CN100540656C - 一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌BAB-1(Bacillius subtilis BAB-1)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2099，还公开了利用BAB-1菌株制备的菌剂及其制备方法，本发明BAB-1菌株可用于番茄灰霉病的防治，具有高效、抑菌谱广、使用简单、成本低、无环境污染等特点。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用

技术领域

本发明属于农用微生物领域，具体地说涉及一种枯草芽孢杆菌，以及利用该枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂、制备方法和应用。

背景技术

番茄灰霉病是番茄的一种世界性的重要病害，其病原菌属于半知菌亚门灰葡萄孢属(Botrytis cinerea)。该病菌主要为害果实，对保护地番茄生产构成极大威胁(李保聚.中国番茄病虫害及其防治学研究进展.中国农业出版社，1998.31～35)。在我国20世纪80年代开始发生蔓延，目前各地均有发生，已经成为番茄设施栽培的限制性障碍。由于目前没有发现灰霉病的抗源，因此难以进行抗病育种；国外以栽培防治(调控温室的温、湿度)(Morgen WM.Crop Protection，1984，3：243-251。Morgen W M.Crop.Protection，1985，4：99-110)为主的策略在我国现有条件下也难以实施，因此我国主要依靠化学防治。使用化学防治容易使病菌产生抗药性，造成防效下降；此外还容易造成果实的农药污染。近年来通过大量筛选和利用抗灰霉病的有益生物及其代谢产物，生物防治日益成为控制番茄灰霉病的有效途径。

生物防治番茄灰霉病主要包括利用拮抗菌、利用植物源农药、诱抗剂研究和内生菌等方法(何美仙.中国蔬菜，2004(5)：29～31)。其中研究较多的是利用拮抗菌防治番茄灰霉病，包括真菌、细菌和放线菌的利用。童蕴慧等(中国生物防治，2003，19(3)：131～135)报道，用于防治番茄灰霉病的生防真菌有10余种，研究和应用较广的主要是木霉和酵母等一些类群，如木霉、绿色木霉、哈茨木霉、木素木霉、出芽梗短霉、浅白隐球酵母、胶粘红酵母、球毛壳、粘帚霉、链孢粘帚霉等。放线菌链霉菌科链霉菌属产生的武夷菌素、磷氮霉素、白肽霉素、变构霉素、变构菌素和鱼时霉素等抗生素对灰霉病均有较好的抑制作用(易齐.植保技术与推广.无公害蔬菜病虫防治技术，1998，18(3)：44～45.沈寅初.植保技术与推广，1997，17(6)：35～37)。用于防治番茄灰霉病的细菌有10多种，主要有芽孢杆菌(Elad YJ等.European Journal of PlantPathology，1994，100(5)：315～336)、枯草芽孢杆菌([张玉勋等.植物病理学报，2000，30(1)：91)、多粘芽杆菌、地衣芽孢杆菌(童蕴慧等.中国生物防治，2000，16(3)：123～126。童蕴慧等.江苏农业研究，2001，22(4)：25～28。童蕴慧等.扬州大学学报，2002，23(2)：67～70)、乳芽孢杆菌、短体芽孢杆菌(Swadling IR等.Biocontrol Science and Technology，1998，8(3)：439～448.)、嗜麦芽黄单孢菌、假单孢杆菌(Elad YJ等.European Journal of PlantPathology，1994，100(5)：315～336)、荧光假单孢菌、欧文氏菌(张玉勋等.植物病理学报，2000，30(1)：91.Swadling I R等.Biocontrol Science andTechnology，1998，8(3)：439～448)等。但国内报道的不多，张中鸽[等(生物防治通报，1994，10(2)：85～86)曾报道多粘芽孢杆菌对灰葡萄孢等多种病原真菌的抑制效果。张玉勋等(植物病理学报，2000，30(1)：91)报道了荧光假单孢菌5号、15号菌株和M9、M11菌株在大棚番茄上定殖及其对灰霉病的控制效果，发现定殖能力强的M9、5号菌株对灰霉病的防效接近80％，明显优于50％扑海因600倍液的防效(62％)。童蕴慧等(中国生物防治，2000，16(3)：123～126)采集扬州、淮阴两地16种常见植物的根部土壤、根和叶片样本182份，分离纯化后得到细菌632株，抑菌圈法测定对灰葡萄孢有拮抗性的58株，拮抗性稳定的为13株。其中拮抗性最强的Y2-11-1菌株为芽孢杆菌，抑菌圈直径达29.7mm。接种试验表明，Y2-11-1对番茄叶片和果实灰霉病的防效分别达68.7％和75.0％，优于50％速克灵2000倍液。

枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)是一种受到广泛关注的生防细菌。以其分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽孢、贮藏期长和使用方便等特点，成为一种理想的生防微生物，自1945年Johnson报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质后，各国研究者对它进行了广泛而深入的研究，并有许多成功应用，在生产实践中表现出明显的防病增产作用，还进一步证明了芽孢杆菌生防菌剂的稳定性，与化学农药的相容性和不同植物不同年防效的一致性方面明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌(Monica L E等.Pest.Management.Science，2001，57(8)：695～706)。国内外分别报道了具有生物防治作用的不同株系枯草芽孢杆菌的生物学特征、定殖条件、抗菌物质理化特性等相关研究及其在不同作物不同部位的定殖情况、潜在的诱导植物产生抗病性及促进幼苗生长等方面的研究。因芽孢杆菌能产生内生芽抱，有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，在剂型加工环境中存活、定殖与繁殖(Monica L E等.Pest.Management.Science，2001，57(8)：695～706)。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的枯草芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。

发明内容

本发明目的之一是针对番茄灰霉病抗病育种难以进行，以及化学农药防治所带来的成本高、果实污染和环境污染问题，提供一种可用于生物防治的具有高效、广谱杀菌活性的枯草芽孢杆菌菌株。

本发明第二个目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂及其制备方法。

本发明第三个目的提供了本发明一种枯草芽孢杆菌在防治植物病害及防治番茄灰霉病上的用途。

本发明通过以下技术方案实现：

一种枯草芽孢杆菌菌株BAB-1(Bacillius subtilis BAB-1)，己于2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2099。

利用上述枯草芽孢杆菌BAB-1生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌BAB-1菌体和它的胞外代谢产物。

上述微生物菌剂可以为液态制剂。

上述微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的BAB-1菌株接种LB平板培养基上，并在28～32℃下培养20～24小时；然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在28～32℃下培养20～24小时，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液；

(2)种子液的制备：按照0.05％-0.5％比例(体积百分比)向LB液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，在28～34℃下震荡培养12～16小时，得种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照1～10％比例(体积百分比)接入玉米粉豆饼份培养基中，再在28～34℃、摇床转速为170～210rpm的条件下培养22～25小时，得菌株SAB-1的液体制剂；

其中所述的蔗糖豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分比为：蔗糖2.5％～3.5％，豆饼粉1.5％～2.5％，NaCl 0.1％～0.2％，CaCO₃ 0.2％～0.3％，KH₂PO₄0.01％～0.03％和MgSO₄·7H₂O 0.02％～0.04％，其余为水。

上述制备方法中步骤(1)中所述的低温是指通常保存菌种所用温度，本领域技术人员根据常识可知。

上述制备方法中步骤(1)或(2)中所述的LB平板培养基、LB斜面培养基或LB液体培养基的组成成份及其制备方法都是本领域技术人员熟知的，可按照通常的方法制备。

上述制备方法中所述的蔗糖豆饼培养基的制备方法，按照重量百分比称取蔗糖、豆饼粉、NaCl、CaCO₃、KH₂PO₄和MgSO₄，然后将它们混合，再加水至所需体积即可。

上述制备方法中所述的培养温度优选为30～32℃，摇床转速优选为210rpm，培养时间优选为22小时。

上述微生物菌剂，其枯草芽孢杆菌BAB-1的活菌数大于5×10⁹cfu/g。

上述枯草芽孢杆菌菌株BAB-1在防治棉花立枯病菌、小麦纹枯病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜灰霉病菌、番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、玉米穗腐病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、玉米黄斑病菌或小麦全蚀病菌等植物病害上的应用。它对10种病原真菌的抑菌率在61.54％～96.30％之间，表现了较广的抑菌谱。

上述枯草芽孢杆菌菌株BAB-1在防治番茄灰霉病上的应用。

本发明菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释，然后将稀释后的液体菌剂于番茄灰霉病发病高峰前进行叶面、花蕾和果实表面喷雾，也可同时喷洒于番茄地的地表，即可达到控制番茄灰霉病的目的。

BAB-1菌株的筛选分离过程：

BAB-1菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从河北省南宫市职中农场的棉花黄萎病病圃土壤中分离得到的。2003年河北省农林科学院植物保护研究所从河北省南宫市职中农场的棉花黄萎病病圃田间五点采集土样，混匀后称取10g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液1mL加无菌水9mL，即成10mL10^-2倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍稀释液，各浓度取200μL微生物悬液涂于PDA、改良PDA、LB和KB培养基平板上，每个浓度3次重复，在28℃恒温分别培养1d、3d和5d，分别进行细菌，真菌和放线菌的分离和纯化。并以番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)为靶标菌，进行拮抗菌的筛选。结果从中筛选出一个对供试病原菌具有明显抑菌效果的菌株，定名为BAB-1。

BAB-1菌株的特征：

(1)形态特征

在LB培养基上培养菌体为杆状，培养8h后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。

(2)16S rDNA序列测定

用于扩增细菌16SrDNA的引物为：F27：(5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG3’)与R1492(5‘GGCTACCTTGTTACGACTT’3)。以BAB-1的基因组DNA为模板扩增16S rDNA，并进行测序，结果BAB-1的16S rDNA序列见序列表。将所得BAB-1的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，同时根据其16S rDNA序列用DNAMAN Version 4.0分析获得了其进化树(见图1)。同源性比较结果表明菌株BAB-1与Bacillus subtilis的16SrDNA同源性达到98％(见图2)说明BAB-1菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(3)生理生化特征

将BAB-1菌株与枯草芽孢杆菌标准菌株1504(中国菌种保藏管理委员会)在相同的实验条件下进行生理生化性状检测。结果(见表1)BAB-1菌株的生理生化特征与枯草芽孢杆菌标准菌株1504相同，说明BAB-1菌株属于一种枯草芽孢杆菌。

表1菌株BAB-1生理生化鉴定结果

注：a表示BAB-1在10％NaCI中也能生长。“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。

细菌常规鉴定手册(《一般细菌常用鉴定方法》等)显示枯草芽孢杆菌可运动，革兰氏阳性，芽孢椭圆形或柱状、中生或偏中接触酶试验阳性，V-P试验阳性，7％-10％氯化钠中生长，从葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，水解淀粉，利用柠檬酸盐作为碳源，还原硝酸盐成亚硝酸盐，解酪素，卵黄反应阴性，在葡萄糖和酪氨酸琼脂上不形成黑色素，不利用丙酸盐，不分解酪氨酸等特点。将以上BAB-1菌株的部分生理生化性状检测结果与枯草芽孢杆菌标准菌株相比较，根据《一般细菌常用鉴定方法》(中国科学院微生物细菌研究细菌分类组编，科学出版社，1978年)，《芽孢杆菌属》)(蔡妙英等译.农业出版社，1988年)和《微生物分类学》(张继忠.上海复旦大学出版社，1995)的检索表进行检索，确定菌株BAB-1生理生化性状与枯草芽孢杆菌相应性状吻合。同时16S rDNA序列及根据16S rDNA序列用DNAMAN Version 4.0分析获得的进化树结果(见图1)进一步确认生化鉴定结果，鉴定BAB-1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

附图说明

图1为根据16SrDNA序列用DNAMAN 5.2.2分析获得的进化树结果。

图2为枯草芽孢杆菌BAB-1菌株与枯草芽孢杆菌168菌株(Bacilliussubtilis isolate 168)的16S rDNA基因序列同源性比较结果。其中Bacillus subtilisisolate 168序列中“-”表示与BAB-1相应的碱基相同，“g、a、c、t”表示与BAB-1相应位点的碱基不同。

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1

BAB-1微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行：

(1)菌种活化：将保存于-40℃的菌株BAB-1在LB平板培养基上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基上扩繁(30℃)备用，所得作为接种液；

(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基，在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(1)一接种环上述活化好的BAB-1菌株，在摇床上进行振荡培养，转速190rpm，并在30℃下培养24h小时，所得作为种子液；

(3)制备蔗糖豆饼培养基：按照3.0％蔗糖，2％豆饼粉，0.1％NaCl，0.3％CaCO₃，0.02％KH₂PO₄和0.03％MgSO₄·7H₂O配制培养基，然后加水补齐100％，搅拌混合得蔗糖豆饼培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL。在121℃对蔗糖豆饼培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；

(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶蔗糖豆饼培养基中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃恒温、转速190rpm条件下进行发酵培养；

(5)17h以后，每隔30min从步骤(4)的三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率；芽孢率达到90％即可停止发酵培养；即得枯草芽孢杆菌BAB-1液体制剂。

实施例2

本试验在河北省农林科学院植物保护研究所的温室内进行，选用番茄灰霉病菌(由河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室提供)。在花盆内育苗，每盆1棵苗，选用叶龄一致，大小一致的叶片，先用无菌水冲洗叶表，无菌滤纸吸干水分后在实施例1所得的用水稀释后(悬浮液含菌体10⁸cfu/mL)的枯草芽孢杆菌BAB-1菌剂中蘸一下，使叶子表面充分着药，然后放于铺有双层灭菌滤纸的培养皿中，同时接入番茄灰霉菌菌盘(直径6mm)，保湿培养。以未用生防菌处理的叶片为空白对照。待空白对照充分发病后调查病级，并计算病情指数和防效。番茄灰霉病级别划分标准和防效计算方法参照《中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则》(一)：杀菌剂防治蔬菜灰霉病(GB/T17980.28-2000)。离体叶片生测结果(见表2)表明，枯草芽孢杆菌BAB-1对番茄灰霉病有极好的防治效果，防效可达100％。

表2枯草芽孢杆菌BAB-1对番茄灰霉病的作用效果

实施例3

本试验在河北省保定市徐水县农户刘玉胡的番茄大棚内进行，每小区两行，四次重复，随机区组排列。实验时整个棚内果上灰霉病轻度发生，施药前摘除病果。采用背负式手动喷雾器接种实施例1所制备的枯草芽孢杆菌BAB-1菌剂(用水进行稀释，含菌体10⁸cfu/mL)；另设对照药剂(50％利霉康可湿性粉剂，由河北省保定市科绿丰生化科技有限公司提供，600倍水稀释液喷雾处理)和空白对照(清水喷雾)。待空白对照充分发病后调查各个处理小区的单株病果数和健果数，并计算发病率和防效。试验结果(见表3)表明枯草芽孢杆菌BAB-1的菌剂处理后番茄灰霉病的病情指数显著低于空白对照和药剂对照，其防效达到74.12％，说明枯草芽孢杆菌菌株BAB-1对番茄灰霉病表现了较好的防治效果。

表3在大棚内枯草芽孢杆菌BAB-1对番茄灰霉病的作用效果

处理	发病率(％)	防效(％)
			BAB-1	0.89c	74.12
药剂对照	2.65b	23.32
			空白对照	3.45a	/

实施例4

本试验在河北省保定市徐水县农户刘玉胡的番茄大棚内进行，每小区两行，四次重复，随机区组排列。实验时整个棚内果上灰霉病重度发生，施药前摘除病果。处理分为菌体悬浮液和去菌体胞外代谢产物。将实施例1所得的枯草芽孢杆菌BAB-1菌剂稀释(含菌体10⁸cfu/mL)，然后将BAB-1菌剂稀释液分成两份，一份用于直接喷雾(处理为培养液，含菌体与代谢产物)；一份在5000转/分条件下离心20分钟，上清液是枯草芽孢杆菌BAB-1的胞外代谢产物；沉淀用离心前等量的0.9％的生理盐水悬浮，即为菌体悬浮液(含菌体10⁸cfu/mL)；另设对照药剂(50％利霉康可湿性粉剂，由河北省保定市科绿丰生化科技有限公司提供，600倍水稀释液喷雾处理)和空白对照(清水喷雾)。结果(见表4)表明，枯草芽孢杆菌BAB-1的培养液(含菌体与代谢产物)对番茄灰霉病的防治效果显著高于胞外代谢产物和菌体悬浮液处理的防治效果，并且这三者都显著高于空白对照，说明枯草芽孢杆菌BAB-1胞外代谢产物和活菌体对番茄灰霉病都有防治作用。因此枯草芽孢杆菌BAB-1防治番茄灰霉病的有效活性成分包括枯草芽孢杆菌BAB-1的菌体及其代谢产物。

表4枯草芽孢杆菌BAB-1菌体及胞外代谢物对番茄灰霉病的防治效果

实施例5、

采用对峙培养法检测枯草芽孢杆菌BAB-1菌株对10种植物病原真菌的抑制作用，包括：棉花立枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporium f.sp.vasinfectum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、黄瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cucumerinum)、黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、玉米穗腐病菌(F.graminearum)、玉米黄斑病菌(Curvularia lunata)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、小麦纹枯病菌(R.cerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis)、小麦根腐病菌(Alternaria triticna)的抑菌谱。这10种病原真菌和枯草芽孢杆菌BAB-1菌株均由河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室保存。具体方法如下：

枯草芽孢杆菌BAB-1抑制病原真菌效果检测采用平板对峙培养法，枯草芽孢杆菌BAB-1斜面28℃下活化48h，待测。取本试验室保存的10种病原真菌，在PDA培养基上活化5d，然后在菌落边缘用直径5mm的打孔器打取菌龄一致的菌片，菌丝朝下转接到另一PDA平板中央，在菌片三周距菌片2cm处呈“品”字形接种待测细菌，以不接细菌为对照，每处理4次重复，放于25℃恒温培养5d，测量处理菌落半径和细菌接种点至灰霉病菌菌落边缘的间距(抑菌带)，确定抑菌程度，计算抑菌率。

枯草芽孢杆菌BAB-1对供试病原真菌抑制作用结果(见表5)：枯草芽孢杆菌BAB-1对供试的10种病原真菌的抑菌率在61.54％～96.30％之间，对小麦全蚀病菌的抑菌率达到了96.30％，对黄瓜枯萎病菌的抑菌率最低，为61.54％，说明本发明枯草芽孢杆菌菌株BAB-1具有较广的抑菌谱。

表5枯草芽孢杆菌菌株BAB-1对植物病原真菌的抑制作用

病原菌	对照(mm)	处理菌落生长量(mm)	抑菌带(mm)	抑菌率(％)
					棉花立枯病菌小麦纹枯病菌番茄和黄瓜灰霉病菌番茄早疫病菌黄瓜枯萎病菌玉米穗腐病菌小麦赤霉病菌棉花枯萎病菌玉米黄斑病菌小麦全蚀病菌	42.0037.7535.0037.0039.0041.0041.0040.0040.0036.00	14.757.506.0011.5015.008.6715.5015.259.001.33	1.752.004.335.500.004.332.000.007.333.33	64.8880.1382.8668.9261.5478.8662.2061.8877.5096.30

序列表

<110>河北省农林科学院植物保护研究所

<120>一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1118

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>1

ccagactgtc accttcggcg gctggctcct aaaaggttac ctcaccgact tcgggtgtta 60

caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca 120

tgctgatccg cgattactag cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc 180

gaactgagaa cagatttgtg ggattggctt aacctcgcgg tttcgctgcc ctttgttctg 240

tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc 300

accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact 360

aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg 420

acaaccatgc accacctgtc actctgcccc cgaaggggac gtcctatctc taggattgtc 480

agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca 540

ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcagt cttgcgaccg tactccccag 600

gcggagtgct taatgcgtta gctgcagcac taaggggcgg aaacccccta acacttagca 660

ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg 720

ctcctcagcg tcagttacag accagagagt cgccttcgcc actggtgttc ctccacatct 780

ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc cactctcctc ttctgcactc aagttcccca 840

gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac atcagactta agaaaccgcc 900

tgcgagccct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc 960

tgctggcacg tagttagcgt ggctttctgg ttaggtacgg tcaaggtacc gccctattcg 1020

aacggtactt gttcttccct aacacagagc tttacgatcg aaaccttcat cactcacgcg 1080

gcgtgctcgt cgacttcgtc attgccgaag atccctac                         1118

Claims (8)

1、一种枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)BAB-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2099。

2、利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BAB-1生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为枯草芽孢杆菌BAB-1菌体。

3、按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于所述的菌剂为液态制剂。

4、权利要求2或3所述的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将-40℃保存的BAB-1菌株接种LB平板培养基上，并在28～32℃下培养20～24小时，然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在28～32℃下培养20～24小时，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液；

(2)种子液的制备：按照体积百分比为0.05～0.5％比例向LB液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，在28～34℃下震荡培养12～16小时，得种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照体积百分比为1～10％比例接入蔗糖豆饼粉培养基中，再在28～34℃、摇床转速为170～210rpm的条件下培养22～25小时，即得菌株BAB-1的液体制剂；

其中所述的蔗糖豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分比为：蔗糖2.5％～3.5％，豆饼粉1.5％～2.5％，NaCl 0.1％～0.2％，CaCO₃ 0.2％～0.3％，KH₂PO₄0.01％～0.03％和MgSO₄·7H₂O 0.02％～0.04％，其余为水。

5、按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的培养温度为30～32℃。

6、按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的摇床转速为210rpm。

7、按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的培养时间为22小时。

8、权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BAB-1在防治番茄灰霉病上的应用。

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