CN106244504A

CN106244504A - 具有降解有机磷和抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其菌剂

Info

Publication number: CN106244504A
Application number: CN201610879210.1A
Authority: CN
Inventors: 鹿秀云; 李社增; 马平; 郭庆港; 张晓云
Original assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2016-10-08
Filing date: 2016-10-08
Publication date: 2016-12-21
Anticipated expiration: 2036-10-08
Also published as: CN106244504B

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株PHYDG1，己保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13037。还公开了利用PHYDG1菌株生产的微生物菌剂。本发明PHYDG1菌株降解有机磷效果好，提高了土壤肥效，并且对棉花黄萎病、枯萎病和立枯病的三种病原菌抑菌效果好，抑菌谱广；本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染问题，并且制备方法简单、成本低、使用简单。

Description

具有降解有机磷和抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其菌剂

技术领域

本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种具有降解有机磷和抑菌双重作用的枯草芽孢杆菌；以及含有该枯草芽孢杆菌的微生物菌剂；还涉及它们在促进作物生长和防治病害方面的应用。

背景技术

磷是维持作物正常发育必需的营养元素之一，是组成植物体内核酸、多种酶和ATP等的重要成分，并且在参与植物呼吸作用和光合作用等新陈代谢活动中起着其他元素不可替代的作用。作物生长发育所需要的磷主要来自肥料和土壤的供应。土壤中的磷素是以无机态和有机态两种形式存在的，土壤中有机磷约占全磷量的40％-50％，它们在土壤中主要以植酸盐、磷脂、有机磷酸盐等形式存在，其中植酸约占有机磷的10％-50％，是土壤有机磷的重要存在形式，磷脂占1％-5％，核苷酸占0.2％-2.5％，它们不能被植物直接吸收利用，它们必须在微生物的作用下转变成可利用的无机态形式才能被吸收利用，而解有机磷微生物的解磷机理多为酶解，土壤中的植酸类有机磷可以通过有机磷细菌产生的植酸酶将其分解并释放出磷酸，从而被作物吸收利用；另外土壤中的磷细菌可将核酸类有机磷通过自身产生磷酸酶水解为磷酸和糖类物质，磷酸提供作物磷素营养，而糖类物质可以作为作物能量物质。

土壤中解有机磷的微生物有芽胞杆菌，如巨大芽胞杆菌(B.megatherium)、蜡状芽胞胞杆菌(B.cereus)等；变形菌属的一些种(Proteus sp.)；沙雷氏菌属的一些种(Serratia sp.)。芽孢杆菌(Bacillius sp)是一种受到广泛关注的植物根际促生菌，具有分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽胞、贮藏期长和使用方便等特点，是一种理想的微生物肥料。因芽孢杆菌能产生内生芽胞，有极强的抗逆能力，更有利于菌剂的生产，在剂型加工环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对作物具有促生功能和对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是实现“双减”最有效方法之一。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有降解有机磷和抑菌双重作用的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株降解有机磷能力强，并且具有高效抑菌和抑菌谱广等优点。

本发明另一目的在于提供一种微生物菌剂。

本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。

本发明第四目的在于提供上述枯草芽孢杆菌在降解有机磷上的用途。

本发明第五目的在于提供上述枯草芽孢杆菌在促进作物生长上的用途。

本发明第五目的在于提供上述枯草芽孢杆菌在防治棉花病害上的用途。

本发明第六目的在于提供上述微生物菌剂在降解有机磷上的用途。

本发明第七目的在于提供上述微生物菌剂在促进作物生长上的用途。

本发明第八目的在于提供上述微生物菌剂在防治棉花病害上的用途。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株PHYDG1，己于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.13037。

本发明还提供了利用上述枯草芽孢杆菌菌株PHYDG1生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌PHYDG1菌体。

上述微生物菌剂可以为液体制剂。

上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的PHYDG1菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；

(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mL LB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下培养10～16小时，得种子液；

(3)发酵培养：按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基(pH值为7.2)中，在温度为25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养24～40h，得发酵液；

(4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为PHYDG1菌株的液体制剂。

所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。

上述制备方法步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL。

上述制备方法步骤(1)中所述的LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。

上述制备方法步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl 0.1～1.0％，MnSO₄·H₂O 0.5～1.0％，其余为水。

所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、NaCl和MnSO₄·H₂O混合，再加水，调节pH搅拌均匀即可。

上述微生物菌剂，所述的枯草芽孢杆菌PHYDG1的活菌数大于1.8×10⁸cfu/mL。

上述枯草芽孢杆菌PHYDG1在降解有机磷上的应用。

上述枯草芽孢杆菌PHYDG1在促进作物生长上的应用。

上述枯草芽孢杆菌PHYDG1在防治棉花病害上的应用。

上述应用中所述的棉花病害是指棉花黄萎菌(V.dahliae)、棉花枯萎菌(F.oxysporum)或棉花立枯菌(R.solani)等。

上述微生物菌剂在降解有机磷上的应用。

上述微生物菌剂在促进作物生长上的应用。

上述微生物菌剂在防治棉花病害上的应用。

上述微生物菌剂的使用方法：用水将上述所得微生物菌剂稀释至活菌体数为10⁷CFU/mL，于番茄移栽定植后进行灌根即可。

PHYDG1菌株的筛选分离过程

2012年4月河北省农林科学院植物保护研究所从河北省石家庄市驼梁山中五点采集土样，称取1.0g风干土样加入带灭菌玻璃珠的三角瓶中，再加入99mL无菌水，静置20min，在摇床上30℃、180r/min充分振荡30min后，然后按10倍稀释法进行梯度稀释，分别取10^-3，10^-4，10^-5的稀释液100μL，涂布于解有机磷培养基上，每个浓度3个重复。涂好后在洁净台中静置5-10min，待菌液吸附进培养基内，于35℃恒温培养5-7d。并以透明圈法、钼锑抗比色法、平板对峙法、盆栽试验法进行评价，最终筛选出具有解磷功能和抑菌双重功能的菌株，定名为PHYDG1。

PHYDG1菌株的分类鉴定：

(1)形态特征鉴定

在LB培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株PHYDG1属于芽孢杆菌。

(2)利用16S rDNA序列鉴定分类

以PHYDG1的基因组DNA为模板，以27F和1492R为引物对16S rDNA进行PCR扩增，所述的引物序列为：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID No:1)；

1492R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'(SEQ ID No:2)；

16S rDNA的PCR反应体系为50μL：10×PCR Buffer(Mg2+)5μL；dNTP Mixture(2.5mM)5μL；rTaq DNA聚合酶(0.5U/μL)1μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL；PHYDG1的基因组DNA 50ng；ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃1.5min，35个循环；72℃10min。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送往上海生工生物工程有限公司测序，得到PHYDG1的16S rDNA序列(见SEQ ID No:3)。将所得的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果该菌株与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到100％；同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树(见图1)，PHYDG1与芽孢杆菌属聚合到一起，说明PHYDG1属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(3)利用gyrB基因序列鉴定分类

以PHYDG1基因组DNA为模板，以芽孢杆菌gyrB基因兼并引物gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列为：

gyrB-F：5'-GAAGCACGGACAATCACC-3'(SEQ ID No:4)；

gyrB-R：5'-TCCAAAGCACTCTTACGG-3'(SEQ ID No:5)。

gyrB的PCR反应体系为50μL：10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL；dNTP Mixture(2.5mM)5μL；rTaq DNA聚合酶(0.5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)2μL，gyrB-R(10μmol/L)2μL；PHYDG1基因组DNA 50ng；ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，35个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得PHYDG1菌株的gyrB基因序列(见SEQ ID No:6)。将获得的PHYDG1菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，结果发现PHYDG1与枯草芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高，达到99％；同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树(见图2)，结果PHYDG1菌株与枯草芽孢杆菌聚合到一起，说明PHYDG1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且是一个新菌株。

综合以上形态特征、16S rDNA和gyrB基因序列同源性对比分析的结果，可知PHYDG1属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且与现有的任何芽孢杆菌菌株不同，是一个新的枯草芽孢杆菌菌株。

本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明PHYDG1菌株降解有机磷效果好，为作物提供肥效且一个高效的微生物；(2)本发明PHYDG1菌株对病原菌的抑菌效果好，对棉花三种病原菌都有很好的抑菌效果，抑菌谱广；(3)本发明PHYDG1菌株降解有机磷能力强，肥效高，与对照相比，经过PHYDG1处理的番茄株高、地上鲜重、地下鲜重、基质和植株磷含量分别比对照增加3.08％、39.58％、73.21％、6.09％和115.33％；(4)本发明微生物菌肥对人、畜安全，没有环境污染问题；(5)本发明制备方法简单、成本低、使用简单。

附图说明

图1为根据16S rDNA序列获得的PHYDG1菌株系统发育树。

图2为根据gyrB基因序列获得的PHYDG1菌株系统发育树。

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1枯草芽孢杆菌PHYDG1微生物菌剂的制备

按照如下步骤进行：

(1)菌种活化：将保存于-80℃的菌株PHYDG1(枯草芽孢杆菌菌株PHYDG1己于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13037)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL)上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培养12小时，得活化的菌株；

(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，水1000mL)，在250mL三角瓶中装入LB液体培养基100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤(1)中活化好的菌株，在30℃、摇床转速190rpm的条件下进行振荡培养12小时，得种子液；

(3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉1.5％，黄豆粉2.0％，NaCl 0.5％，MnSO₄·H₂O 0.6％加入水中，搅拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃下灭菌30分钟，再降温到30℃备用；

(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶玉米粉黄豆粉培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃、摇床转速180rpm条件下进行发酵培养24小时，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率(芽孢率(％)＝成熟芽孢数/(成熟芽孢数+菌体数)×100)；芽孢率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养36小时，得枯草芽孢杆菌PHYDG1的液体制剂。

实施例2枯草芽孢杆菌PHYDG1降解有机磷能力定性测定试验

按照如下方法进行：

用灭菌牙签将实施例1步骤(1)活化好的菌株PHYDG1点接接种在解有机磷平板培养基(其组成成分及其重量比为：葡萄糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl0.1g，MgCl₂·6H₂O 5.0g，植酸钙2.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH：7.0-8.0)上，置于30℃恒温培养箱培养72小时，测量透明圈直径及菌落的直径。

结果枯草芽孢杆菌PHYDG1在含有植酸钙的有机磷平板培养基上产生直径17.0毫米的透明圈，说明枯草芽孢杆菌PHYDG1能够很好降解有机磷植酸钙，具有降解土壤中有机磷的潜力。

实施例3枯草芽孢杆菌PHYDG1降解有机磷能力定量测定试验

本试验于2015年8月上旬在河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室内进行。按照如下方法进行：

(1)发酵培养基制备：按照重量比将葡萄糖10.0g、(NH₄)₂SO₄ 0.2g、MgSO₄·7H₂O0.5g、KCl 0.1g、MgCl₂·6H₂O 5.0g、植酸钙2.0g和琼脂20.0g加入到蒸馏水1000mL中，混合均匀，得发酵培养基(pH：7.0-8.0)；将发酵培养基按照50mL/300mL瓶的量装入到锥形瓶中，高温高压灭菌，待用。

(2)发酵液制备：将实施例步骤(2)中所得的PHYDG1菌株种子液和空白对照培养液(不接种PHYDG1菌株的LB液体培养基)分别按照重量百分比为4％的接种量接种于步骤(1)制备的发酵培养基中，每组3个重复，在30℃、180r/min培养6d，得发酵液。

(3)绘制OD720nm-磷标准曲线：分别准确吸取5mg/L的KH₂PO₄标准溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于50mL比色管中，加1～2滴2，4-二硝基苯酚作指示剂，用10％的NaOH和5％稀硫酸溶液调节pH值，加水使各比色管的总体积达到30mL，摇匀；最后加入钼锑抗试剂5.0mL混匀显色，定容。30min后，在720nm波长下进行比色，以磷浓度值为横坐标，相应的OD值为纵坐标，绘成标准曲线。获得磷标准曲线回归方程y＝0.3951x-0.00133(R2＝0.99989，y＝OD值，x＝磷浓度)。

(4)发酵液处理：将步骤(2)中培养所得的发酵液转移至无菌的离心杯中，采用KQ5200DE型数控超生波清洗器进行超声波细胞破碎，破碎条件：200-240V，2A，50/60Hz，时间20min。使之释放出细胞内的有效磷。以8000r/min的转速离心10min，然后取2.5mL上清液于50mL比色管中，加2滴2，4-二硝基苯酚作指示剂，用10％NaOH和5％稀硫酸溶液调节pH值至溶液刚呈微黄色，加钼锑抗显色剂5mL，定容，反应30min后。用T6新世纪紫外可见分光光度计测定上清液在720nm处的OD值。根据标准曲线得出上清液中的有效磷含量。

(5)结果计算：由样品溶液比色所得吸收值在工作曲线上(y＝0.3951x-0.00133(R2＝0.99989，y＝OD值，x＝磷浓度)。算出相应的比色溶液的含磷量(mg/L)，再按下式计算发酵液中有效磷含量：

有效磷(mg/L)＝比色液的磷(mg/L)×稀释倍数。

表1枯草芽孢杆菌PHYDG1降解有机磷能力定量测定试验结果

菌株编号	OD₇₂₀(nm)	可溶性磷含量(mg/L)
			PHYDG1	0.656	33.27

结果(见表1)接种枯草芽孢杆菌PHYDG1的发酵培养液中可溶性磷含量与空白对照相比增加到33.27mg/L，表明枯草芽孢杆菌PHYDG1菌株具有降解有机磷植酸钙的能力。

实施例4枯草芽孢杆菌PHYDG1对番茄植株的促生长作用试验

(一)试验处理：

(1)处理1：植酸钙+PHYDG1发酵液+缺磷营养液

(2)处理2：植酸钙+原发酵培养基+缺磷营养液

(二)盆栽试验设计

本试验选用的基质为沙子，用水冲洗3遍，风干备用，pH：6.4左右，有效磷：0.96mg/kg，底物(植酸钙)1g/kg基质。每个处理3个重复，每个重复处理1盆，每盆含有3棵番茄苗。

(二)试验方法：本试验于2015年12月上旬在河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室内进行。花盆(高：21cm、盆口直径：22cm、盆底直径：15cm)装沙量4kg/盆(基质为沙子，沙子用清水冲洗3遍，风干备用)，选取长势一致的番茄幼苗移栽于花盆中，每盆3株，置于温室中培养，缓苗后开始试验。试验设置两个处理，处理1将实施例3步骤(2)制备的PHYDG1菌株发酵液稀释液(浓度为1×10⁷CFU/mL)300mL/盆浇灌于作物根部，处理2以浇灌等量的实施例3步骤(1)制备的原发酵培养基稀释液为空白对照。期间加强番茄病虫害管理，适时补充水分，每次500mL/盆。5d浇一次缺磷营养液(缺磷营养液的成分见专利申请201110107663X)，每次300mL/盆。40d后测定番茄的株高、地上部鲜重和地下部鲜重、基质中的有效磷以及番茄植株体内磷含量等指标。

表2 PHYDG1菌株对盆栽番茄株高和鲜重的影响试验结果

结果(见表2)与空白对照相比，经过枯草芽孢杆菌PHYDG1发酵液处理的番茄株高增高了3.08％；地上部鲜重增长率为39.58％，地下部鲜重增长率为73.21％，番茄植株地上部鲜重、地下部鲜重均与空白对照之间存在显著差异。上述结果说明本发明枯草芽孢杆菌PHYDG1菌株促进番茄植株生长的效果非常显著。

表3 PHYDG1菌株对基质和番茄植株有效磷的影响试验结果

处理	基质中磷含量(mg/kg)	增长率(％)	植物磷含量(mg/L)	增长率(％)
					处理1	1.22	6.09	5.63	115.33
处理2	1.15	－	2.61	－

从表3中可以看出，经本发明枯草芽孢杆菌菌株PHYDG1处理后，土壤中有效磷增长率为6.09％；在番茄植株磷方面，经本发明枯草芽孢杆菌菌株PHYDG1处理后，番茄植株中有效磷增长率为115.33％。说明本发明枯草芽孢杆菌PHYDG1能够有效降解土壤中的有机磷并促进番茄植株对降解后的有效磷的吸收，从而促进番茄植株的生长。

实施例5枯草芽孢杆菌PHYDG1对三种重要病害病原菌的抑制作用试验

(一)供试病害病原真菌来源：

(1)棉花黄萎菌WX-1：分离自河北省邢台市威县棉花黄萎病病株，经河北农业大学鉴定为大丽轮枝菌(Verticillium dahaliae)。

(2)棉花枯萎菌FOV-1分离自河北省邯郸市曲周县棉花枯萎病病株，经河北农业大学鉴定为尖孢镰刀菌棉花专化型(Fusarium oxyporium f.sp.vasinfectum)。

(3)棉花立枯菌RHS-1分离自河北省保定市高阳县棉花苗期立枯病病株，经河北农业大学鉴定立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，

上述菌株致病力测定均表现为强致病力。

(二)试验方法：

本试验于2015年11月上旬在河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室内进行。首先将供试的病原真菌在PDA平板上活化培养3-7天，然后用打孔器在菌落边缘区域打孔制成菌片，接着将供试病原真菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例1步骤(1)活化的枯草芽孢杆菌PHYDG1点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照(不点接PHYDG1菌株的供试病原真菌)。在25℃恒温培养3-10天，逐日观察PHYDG1菌株和供试病原真菌的生长情况，待空白对照病原菌长至培养皿边缘时，测量三种病原菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种PHYDG1后的抑制生长半径)，拮抗作用用抑菌率表示。抑菌率的计算公式为：

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100)。

结果(见表4)：枯草芽孢杆菌PHYDG1对棉花黄萎菌的抑制率为65.14％，、对棉花枯萎菌的抑制率为74.47％，对棉花立枯菌的抑制率为77.63％，说明本发明枯草芽孢杆菌PHYDG1对这三种病原菌具有明显的抑制作用，具有防治棉花黄萎病、棉花枯萎病、棉花立枯病的生防潜力。

表4 PHYDG1菌株对三种病原菌的抑菌作用试验结果

病原菌	正常生长(mm)	抑制生长(mm)	抑菌率(％)
				棉花黄萎菌(V.dahliae)	35.0	12.2	65.14
棉花枯萎菌(F.oxysporum)	38.0	9.7	74.47
				棉花立枯菌(R.solani)	38.0	8.5	77.63

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株PHYDG1，己于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13037。

2.利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株PHYDG1生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为枯草芽孢杆菌PHYDG1菌体。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于为液体制剂。

4.权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将低温保存的PHYDG1菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；所述的LB平板培养基或LB斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL；

(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mL LB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下培养10～16小时，得种子液；LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL；

(3)按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基(pH值为7.2)中，在温度为25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养24～40h，得发酵液；所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl 0.1～1.0％，MnSO₄·H₂O 0.5～1.0％，其余为水；

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌PHYDG1在降解有机磷上的应用。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌PHYDG1在促进作物生长上的应用。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌PHYDG1在防治棉花病害上的应用；其中所述的棉花病害是指棉花黄萎菌(V.dahliae)、棉花枯萎菌(F.oxysporum)或棉花立枯菌(R.solani)。

8.权利要求2或3所述的微生物菌剂在降解有机磷上的应用。

9.权利要求2或3所述的微生物菌剂在促进作物生长上的应用。

10.权利要求2或3所述的微生物菌剂在防治棉花病害上的应用；其中所述的棉花病害是指棉花黄萎菌(V.dahliae)、棉花枯萎菌(F.oxysporum)或棉花立枯菌(R.solani)。