CN105199997A - 一种用于防治棉花立枯病的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物防治领域；公开了一种用于防治棉花立枯病的枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis)菌株HMB27703，其保藏编号为CGMCC？No.11458。本发明还公开了利用该菌制备的微生物菌剂，以及它们在防治棉花立枯病上的应用。本发明枯草芽孢杆菌HMB27703对棉花立枯病的药效高，平均防效在80.0％以上；其次，杀菌谱广，除了棉花立枯病外，还对番茄灰霉病和棉花枯萎病有明显的防治效果；此外，本发明枯草芽孢杆菌针对性强，持效期长，且不易产生抗药性；本发明微生物菌剂对人、畜安全，环境污染小；本发明制备方法简单、成本低、使用简单。

Description

一种用于防治棉花立枯病的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于农业生物防治领域，具体涉及一种用于防治棉花立枯病的枯草芽孢杆菌，以及含有该枯草芽孢杆菌的微生物菌剂，还涉及它们在防治棉花立枯病上的应用。

背景技术

棉花立枯病是一种由立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的棉花苗期病害，严重影响棉花的正常生长。低温多雨年份棉花立枯病发生尤为严重。

棉花立枯病的防治以化学药剂拌种或包衣防治为主，但防效欠佳，而且由于存在环境污染问题不符合农业生态可持续发展的需要。目前，也未发现抗立枯病的棉花品种，抗病育种的可行性也很小。因此，生产上仍缺乏有效、环保的防治措施。生物防治方法由于具有对人畜无害、环境污染小、专化性强、持效期长和不易产生抗药性等优点，日益受到人们的青睐。而筛选有效生防微生物是开发微生物源农药的基础。

芽孢杆菌(Bacilliussp)是一种受到广泛关注的生防细菌。以其分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽胞、贮藏期长和使用方便等特点，成为一种理想的生防微生物。因芽孢杆菌能产生内生芽胞，有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，在剂型加工环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。

目前，用于防治作物立枯病的芽孢杆菌的专利主要有：解淀粉芽孢杆菌SZ－60(申请号：2014100170816)、枯草芽孢杆菌G68(申请号为：2014102479010)、枯草芽孢杆菌DPPG-26(申请号：2014103868726)、萎缩芽孢杆菌DPPG-28(2014104612134)、多粘类芽孢杆菌HY96-2(专利号：021510199)、枯草芽孢杆菌HL259(专利号：2005101048723)、枯草芽孢杆菌B579(专利号：2008101531801)、枯草芽孢杆菌NJN43(专利号：2009101833581)、枯草芽孢杆菌NB12(专利号：2011104234353)和巨大芽孢杆菌SJ-7(专利号：2013102557034)等。由于病原菌的复杂性和同步进化，需要不断寻找新的抗病菌株。

经检索，没有发现本发明枯草芽孢杆菌菌株HMB27703在防治棉花立枯病方面的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于防治棉花立枯病的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、杀菌谱广等优点。

本发明另一目的在于提供一种利用上述枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂。

本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。

本发明第四目的在于提供上述枯草芽孢杆菌菌株在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花枯萎病上的用途。

本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花枯萎病上的用途。

本发明第六目的在于提供上述枯草芽孢杆菌菌株的鉴定方法。

本发明第七目的在于提供上述微生物菌剂的鉴定方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株HMB27703，己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.11458。

利用上述枯草芽孢杆菌HMB27703生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌HMB27703菌体。

上述微生物菌剂可以为液体制剂或粉剂。

上述微生物菌剂，其HMB27703的活菌数大于15.0×10⁸cfu/mL。

上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的HMB27703菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃下培养10～16小时，得活化的菌株；

(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mLLB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm条件下培养10～16小时，得种子液；

(3)发酵培养：按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基中，在温度为25～35℃、摇床转速为150～220rpm条件下发酵培养40～50h，得发酵液；

(4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为HMB27703菌株的液体制剂。

所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。

上述制备方法步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基，其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL。

上述制备方法步骤(2)中所述的LB液体培养基，其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。

上述制备方法步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl0.1～0.8％，MnSO₄·H₂O0.5～1.0％，其余为水；pH值为7.0。

所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，包括按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、NaCl和MnSO₄·H₂O混合，再加水，调节pH搅拌均匀即可。

所述的枯草芽孢杆菌HMB27703在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花枯萎病上的应用。

上述微生物菌剂在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花枯萎病上的应用。

上述微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为10⁷cfu/mL，于播种前将棉花种子浸种半小时；或将上述所得微生物菌剂用碳酸钙吸附，制作成枯草芽孢杆菌HMB27703粉剂，于棉花播种前按照药种比1：10拌种，均可达到预防棉花立枯病发生的目的。

HMB27703菌株的筛选分离过程

HMB27703菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市农科院棉田土壤中分离得到。2013年4月河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市农科院棉田中采集土样，带回实验室后称取1g土样放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液10mL加入50mL灭菌离心管中，在80℃恒温水浴30分钟，然后取1mL加无菌水9mL，即成10mL10^-3倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10^-4、10^-5、10^-6倍稀释液，取各浓度微生物悬液200μL涂于LB培养基平板上，每个浓度重复3次，在30℃恒温培养1d-3d，进行细菌的分离和纯化。并以棉花立枯病为靶标，通过平板对峙法、盆栽试验法和田间小区试验进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对棉花立枯病具有明显防治效果的菌株，定名为HMB27703。

HMB27703菌株的分类鉴定：

(1)形态特征鉴定

在LB培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB27703属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(2)利用16SrDNA序列鉴定分类

以HMB27703的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16SrDNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物序列为：

F27：5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG3’；(SEQIDNo:1)，

R1492：5’GGCTACCTTGTTACGACTT3’；(SEQIDNo:2)；

16SrDNA的扩增反应体系为50μL:10×PCRBuffer(Mg²⁺)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL，F27(10μmol/L)1μL，R1492(10μmol/L)1μL；HMB27703的基因组DNA50ng；ddH₂O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得到HMB27703的16SrDNA序列(见SEQIDNo:3)。将所得HMB27703的16SrDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB27703与芽孢杆菌属的16SrDNA同源性达到99％；构建系统发育树(见图1)，HMB27703与芽孢杆菌属聚合到一起，说明HMB27703属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(3)利用gyrB基因序列鉴定分类

以HMB27703基因组DNA为模板，利用芽孢杆菌gyrB基因简并引物gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列为：

gyrB-F：5’TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3’；(SEQIDNo:4)

gyrB-R：5’TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3’；(SEQIDNo:5)

gyrB的PCR扩增反应体系为50μL:10×PCRBuffer(Mg²⁺)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)1μL，gyrB-R(10μmol/L)1μL；HMB27703基因组DNA50ng；ddH₂O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB27703菌株的gyrB基因序列(见SEQIDNo:6)。将获得的HMB27703菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，同时利用MEGA软件(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树。结果发现HMB27703与枯草芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高；构建系统发育树(见图2)，HMB27703菌株与枯草芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB27703为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，并且是一个新菌株。

综合以上形态特征、16SrDNA和gyrB基因序列同源性对比分析的结果，可知HMB27703属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，并且和现有的枯草芽孢杆菌菌株不同，是一个新菌株。

上述枯草芽孢杆菌HMB27703菌株的鉴定方法，包括以待测菌株的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:3所示的核苷酸序列，即为HMB27703菌株。

上述枯草芽孢杆菌HMB27703菌株的鉴定方法，包括以待测菌株的基因组DNA为模板，以gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，即为HMB27703菌株。

上述微生物菌剂的鉴定方法，包括以待测菌剂中的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:3所示的核苷酸序列，即为HMB27703微生物菌剂。

上述微生物菌剂的鉴定方法，包括以待测菌剂中的基因组DNA为模板，以gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，即为HMB27703微生物菌剂。

本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明为防治棉花立枯病提供了一个高效的微生物，开辟了一个有效防治途径；(2)本发明枯草芽孢杆菌HMB27703对棉花立枯病的药效高，平均防效在80.0％以上，且针对性强；(3)本发明微生物菌剂对人、畜安全，环境污染小；(4)利用本发明防治棉花立枯病持效期长，且不易产生抗药性；(5)本发明制备方法简单、成本低、使用简单。

附图说明

图1.为根据16SrDNA序列获得的HMB27703菌株的系统发育树图。

图2.为根据gyrB基因序列获得的HMB27703菌株的系统发育树图。

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1HMB27703微生物菌剂的制备

按照如下步骤进行：

(1)菌种活化：将保存于-80℃的菌株HMB27703(枯草芽孢杆菌菌株HMB27703己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11458)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃进行活化，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培养12小时，得活化的菌株；

(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，水1000mL)，在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(1)中一接种环上述活化好的菌株，在30℃、摇床转速180rpm的条件下进行振荡培养12小时，得种子液；

(3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉1.5％，黄豆粉2.0％，NaCl0.5％，MnSO₄·H₂O0.6％加入水中，搅拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃对玉米粉黄豆粉培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；

(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶玉米粉黄豆粉培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃、摇床转速180rpm条件下进行发酵培养36小时，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽胞和总菌体数进行计数，并计算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞数/(成熟芽胞数+菌体数)×100)；芽胞率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养48小时，得枯草芽孢杆菌HMB27703的液体制剂。

实施例2枯草芽孢杆菌HMB27703对棉花立枯菌菌丝生长的抑制作用试验

(一)试验时间和地点：2013年10月在河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室内进行。

(二)试验方法：

(1)供试棉花立枯菌来源：棉花立枯菌RH-2菌株采自河北省邯郸市邱县棉花立枯病病株，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定为立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，致病力测定表现为强致病力。

(2)平板测定试验：

首先将棉花立枯菌RH-2在PDA平板上活化，培养3天后在菌落边缘区域，用打孔器打孔制成菌片，将棉花立枯菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例1步骤(1)中活化的枯草芽孢杆菌HMB27703点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照(不点接HMB27703菌株的棉花立枯菌生长情况)。25℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量棉花立枯菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种HMB27703后的抑制生长半径)，拮抗作用用抑菌率表示，计算公式：

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100)。

结果(见表1)：枯草芽孢杆菌HMB27703对棉花立枯菌的抑制率达87.18％；透明的抑菌带宽10.0毫米；说明枯草芽孢杆菌HMB27703对棉花立枯菌具有明显的抑制作用，具有防治棉花立枯病的生防潜力。

表1HMB27703菌株对棉花立枯菌的拮抗作用试验结果

菌株名称	对照生长量(mm)	处理生长量(mm)	抑菌率(％)
				HMB27703	39.0	5.0	87.18

实施例3枯草芽孢杆菌HMB27703对棉花立枯病的防治效果试验

(一)试验处理：

(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27703液体制剂；用水稀释50倍。

(2)空白对照：清水

(二)试验方法：本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。首先将蛭石与棉田土壤按照1：1比例混匀，121℃高压湿热灭菌1小时，隔天相同条件再灭菌1次。在500克土壤中接种立枯丝核菌菌丝段悬浮液(约10⁷个/毫升)10毫升，搅拌均匀后装填在直径20厘米的塑料花盆中，压实。棉花品种选用冀丰106，播种前应用实施例1制备的HMB27703液体制剂50倍水稀释液浸种半小时；以清水浸种半小时作为空白对照。浸种处理后每盆播种10粒种子，覆盖灭菌土壤，正常培养。出苗后20天调查每棵苗的发病级别，计算病情指数和防治效果。

表2枯草芽孢杆菌HMB27703对棉花立枯病防效试验结果

处理	病情指数	防效(％)
			HMB27703	16.67b	71.58
空白对照	58.65a	--

结果(见表2)当空白对照棉花立枯病病情指数为58.65时，枯草芽孢杆菌HMB27703浸种处理的病情指数为16.67，其防治棉花立枯病的效果可达71.58％。说明本发明枯草芽孢杆菌HMB27703及其微生物菌剂对棉花立枯病具有很好的防治效果。

实施例4枯草芽孢杆菌HMB27703对棉花立枯病的防治效果试验

(一)试验处理：

(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27703液体制剂；按照1：1比例添加碳酸钙，制备HMB27703粉剂。

(2)空白对照：清水

(二)试验方法：

本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。首先将蛭石与棉田土壤按照1：1比例混匀，121℃高压湿热灭菌1小时，隔天相同条件再灭菌1次。在500克土壤中接种立枯丝核菌菌丝段悬浮液(约10⁷个/毫升)10毫升，搅拌均匀后装填在直径20厘米的塑料花盆中，压实。棉花品种选用冀丰106，播种前应用实施例1制备的按照1：1比例添加碳酸钙，制备HMB27703粉剂；按照药种比1：10拌种处理棉花种子，以未处理种子作为空白对照。处理后每盆播种10粒种子，覆盖灭菌土壤，正常培养。出苗后20天调查每棵苗的发病级别，计算病情指数和防治效果。

表3枯草芽孢杆菌HMB27703对棉花立枯病防效试验结果

处理	病情指数	防效(％)
			HMB27703	8.82b	86.87
空白对照	67.19a	--

结果(见表3)当空白对照棉花立枯病病情指数为32.69时，枯草芽孢杆菌HMB27703拌种处理的病情指数为5.26，其防治棉花立枯病的效果为83.90％。说明本发明枯草芽孢杆菌HMB27703及其微生物菌剂对棉花立枯病具有很好的防治效果。

实施例5枯草芽孢杆菌HMB27703对三种重要病害病原菌的抑制作用试验

(一)试验时间和地点：2015年5月在河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室内进行。

(二)试验方法：

(1)供试病害病原真菌来源：棉花黄萎菌WX-1分离自河北省邢台市威县棉花黄萎病病株，棉花枯萎菌FOV-1分离自河北省邯郸市曲周县棉花枯萎病病株，番茄灰霉菌BC-1分离自河北省保定市徐水县番茄灰霉病病果，经河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定分别为大丽轮枝菌(Verticilliumdahaliae)、尖孢镰刀菌棉花专化型(Fusariumoxyporiumf.sp.vasinfectum)和灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，致病力测定均表现为强致病力。

(2)平板测定试验：

首先将供试的病原真菌在PDA平板上活化，培养3-7天后在菌落边缘区域，用打孔器打孔制成菌片，将供试病原真菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例1步骤(1)活化的枯草芽孢杆菌HMB27703点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照(不点接HMB27703菌株的供试病原真菌的生长情况)。25℃恒温培养3-7天，逐日观察HMB27703菌株和供试病原真菌的生长情况，待对照病原菌长至培养皿边缘时，观察并记录对照病原菌生长的半径，抑菌带宽度。用“+++”表示HMB27703菌株抑菌作用很强，抑菌带宽度大于9.0mm；用“++”表示HMB27703菌株抑菌作用为中等强度，抑菌带宽度为3.0-9.0mm；用“+”表示HMB27703菌株抑菌活性较弱，抑菌带宽度小于3.0mm。

表4HMB27703菌株对三种重要病原真菌的抑制作用

结果(见表4)枯草芽孢杆菌HMB27703对番茄灰霉菌具有很强的抑制作用，对枯萎菌也具有中等强度的抑制作用，对棉花黄萎菌的抑制作用较弱。说明枯草芽孢杆菌HMB27703具有防治番茄灰霉病和棉花枯萎病的生防潜力。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株HMB27703，己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11458。

2.利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB27703生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为枯草芽孢杆菌HMB27703菌体。

3.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于所述的微生物菌剂为液体制剂或粉剂。

4.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将低温保存的HMB27703菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃下培养10～16小时，得活化的菌株；

(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mLLB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm条件下培养10～16小时，得种子液；

(3)按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基中，在温度为25～35℃、摇床转速为150～220rpm条件下发酵培养40～50h，得发酵液；

(4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为HMB27703菌株的液体制剂。

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL；其步骤(2)中所述的LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。

6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl0.1～0.8％，MnSO₄·H₂O0.5～1.0％，其余为水；pH值为7.0。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB27703在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花枯萎病上的应用。

8.权利要求2所述的微生物菌剂在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花枯萎病上的应用。

9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB27703菌株的鉴定方法，其特征在于以待测菌株的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:3所示的核苷酸序列，即为HMB27703菌株。

10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB27703菌株的鉴定方法，其特征在于以待测菌株的基因组DNA为模板，以gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，即为HMB27703菌株。