌。

本发明的第二个目的在于提供富集上述枯草芽孢杆菌的有机磷培养基及无机磷培养基。

本发明的第三个目的在于提供上述枯草芽孢杆菌在溶解无机磷和有机磷中的应用。

本发明的第四个目的在于提供上述枯草芽孢杆菌在处理铀、镉污染水体中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种处理铀、镉污染水体的方法，该方法利用植酸钙为有机磷源，使用上述枯草芽孢杆菌可以有效降低污染水体中铀、镉的浓度。

为了实现上述目的，本发明提供一种枯草芽孢杆菌，该菌株的分类命名为：Bacillus subtilis GRINML10；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2019年11月20日；保藏编号：CCTCC NO：M 2019958。

本发明还提供一种分离培养上述的枯草芽孢杆菌的培养基，该培养基配方为：葡萄糖5～10g/L，KCl 0.1～0.5g/L，MgCl₂·6H₂O 0.1～0.5g/L，(NH₄)₂SO₄0.5～1.0g/L，Ca₃(PO₄)₂ 5～10g/L，酵母浸提物2.0～4.0g/L，0.4％溴酚蓝2.0～3.0mL/L，配制时将上述成分溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0，再加入质量百分比为1.5～2.0％的琼脂。

本发明还提供一种用于富集培养上述的枯草芽孢杆菌的无机磷培养基，该培养基配方为：葡萄糖5～10g/L，MgCl₂·6H₂O 0.5～1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 5～10g/L，KCl 0.2～0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0～2.0g/L，Ca₃(PO₄)₂ 3.0～5.0g/L，配制时将上述成分溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0。

用于富集培养上述的枯草芽孢杆菌的有机磷培养基，该培养基配方为：植酸钙0.1～1g/L，MgCl₂·6H₂O 3～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L，KCl 0.1～0.5g/L，(NH₄)₂SO₄0.05～0.1g/L。

当用于培养枯草芽孢杆菌时上述成分溶于蒸馏水，当用于治理污水时，将上述成分溶于废水。

本发明还提供一种处理铀、镉污染水体的方法，包括以下步骤：

1)将上述的枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，30～35℃、150～180rpm振荡培养24～48h，制得种子液；

2)将步骤1)制得的种子液按体积百分比1～3％的接种量接种至上述有机磷液体培养基中，30～35℃，150rpm振荡培养24～48h，制得发酵液；

3)向污染水体中加入步骤2)制得的发酵液和液体培养基成分，发酵液加入比例为1～4v/v％；

4)将步骤3)中的水体继续放入摇床中在30～35℃，150rpm条件下振荡处理，每隔24h取样检测水体中U(VI)、Cd和可溶性磷浓度，直至U(VI)和Cd的浓度不再发生变化。

进一步地，步骤3)中所述的液体培养基成分为：在每L废水中加入植酸钙0.1～1g，MgCl₂·6H₂O 3～5g，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g，KCl 0.1～0.5g，(NH₄)₂SO₄0.05～0.1g。

本发明所用枯草芽孢杆菌的菌种分离自江西省某铀尾渣库周边土壤。

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GRINML10具有如下特点：菌种为杆菌，菌体大小为0.6～0.9×2～3μm。革兰氏染色为阳性，有芽孢，能运动，周生鞭毛，在含磷培养基中菌落为微黄色，直径在2～3mm，菌落为圆形。菌种生长的pH范围为3.0～8.0，最适pH为6～7；生长温度范围在20～45℃，最适生长温度为30～35℃。菌种能在含磷培养基中生长，且在铀、镉污染环境中生长状况良好。

本发明的特点在于：

1)本发明提供的枯草芽孢杆菌同时具有溶解有机磷和无机磷的作用，且对有机磷的溶解能力高达400～450mg/L。

2)本发明提供的枯草芽孢杆菌能在较宽的pH值范围内对铀和镉具有较高的耐受性，可耐受pH为3～8，对铀和镉的耐受浓度分别高达100mg/L和200mg/L，可以处理含铀的浓度范围为0.5～100mg/L，含镉浓度范围为1～200mg/L的污染水体，处理后水体的pH值能自然变为中性。

3)本发明提供的枯草芽孢杆菌能够通过解磷作用沉淀矿化污染水体中铀的同时，同步实现菌株对镉的吸附作用。

4)本发明方法对铀、镉污染水体的治理过程中添加植酸钙既可作为磷源，又能作为碳源，无需添加其他额外的碳源，同时不添加任何有毒的化学试剂，不会对环境造成二次污染。

5)本发明方法对铀、镉污染水体的治理过程中能在1h内去除铀、镉污染水体中超过70％的U(VI)和80％的Cd，对U(VI)去除率高达90％，对Cd去除率超过90％。

6)本发明方法与目前工业上应用的方法相比，具有效率高，操作简单，对环境扰动性小等优点。

7)本发明微生物对人、畜安全，无环境污染问题。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一株枯草芽孢杆菌及其处理铀、镉污染水体的方法，该菌对铀和镉的耐受性高，能在较宽的pH值条件下促进水中铀的沉淀和镉的吸附，适用于处理高浓度铀和镉复合污染水体。该方法以植酸钙作为磷源和碳源实现枯草芽孢杆菌对铀和镉的协同治理。本发明提供的枯草芽孢杆菌对人、畜安全，没有环境污染问题，并且具有操作简单、效率高、适用范围广的特点。

附图说明

图1为本发明菌株Bacillus subtilis GRINML10的扫描电镜图。

图2为本发明菌株Bacillus subtilis GRINML10的解无机磷/有机磷效果。

图3为本发明菌株Bacillus subtilis GRINML10的铀耐受性生长曲线。

图4为本发明菌株Bacillus subtilis GRINML10的镉耐受性生长曲线。

具体实施方式

下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明提供一种枯草芽孢杆菌，该菌株的分类命名为：Bacillus subtilisGRINML10；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2019年11月20日；保藏编号：CCTCC NO：M 2019958。

用于分离上述枯草芽孢杆菌的培养基配方为：葡萄糖5～10g/L，KCl 0.1～0.5g/L，MgCl₂·6H₂O 0.1～0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5～1.0g/L，Ca₃(PO₄)₂ 5～10g/L，酵母浸提物2.0～4.0g/L，0.4％溴酚蓝2.0～3.0mL/L，配制时将上述成分溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0，再加入质量百分比为1.5～2.0％的琼脂，121℃灭菌20min，倒平板。

用于富集上述枯草芽孢杆菌的无机磷培养基配方为：葡萄糖5～10g/L，MgCl₂·6H₂O 0.5～1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 5～10g/L，KCl 0.2～0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0～2.0g/L，Ca₃(PO₄)₂ 3.0～5.0g/L，溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0，121℃灭菌20min。

用于富集上述枯草芽孢杆菌的有机磷培养基配方为：植酸钙0.1～1g/L，MgCl₂·6H₂O 3～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L，KCl 0.1～0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.05～0.1g/L，121℃灭菌20min。

用于富集上述枯草芽孢杆菌的LB液体培养基配方为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0，121℃灭菌20min。

实施例1：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GRINML10菌株的筛选及鉴定。

实验菌株分离自江西省某铀尾渣库周边土壤，具体实施步骤如下：

1)称取5g铀尾渣周边土壤，过20目筛以除去尾渣中大块的石子，然后倒入250mL锥形瓶中，同时加入100mL无菌水，于30℃摇床中150rpm振荡6h，随后取出于室温中静置30min。取1mL上清液，按照稀释涂布平板法，将上清液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6依次稀释，取每一个稀释度的稀释液，均匀地涂布在分离固体培养基上，每个稀释度下重复3个平板。将所有平板标记封口，并倒置于恒温箱中培养7d。

2)用接种环挑取解磷圈明显的单个菌落，接种于灭菌的分离固体培养基中，经多次纯化分离初步筛选出解磷菌。

3)用16S rDNA克隆文库技术分析鉴定菌种。将菌液离心并提取总DNA，利用PCR技术用细菌通用引物27f和1492r扩增16S rDNA片段。扩增产物送上海生工生物科技有限公司进行测序。将所得序列经Blast比较表明，该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillussubtilis GRINML10，保藏编号为CCTCC NO：M 2019958。菌株的扫描电镜图如图1所示。该菌株为杆菌，菌体大小为0.6～0.9×2～3μm，革兰氏染色为阳性，有芽孢，能运动，周生鞭毛。

实施例2：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GRINML10对无机磷和有机磷的溶解能力

1)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GRINML10接种于100mL的LB液体培养基中，30℃活化培养24h，制得活化菌株发酵液。

2)将活化菌株发酵液，按照接种量为3v/v％分别接种至装有100mL的无机磷富集培养基或100mL的有机磷富集培养基的三角瓶中，30℃、150r/min下培养14d。

检测上清液中可溶性磷的浓度(前8天每天检测，8-14天每隔一天检测)，用溶液中可溶性磷浓度来表征菌株对磷的溶解能力。可溶性磷浓度测定方法按照GB/T 5750.5-2006准则规定的使用磷钼蓝分光光度法，结果如图2所示。

从图2可以看出，14天内无机磷培养基中可溶性磷浓度高达397.67mg/L，有机磷培养基中可溶性磷浓度高达453.33mg/L，并且能维持长期稳定的解磷率，这说明本发明提供的枯草芽孢杆菌具有解无机磷和有机磷能力。现有菌株的解磷量一般在几十至一两百(mg/L)之间，并且一般仅具有解无机磷或有机磷中一种的作用，而本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株不仅可以同时具有解无机磷和有机磷的作用，并且解磷量高于现有菌株。

实施例3：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GRINML10对铀、镉的耐受性

1)将在LB液体培养基中生长到对数期的枯草芽孢杆菌按3％的接种量接种到有机磷富集培养基中30℃，150rpm培养48h。

2)向培养液中分别加入用0.22μm滤膜过滤后的硝酸铀酰标准溶液至其中的U(VI)浓度分别为20mg/L，50mg/L，100mg/L，或分别加入氯化镉标准溶液至镉浓度分别为50mg/L，100mg/L，200mg/L继续恒温震荡培养；

3)每隔24h测定不同U(VI)浓度和不同Cd浓度的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisGRINML10 OD₆₀₀值，培养过程不同U(VI)浓度OD₆₀₀值如图3所示，不同Cd浓度OD₆₀₀值如图4所示。从图3和图4可以看出，不同浓度的U(VI)浓度和Cd浓度条件下，Bacillus subtilisGRINML10均能较好的生长，表现出良好的铀、镉耐受性。

实施例4：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GRINML10对高浓度铀、镉水溶液的处理效果

1)将在LB液体培养基中生长到对数期的枯草芽孢杆菌按3v/v％的接种量分别接种至有机磷富集培养基中，30℃，150rpm培养48h后；

2)向培养液中加入用0.22μm滤膜过滤后的硝酸铀酰和氯化镉标准溶液至溶液中的U(VI)浓度为50mg/L、Cd浓度为100mg/L，继续恒温震荡培养；

3)以不加菌的有机磷富集培养基作为对照，每组实验设置三个平行。每隔24h测定上清液中U(VI)、Cd和可溶性磷浓度的变化以及细菌OD₆₀₀值。

通过如下公式计算铀和镉的去除率：铀/镉的去除率(％)＝(培养基初始铀/镉浓度-发酵后培养基铀/镉浓度)/培养基初始铀/镉浓度×100。

实验结果如表1和表2所示。

表1枯草芽孢杆菌对铀和镉的去除率

由表1可知枯草芽孢杆菌在铀浓度为50mg/L、镉浓度100mg/L的溶液中，细菌OD₆₀₀值能维持在1.0以上。在枯草芽孢杆菌的作用下溶液中的铀在1h内能迅速沉淀下来，枯草芽孢杆菌对铀和镉的去除率为71％和85.62％。随着反应时间的延长，去除率进一步增加，最高去除率分别可达80.25％和95.09％，远高于对照组中铀和镉的去除率。因此，枯草芽孢杆菌对高浓度铀和镉均具有较好的耐受性，同时它能促进污染水体中铀和镉的去除。

表2枯草芽孢杆菌对有机磷的溶解能力

溶液中可溶性磷浓度变化如表2所示。由表2可知枯草芽孢杆菌具有溶解有机磷的作用。反应1h后，可溶性磷浓度迅速增加，可增加到428.67mg/L。随着反应时间的延长，可溶性磷浓度进一步的增加，最高浓度可达435.74mg/L，远高于对照组中铀的浓度，此时溶液中铀的去除率也不再变化。因此在实际应用中可以适当降低有机磷添加量，从而避免药剂的浪费，进一步降低成本。

实施例5：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GRINML10对含铀、镉废水的处理效果

将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GRINML10接种至100mL的LB液体培养基中，在30℃，150rpm培养48h至菌株OD₆₀₀为0.8后，将培养后的菌液加入含铀、镉废水中(废水中铀的浓度为1025.15μg/L，镉的浓度为13.68mg/L)，接种量为3v/v％，同时按照每L废水加入植酸钙0.1～1g，MgCl₂·6H₂O 3～5g，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g，KCl 0.1～0.5g，(NH₄)₂SO₄0.05～0.1g，96h后测定废水中铀和镉的浓度。铀浓度从1025.15μg/L下降到27.8μg/L，镉浓度从13.68mg/L下降到0.15mg/L，铀和镉的去除率分别高达97.29％和98.90％。

本发明提供的枯草芽孢杆菌利用解磷特性可以高效处理含铀、镉废水。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GRINML10能促进磷源溶解从而释放可溶性磷酸根，产生的磷酸根与铀快速反应生成稳定的磷酸铀酰沉淀，同时菌体细胞自身还具有高效吸附镉的作用，从而实现废水中铀和镉的同步高效去除。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施案例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于，该菌株的分类命名为：Bacillus subtilisGRINML10；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2019年11月20日；保藏编号：CCTCC NO：M 2019958。

2.一种用于分离如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的培养基，其特征在于，该培养基配方为：葡萄糖5～10g/L，KCl 0.1～0.5g/L，MgCl₂·6H₂O 0.1～0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5～1.0g/L，Ca₃(PO₄)₂ 5～10g/L，酵母浸提物2.0～4.0g/L，0.4％溴酚蓝2.0～3.0mL/L，配制时将上述成分溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0，再加入质量百分比为1.5～2.0％的琼脂。

3.一种用于富集如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的无机磷培养基，其特征在于，该培养基配方为：葡萄糖5～10g/L，MgCl₂·6H₂O 0.5～1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 5～10g/L，KCl 0.2～0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0～2.0g/L，Ca₃(PO₄)₂3.0～5.0g/L，配制时将上述成分溶于蒸馏水中，调整pH为6.0～7.0。

4.一种用于富集如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的有机磷培养基，其特征在于，该培养基配方为：植酸钙0.1～1g/L，MgCl₂·6H₂O 3～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L，KCl 0.1～0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.05～0.1g/L。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在溶解无机磷和有机磷中的应用。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在处理铀、镉污染水体中的应用。

7.根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌在处理铀、镉污染水体中的应用，其特征在于，所述污染水体pH值为3～8，铀的治理浓度范围为0.5～100mg/L，镉的治理浓度范围为1～200mg/L。

8.一种处理铀、镉污染水体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，30～35℃、150～180rpm振荡培养24～48h，制得种子液；

2)将步骤1)制得的种子液按体积百分比1～3％的接种量接种至权利要求4所述有机磷液体培养基中，30～35℃，150rpm振荡培养24～48h，制得发酵液；

3)向污染水体中加入步骤2)制得的发酵液和液体培养基成分，发酵液加入废水的比例为1～4v/v％；

9.如权利要求8所述的处理铀、镉污染水体的方法，其特征在于：所述液体培养基成分为：在每L废水中加入植酸钙0.1～1g，MgCl₂·6H₂O 3～5g，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g，KCl0.1～0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.05～0.1g。