CN1924005A - 一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌Corn－1(Bacillius subtilis Corn－1)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.1778，本发明Corn－1菌株可用于玉米叶斑病的防治，具有高效、抑菌谱广、使用简单、成本低、无环境污染等特点。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌，还涉及利用该枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂、制备方法和应用。

背景技术

玉米叶斑病包括玉米弯孢叶斑病、玉米大斑病与玉米小斑病。

玉米弯孢叶斑病又称拟眼斑病、黑霉病，是由新月弯孢菌(Curvularia lunata)引起的一种危险性较大的玉米病害。该病主要危害叶片和叶鞘，重病地叶片上病斑密布连片，导致叶片枯焦。20世纪80年代中期，我国河南省新乡发现该病。病害发展蔓延很快，已在辽宁、北京、河北、河南、山东、吉林、天津等北方玉米产区普遍发生，并已成为我国北方玉米上继大斑病、小斑病、丝黑穗病之后的又一重要病害，对玉米生产构成了极大的威胁。如1994年河北省隆化、平泉在黄417上和以黄早四为亲本的制种田严重发生此病，一般减产20％，严重的达60％。1996年河北省发生面积为20万hm以上，减产20％～60％不等。由于玉米弯孢菌叶斑病是突发性病害，发生蔓延迅速，严重时叶部病斑密集成片，重病地块病株率及病叶率高达100％，已成为我国玉米产区的重要病害之一。

玉米大斑病(Exserohilum turcicum)是玉米生产上的重要病害之一，广泛发生于世界各地，每年该病可造成严重的产量损失。该病自70年代以来，在东北、华北北部和南方冷凉山区曾几度流行，一般年份减产20％左右，严重流行年份减产可达50％以上，有时还会加重玉米根腐、茎腐等病害的发生和危害程度，严重影响玉米的产量和品质。近年来，由于感病品种的大面积种植及新小种的出现，病害又呈回升趋势。

玉米小斑病(Bipolaria maydis)又称玉米斑点病，是我国温暖潮湿玉米产区的重要叶部病害。20世纪60年代，由于大面积推广感病杂交种，玉米小斑病的为害日趋严重。70年代后，随着抗病品种的推广，玉米小斑病的发生和危害基本得到了控制，但由于抗病性品种的大面积单一化种植和全球的气候变暖，玉米小斑病在我国仍时有发生，并有逐渐加重趋势，损失严重。

目前，对这三种叶斑病的防治方法主要有培育抗病品种和化学药剂防治。但是由于单一抗病品种的大面积推广，常给生产上带来某种叶斑病的年份流行，损失严重；而且玉米叶斑病病原菌生理小种多变，常常导致抗病品种抗性的丧失。

化学防治在世界农业发展史上占有重要的地位。几个世纪以来，化学农药在植物病虫、草、鼠害的防治中发挥着积极的作用，为农业的稳产、增产、挽回损失和提高品质做出了重要贡献。但同时也因过量施用和滥用农药导致地力衰退和环境污染，影响非靶标生物及导致有害生物的抗药性产生和迅速发展等严重问题。尤其近年来因为农产品中农药残留超标，造成人畜中毒事件不断发生，严重威胁着人民的生活质量，也限制了我国农产品的外贸出口。化学杀菌剂的潜在污染已成为农业安全生产中首要的关键问题。随着社会文明的发展，农业可持续发展问题使人类对资源与环境的认识有了新的飞跃，对农药提出了高效、低毒、环境友好型的要求。世界各国也在采取实际步骤减少化学合成农药的使用，如美国EPA在20世纪90年就宣布撤消91种化学农药的登记，荷兰、丹麦在1990年就制定了减少一半农药使用量的五年和十年计划，欧盟也制定了类似的计划。我国也已撤消十几种化学农药的登记。为了解决农产品提高产量和保证质量之间的矛盾，达到综合防治蔬菜重大病虫害、减少化学农药使用量的目的，发展生物防治技术越来越受到各国政府、科技工作者和民众的关注。目前生产上用于防治玉米叶斑病的化学药剂主要是常用的杀菌剂，弯孢霉叶斑病用50％退菌特、80％炭疽福美、50％福美双等600-800倍喷雾；大小斑病可用40％克瘟散、50％多菌灵、75％代森锰锌等药剂500-800倍进行叶面喷雾防治，但效果不是很理想，并且化学农药易给人类和环境带来很多负面影响，人们正在寻找有效的、环保的防治措施。

生物菌剂以其低毒、环境兼容性好、具有在作物幼苗根际建群的能力，持效期长，有害生物不易对其产生抗药性等特点得到广泛的关注和重视，目前国际上先进的农化公司大多积极参与生物菌剂的研究和市场化，特别是有益细菌在土传、种传病害的防治中已取得了一定进展，并有系列产品得到成功的应用，取得了显著的经济和生态效益。生物防治作为综合防治的一项重要措施，在植物病虫害综合治理中发挥着愈来愈重要的作用。

枯草芽孢杆菌属(Bacillius subtilis)是目前比较受到广泛关注的一类生防细菌。以其分布广，易分离培养，能产生抗逆性较强的芽孢，贮藏期长，使用方便等特点，成为一种理想的生防微生物，自1945年Johnson报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质后，半个多世纪以来各国的研究工作者对它可望成为一种生物控制因素而寄予极大关注，并在多种作物上进行了广泛的控制病害能试验，有许多成功应用，在生产实践中表现出明显的防病增产作用，也进一步证明了芽孢杆菌生防菌剂在产品中的稳定性，与化学农药的相容性和不同植物不同年防效的一致性方面明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌。国内外学者先后分别报道了具有生物控制作用的各个不同株系的枯草芽孢杆的生物学特征、定殖条件、抗菌物质理化特性等相关研究及其在不同作物不同部位的定殖情况、潜在的诱导植物产生抗病性及促进幼苗生长等方面的研究。已有研究表明，因芽孢杆菌能产生内生芽抱，有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，剂型加工在环境中存活，定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的枯草芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。经过检索，还没有发现能用于防治玉米叶斑病的枯草芽孢杆菌。

发明内容

本发明目的之一是针对抗病品种单一容易丧失抗病性，以及化学农药防治所带来的成本高和污染环境的问题，提供一种可用于生物防治的具有高效、广谱杀菌活性的枯草芽孢杆菌菌株。

本发明第二个目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂及其制备方法。

本发明第三个目的是提供了本发明枯草芽孢杆菌在防治玉米叶斑病上的用途。

本发明通过以下技术方案实现：

一种枯草芽孢杆菌菌株Corn-1(Bacillius subtilis Corn-1)，已于2006年8月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1778。

利用上述枯草芽孢杆菌Corn-1生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌Corn-1菌体和它的胞外代谢产物。

上述微生物菌剂可以为液态制剂。

上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：菌种活化，种子液制备和发酵培养。

上述微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的Corn-1菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上扩繁备用；

(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基，高压湿热灭菌后，接入步骤(1)活化的菌株Corn-1，在26～34℃下震荡培养22～25小时，培养所得菌株Corn-1作为种子液；

(3)发酵培养：向发酵罐加入混合好的蔗糖豆饼粉培养基和水，初始pH值用NaOH调为6.7～7.2之间，灭菌后待温度降到30℃以下采用负压方法接入步骤(2)的种子液，在温度为26～34℃、通气量为1∶0.3～1.0、搅拌速度为150～230rpm条件下发酵培养22～36h；

(4)检测发酵液中菌体数量，待发酵液中芽孢率达到90％即可停止发酵培养；所得即为Corn-1菌株的液体制剂。

上述制备方法中所述的培养温度优选为30～32℃，通气量优选为0～5h通气比1∶0.3～0.5；5-10h 9.5～11.5m³/h(通气比1∶0.5)；10h后20～22m³/h(通气比1∶1)，搅拌速度优选为170～220rpm，培养时问优选为22～25h。

上述制备方法所述的蔗糖豆饼粉培养基可加入植物油或者有机油作为消沫剂。

上述制备方法中所述植物油的重量百分比可为1～2％；所述有机硅油的重量百分比可为0.4～1.0％。

上述制备方法中所述的蔗糖豆饼粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：蔗糖2.5～3.5％，豆饼粉1.5～2.5％，NaCl 0.1～0.3％，CaCO₃ 0.1～0.3％，KH₂PO₄0.01～0.04％和MgSO₄·7H₂O 0.02～0.04％，其余为水。

上述蔗糖豆饼培养基的制备方法，按照重量百分比称取蔗糖、豆饼粉、NaCl、CaCO₃、KH₂PO₄和MgSO₄，然后将它们混合后倒入发酵罐中，再加水至所需体积即可。

上述制备方法中所述的通气量为每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液的体积比。

上述微生物菌剂，其枯草芽孢杆菌Corn-1的活菌数大于5×10⁹cfu/g。

上述微生物菌剂在防治植物病害上的应用。

上述微生物菌剂在防治玉米叶斑病上的应用，所述的玉米叶斑病包括玉米弯孢叶斑病、玉米大斑病与玉米小斑病。

枯草芽孢杆菌菌株Corn-1对棉花立枯病菌、棉花枯萎病菌、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌、玉米纹枯病菌、玉米穗腐病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和黄瓜枯萎病菌等11种病原真菌的抑菌率在62.50％～94.22％之间，表现出了较广的抑菌谱。

枯草芽孢杆菌菌株Corn-1对7种主要作物(包括单子叶和双子叶植物)玉米、小麦、棉花、大豆、黄瓜、西红柿、茄子没有伤害现象，表现对作物安全。

本发明菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释，然后将稀释后的液体菌剂于玉米叶斑病发病高峰前进行叶面喷雾，也可同时喷洒于玉米田的地表，即可达到控制防治玉米叶斑病的目的。

Corn-1菌株的筛选分离过程

Corn-1菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从其棉花黄萎病病圃土壤中分离得到的。2004年河北省农林科学院植物保护研究所从其棉花黄萎病病圃田间五点采集土样，混匀后称取10g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液1mL加无菌水9mL，即成10mL10^-2倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍稀释液，各浓度取200μL微生物悬液涂于PDA、改良PDA、LB和KB培养基平板上，每个浓度3次重复，在28℃恒温分别培养1d、3d和5d，分别进行细菌，真菌和放线菌的分离和纯化。并分别以玉米弯孢叶斑病病原菌(Curvularia lunata)、玉米大斑病病原菌(Exserohilum turcicum)和玉米小斑病病原菌(Bipolaria maydis)为靶标菌，进行拮抗菌的筛选。结果从中筛选出一个对各个供试菌具有明显抑菌效果的菌株，定名为Corn-1。

Corn-1菌株的特征：

(1)形态特征

在LB培养基上培养菌体为杆状，培养8h后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。

(2)16SrDNA序列测定

用于扩增细菌16SrDNA的引物为：530F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)与1494R(5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’)。以Corn-1的基因组DNA为模板扩增16S rDNA，并进行测序，结果Corn-1的16SrDNA序列见序列表。将所得Corn-1的16SrDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株Corn-1与Bacillus subtilis的16SrDNA同源性达到98％(图2中，Bacillus subtilis isolate BS-2序列中“-”表示与Corn-1相应的碱基相同，“g、a、c、t”表示与Corn-1相应位点的碱基不同)，说明Corn-1菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

(3)生理生化特征

将Corn-1菌株与枯草芽孢杆菌标准菌株1504(中国菌种保藏管理委员会)在相同的实验条件下进行生理生化性状检测(结果见表1)。从表1可以看出，Corn-1菌株的生理生化特征与枯草芽孢杆菌标准菌株1504相同，说明Corn-1菌株属于一种枯草芽孢杆菌。

表1菌株Corn-1鉴定结果

检测项目	Corn-1	标准菌株	检测项目		Corn-1	标准菌株
							革兰氏染色	+	+	产酸	葡萄糖	+	+
淀粉水解	+	+	木糖	+	+
						芽孢染色	+	+	阿拉伯糖		+	+
伴孢晶体	-	-	甘露醇	+	+
						运动性	+	+	产黑色素		1％葡萄糖	-	-
接触酶	+	+	1％酪氨酸	-	-
						厌氧生长	-	-		利用	柠檬酸盐	+	+
V-P测定	+	+	丙酸盐	-	-
						卵黄反应	-	-	从NO3到NO2		+	+
V-P培养物终pH：＜6	d	d	产生吲哚		-								-
						＞7	+	+	分解	酪素	+	+
生长pH6.8营养肉汤	+	+	酪氨素	-	-
						pH5.7营养肉汤	+	+		明胶水解		+	+
生长NaCl：7％a	+	+	产气	葡萄糖	-				-
						50℃生长	+	+

注：a表示Corn-1在10％NaCl中也能生长。“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。

细菌常规鉴定手册(《一般细菌常用鉴定方法》等)显示枯草芽孢杆菌可运动，革兰氏阳性，芽孢椭圆形或柱状、中生或偏中接触酶试验阳性，V-P试验阳性，7％-10％氯化钠中生长，从葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，水解淀粉，利用柠檬酸盐作为碳源，还原硝酸盐成亚硝酸盐，解酪素，卵黄反应阴性，在葡萄糖和酪氨酸琼脂上不形成黑色素，不利用丙酸盐，不分解酪氨酸等特点。将以上Corn-1菌株的部分生理生化性状检测结果与枯草芽孢杆菌标准菌株相比较，根据《一般细菌常用鉴定方法》(中国科学院微生物细菌研究细菌分类组编，科学出版社，1978年)，《芽孢杆菌属》)(蔡妙英，战立克等译，业出版社，1988年)和《微生物分类学》(张继忠，上海复旦大学出版社，1995)的检索表进行检索，确定菌株Corn-1生理生化性状与枯草芽孢杆菌相应性状吻合。同时16SrDNA序列及根据16SrDNA序列用DNAMAN Version 4.0分析获得的进化树结(图1)进一步确认生化鉴定结果，鉴定Corn-1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明所具有的优点和有益效果：(1)本发明提供了一种能广谱高效防治玉米叶斑病等植物病害的枯草芽孢杆菌菌株，为防治玉米叶斑病等植物病害提供了一种生物防治的新途径；(2)本发明抑菌效果显著，对病原菌的抑菌效果达到60.14％～94.22％；(3)本发明抑菌谱广，它不仅对玉米叶斑病，而且对棉花立枯病菌、棉花枯萎病菌、小麦纹枯病菌等许多病原真菌都有较好的抑制作用；(4)本发明制备方法简单、成本低、易于推广应用；(5)本发明无污染，无公害，低残留，对环境友好，对提高农产品质量和产量具有重要作用，同时能提高我国农产品的国际竟争力。

附图说明

图1为根据16SrDNA序列用DNAMAN 5.2.2分析获得的进化树结果。

图2为枯草芽孢杆菌Corn-1菌株与枯草芽孢杆菌BS-2菌株(Bacillius subtilisisolate BS-2)的16SrDNA基因序列同源性比较结果。

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1

Corn-1微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行：

(1)菌种活化：将保存于-40℃的菌株Corn-1在LB平板培养基上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基上扩繁备用；

(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基，在500mL三角瓶中装入LB培养液200mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(1)一接种环上述活化好的Corn-1菌株，在摇床上进行振荡培养，转速170rpm，并在30℃下培养22h小时，所得可作为种子液；

(3)蔗糖豆饼培养基的制备：在500L发酵罐中，加入蔗糖10.5kg，豆饼粉7kg，NaCl 0.35kg，CaCO₃ 0.35kg，KH₂PO₄ 0.07kg和MgSO₄·7H₂O 0.105kg，然后加水350L，搅拌混合得蔗糖豆饼培养基；在121℃对蔗糖豆饼培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；

(4)发酵培养：向步骤(3)所得蔗糖豆饼培养基中接种步骤(2)所得种子液1.75L；在30℃恒温培养17小时，17小时以后变成35℃恒温培养，同时辅以转速180rpm，罐压0.05-0.06Mpa，通气条件分别为：0-5h 6.3m³/h；5-10h 10.5m³/h；10h后21m³/h进行发酵培养；

(5)17h以后，每隔30分钟从步骤(4)的发酵罐中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率；芽孢率达到90％即可停止发酵培养；发酵培养22～25h得枯草芽孢杆菌Corn-1液体制剂。

实施例2

本试验在河北省农林科学院植物保护研究所的温室内进行，分别选用玉米弯孢病病原菌辽9605、玉米大斑病病原菌1号小种和玉米小斑病病原菌2010-1为致病病原菌，三种病原菌均为黄淮海地区玉米叶斑病优势小种，由河北省农林科学院植物保护研究所综合防治实验室提供；玉米小斑病和弯孢叶斑病选用感病品种9831，玉米大斑病实验选用感病品种8112，均由由河北省农林科学院植物保护研究所综合防治实验室提供。在花盆内育苗，每盆10棵苗，每处理四次重复。将实施例1所得的枯草芽孢杆菌Corn-1菌剂用水进行稀释(含菌体10⁸cfu/mL)，用喉头喷雾器均匀喷洒于玉米苗叶面，24h后分别接种用高粱粒培养基繁殖的病原菌(低倍镜下大斑菌10个孢子/视野，小斑菌20-30个/视野，弯孢菌100-200个/视野)，保湿培养(大斑菌20℃，小斑菌和弯孢菌30℃左右)。待空白对照充分发病后调查病级，并计算病情指数和防效。玉米叶斑病病株级别划分标准和防效计算方法参照《中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则》(二)第107部分：杀菌剂防治玉米大小斑病(结果见表2)。

结果表明，在温室内枯草芽孢杆菌Corn-1对三种叶斑病均有较好的防治效果，对玉米弯孢叶斑病、大斑病与小斑病的防效分别为100.00％、83.30％和100.00％。

表2在温室内枯草芽孢杆菌Corn-1对玉米叶斑病的防治作用

玉米弯孢叶斑病			玉米大斑病			玉米小斑病
									处理	病情指数	防效(％)	处理	病情指数	防效(％)	处理	病情指数	防效(％)
CKCorn-1	43.25a0.00b	/100.00	CKCorn-1	67.00a11.19b	0.0083.30	CKCorn-1	51.44a0.00b	/100.00

实施例3

本试验在河北省农林科学院植物保护研究所的试验田里进行，每小区两行，四次重复，随机区组排列。采用背负式手动喷雾器接种病原菌和实施例1所制备的枯草芽孢杆菌Corn-1菌剂(用水进行稀释，含菌体10⁸cfu/mL)；另设对照药剂(45％代森铵SL，市购，河北双吉华工有限公司生产，1500倍水稀释液喷雾处理)和空白对照(清水喷雾)；处理方法同实施例2，接种病原菌后浇足水。待空白对照充分发病后调查病级(同实施例2)，并计算病情指数和防效。试验结果表明(见表3)，枯草芽孢杆菌Corn-1的菌剂处理后三种玉米叶斑病的病情指数显著低于空白对照，其防效达到43.56％～52.04％。枯草芽孢杆菌菌株Corn-1对三种叶斑病均表现了较好的防治效果，防效分别达到了52.04％(玉米弯孢叶斑病，显著高于药剂对照)、43.56％(玉米大斑病菌，相当于药剂对照)和48.16％(玉米小斑病菌，显著高于药剂对照)。

表3在田间枯草芽孢杆菌Corn-1对玉米叶斑病的作用效果

处理	玉米弯孢叶斑病		玉米大斑病菌		玉米小斑病菌
							病情指数	防治效果％	病情指数	防治效果％	病情指数	防治效果％
	Corn-1药剂对照空白对照	32.37c47.98b60.76a	52.0421.03/	20.82b26.31b36.89a	43.5628.69/	30.63c41.99b59.09a							48.1628.94/

实施例4

本试验在河北省农林科学院植物保护研究所的温室内进行。处理分为菌体悬浮液和去菌体胞外代谢产物。将实施例1所得的枯草芽孢杆菌Corn-1菌剂稀释(含菌体10⁸cfu/mL)，然后将Corn-1菌剂稀释液分成两份，一份用于直接喷雾(处理为培养液，含菌体与代谢产物)；一份在5000转/分条件下离心20分钟，上清液是枯草芽孢杆菌Corn-1的胞外代谢产物；沉淀用离心前等量的0.9％的生理盐水悬浮，即为菌体悬浮液(含菌体10⁸cfu/mL)；用水作为空白对照。结果(见表4)表明，枯草芽孢杆菌Corn-1的培养液(含菌体与代谢产物)、胞外代谢产物、菌体悬浮液处理的病情指数差异不显著，但是都显著低于空白对照，说明枯草芽孢杆菌Corn-1胞外代谢产物和活菌体对玉米叶斑病都有防治作用。因此枯草芽孢杆菌Corn-1防治玉米弯孢叶斑病的有效活性成分包括枯草芽孢杆菌Corn-1的菌体及其代谢产物。

表4枯草芽孢杆菌Corn-1菌体及孢外代谢物对玉米弯孢叶斑病的防治效果

处理	病情指数	防效(％)
			培养液(含菌体与代谢产物)胞外代谢产物(无菌体)菌体悬浮液(无代谢产物)空白对照	11.16bc16.05b13.73bc35.36a	66.1651.2359.54/

实施例5、

采用对峙培养法检测枯草芽孢杆菌Corn-1菌株对11种植物病原真菌的抑制作用，包括：玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花立枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病菌(F.oxysporium f.sp.vasinfectum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、玉米穗腐病菌(F.graminearum)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、小麦纹枯病菌(R.cerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、小麦根腐病菌(Alternaria triticna)的抑菌谱。这11种病原真菌和枯草芽孢杆菌Corn-1菌株均由河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室保存。具体方法如下：

枯草芽孢杆菌Corn-1抑制病原真菌效果检测采用平板对峙培养法，枯草芽孢杆菌Corn-1斜面28℃下活化48h，待测。取本试验室保存的11种病原真菌，在PDA培养基上活化5d，然后在菌落边缘用直径5mm的打孔器打取菌龄一致的菌片，菌丝朝下转接到另一PDA平板中央，在菌片三周距菌片2cm处呈“品”字形接种待测细菌，以不接细菌为对照，每处理4次重复，放于25℃恒温培养5d，测量处理菌落半径和细菌接种点至灰霉病菌菌落边缘的间距(抑菌带)，确定抑菌程度，计算抑菌率。

枯草芽孢杆菌Corn-1对供试病原真菌抑制作用结果(如表5所示)：枯草芽孢杆菌Corn-1对供试的11种病原真菌的抑菌率在60.14％～94.22％之间，对小麦全蚀病菌的抑菌率达到了94.22％，对小麦根腐病菌的抑菌率最低，为60.14％，说明本发明枯草芽孢杆菌菌株Corn-1具有较广的抑菌谱。

表5枯草芽孢杆菌菌株Corn-1对植物病原真菌的抑制作用

病原菌	对照(mm)	菌株Corn-1
					病原菌落半径(mm)	抑菌带(mm)	抑菌率(％)
		棉花立枯病菌Rhizoctonia solani小麦纹枯病菌R.cerealis番茄灰霉病菌Botrytis cinerea番茄早疫病菌Alternaria solani黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum玉米穗腐病菌F.graminearum小麦赤霉病菌F.graminearum棉花枯萎病菌F.oxysporium f.sp.vasinfectum玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis小麦根腐病菌Alternaria triticna	42.0037.7535.0037.0039.0041.0041.0040.0036.0034.1518.33	10.506.756.339.758.756.509.509.1313.502.007.33				6.505.507.007.755.007.7518.005.755.1310.006.33	75.0082.1381.9073.6577.5684.1576.8377.1962.5094.2260.14

实施例6

室内种子发芽安全性检测：将实施例1所得的枯草芽孢杆菌Corn-1菌液稀释5倍、10倍和原液分别作为三个处理，设清水为空白对照，对小麦、玉米、棉花、黄瓜、茄子、大豆、马铃薯7种主要作物种子(种薯)进行浸种处理30分钟，然后播于花盆中，每处理50粒种子或种薯，重复3次。观测各处理对种子发芽的安全性。结果表明(表6)，菌悬液种处理后的小麦、玉米、棉花、黄瓜、茄子、大豆、马铃薯等7种作物种子发芽势和发芽率与对照无显著差异。

室内叶面喷雾进行检测：将实施例1所得的枯草芽孢杆菌Corn-1菌液稀释5倍、10倍和原液分别作为三个处理，设清水为空白对照，每处理20棵苗，重复3次；在苗期采用叶面喷雾接种法进行接种，结果表明(表6)，与对照相比，枯草芽孢杆菌Corn-1对7种作物的生长状况均表现无致病和无伤害作用，对作物使用安全。

表6枯草芽孢杆菌Corn-1对7种大田作物的出苗及生长发育的影响

作物	处理	出苗率(％)	不良反应苗数	发病苗数	作物	处理	出苗率(％)	不良反应苗数	发病苗数
										小麦	原液5倍10倍CK	90.3a91.2a90.3a90.3a	000	000	茄子	原液5倍10倍CK	96.8a96.8a96.8a96.8a	000	000
玉米	原液5倍10倍CK	96.8a96.8a96.8a96.8a	000	000	大豆	原液5倍10倍CK	98.7a98.7a100a98.7a	000	000
										棉花	原液5倍10倍CK	98.1a98.1a98.1a97.5a	000	000	马铃薯	原液5倍10倍CK	91.2a90.6a90.6a91.2a	000	000
黄瓜	原液5倍10倍CK	96.8a96.8a96.8a96.8a	000	000

                           序列表

<110>河北省农林科学院植物保护研究所

<120>一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>947

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>1

tatctgtcca ccttcggcgg ctggctcata aaggttacct caccgacttc gggtgttaca    60

acttctcggg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg    120

ctgatccgcg attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcaaac tgcgatccga    180

actgaaaaca aatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc    240

cattgtagca cgtgtgtacc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac    300

cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct taaagtgccc aactgaatgc tggcaactaa    360

aatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacaac    420

aaccatgcac cacctgtcac tgggcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcaa    480

aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcaa attaaaccac atgctccacc    540

gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc    600

ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact    660

catcgtttac ggcgtgaact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct    720

cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct    780

acgcatttca ccgctacacg tgaaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt    840

ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc    900

gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgctgccacc tacgtat                  947

Claims (10)

1、一种枯草芽孢杆菌菌株Corn-1(Bacillius subtilis Corn-1)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.1778。

2、利用权利要求1所述菌株Corn-1生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为枯草芽孢杆菌Corn-1菌体和它的胞外代谢产物。

3、按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于可按如下方法制备：在蔗糖豆饼粉培养基中发酵枯草芽孢杆菌Corn-1，然后将得到的发酵液与基质混合，即得到微生物菌剂。

4、权利要求2或者3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：菌种活化，种子液制备和发酵培养。

5、按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的Corn-1菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上扩繁备用；

(2)种子液制备：按常规方法制作LB液体培养基，高压湿热灭菌后，接入步骤(1)活化的Corn-1菌株，在26～34℃下震荡培养22～25小时，培养后所得Corn-1菌液作为种子液；

(3)发酵培养：将按照比例混合好的蔗糖豆饼粉培养基放入发酵罐中，并加入水，初始pH值为6.7～7.2之间，高温灭菌，然后待温度降到30℃以下采用负压方法接入步骤(2)的种子液，再在温度为26～34℃，通气量为1∶0.3～1.0，搅拌速度为150～230rpm的条件下发酵培养22～36h；

(4)检测发酵液中菌体数量，待发酵液中芽孢率达到90％停止发酵培养，即得Corn-1菌株的液体制剂。

6、按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的蔗糖豆饼粉培养基中加入植物油或有机硅油。

7、按照权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于所述的发酵培养温度为30～32℃。

8、按照权利要求5或6所述的的制备方法，其特征在于所述的发酵培养时间为22～25h。

9、按照权利要求5或6所述的的制备方法，其特征在于所述的发酵搅拌速度为170～220rpm。

10、权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Corn-1在防治玉米叶斑病上的应用。

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