CN1616648A

CN1616648A - 一种防治土壤病虫害的复合菌剂与有机菌肥的发酵与制备

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Publication number: CN1616648A
Application number: CNA2004100311948A
Authority: CN
Inventors: 任承才; 荀云端; 朱莉
Original assignee: TIANDI XINSHENGLI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: Beijing Tiandiluyuan Inst. of Agricultural Science
Priority date: 2004-04-14
Filing date: 2004-04-14
Publication date: 2005-05-18
Anticipated expiration: 2024-04-14
Also published as: CN1311067C

Abstract

本发明涉及一种复合共生的“功能菌液－SS”，该菌液由蜡状芽胞杆菌ACCC11077、地衣芽胞杆菌ACCC11106、枯草芽胞杆菌ACCC11088三个菌株组成，其比例为1∶1∶1。“功能菌液－SS”的发酵液以有机载体为吸附剂可制成生物有机的“功能菌肥－SS”。本发明的“功能菌液－SS”与“功能菌肥－SS”均可防治大豆与西瓜的枯黄萎病、大豆与黄瓜的线虫病、韭蛆等土传病虫害。

Description

一种防治土壤病虫害的复合菌剂与有机菌肥的发酵与制备

本发明涉及防治植物土传真菌与细菌性病害及根部线虫与蛆类，能够抗重茬并促进植物生长的复合共生的“功能菌液-SS”及生物有机的“功能菌肥-SS”的制备与发酵工艺。

植物的土传病虫害(包括真菌、细菌、线虫、韭蛆等)一直是农业生产中比较难防治的种类，如：枯黄萎病的危害使得大豆、西瓜等不能够重茬或迎茬种植，温室种植黄瓜、番茄3-5年以后由于线虫的严重危害只好废弃。由于缺乏能够有效地防治韭蛆的药剂，剧毒化学农药在韭菜、葱蒜类上的施用屡禁不止，不仅污染生态环境，更危害人类自身的健康。根据自然生态系统中生物间相生相克的平衡理论，在植物土传病虫害发生比较严重的农田生态系统中，可能存在能够相抗并抑制该类土传病虫害的复合共生的“功能菌群”。

本发明的目的在于以植物根际微生物生态系统理论为基础，以现有的3个菌株〔分别为蜡状芽胞杆菌ACCC11077(中国科学院微生物所AS1.0230)、地衣芽胞杆菌ACCC11106(中国科学院微生物所AS1.1216)、枯草芽胞杆菌ACCC11088(中国科学院微生物所AS1.0933)，保藏于中国微生物菌种管理委员会农业微生物中心，中国农业菌种目录，2001年版，中国农业科技出版社，4～7页〕为基础，经过实验室的生物测定与田间的实际应用，配制出防治植物土传真菌与细菌性病害及根部线虫与蛆类，能够抗重茬并促进植物生长的复合共生的“功能菌液-SS”，再以有机载体(腐殖酸铵、草炭粉、污泥粉)为吸附剂制成生物有机的“功能菌肥-SS”，并提供这种菌肥的配制与发酵工艺。

复合共生的“功能菌群”可以是真菌、细菌等各式各样的共生菌群，由于考虑到这些菌抗逆境的生物学特性，以及产品生产、保藏、运输的便利性，本发明所采用的为抗逆性较强的芽孢杆菌类(Bacillus)菌株。

本发明的特征在于包括复合共生的“功能菌液-SS”及生物有机的“功能菌肥-SS”的制备与发酵工艺。

一、复合共生的“功能菌液-SS”的培养方法

1、速生营养肉汁培养基的制备

培养基配方：蛋白胨-8克；NaCl-5克；牛肉膏-5克；葡萄糖-10克；酵母膏-5克；山梨醇-5克；0.2％的5-硝基愈创木酚钠(促进菌落快速良好生长)-1毫升；MgSO₄·7H₂O-0.2克；KCl-0.2克；(NH₄)H₂PO₄-1克；酒石酸钠-0.09克；钼酸铵-0.035克；FeCl₂-0.098克；ZnSO₄-0.8克；MnCl₂-0.07克；CaCl₂-0.3克；CuSO₄-0.2克；NaHCO₃-20毫克；MnSO₄-5毫克；营养琼脂-20克；添加蒸馏水至1000毫升；PH值6.5-7.5；121℃高压灭菌30分钟。取出冷却至60℃左右，在超洁净工作台上，于无菌条件下倒入灭过菌的培养皿中，分别将蜡状芽胞杆菌ACCC、地衣芽胞杆菌ACCC、枯草芽胞杆菌ACCC转到速生营养肉汁培养基中培养，于30℃培养箱中培养72小时，然后进行生物测定。

2、生物测定

将培养好的蜡状芽胞杆菌ACCC11077、地衣芽胞杆菌ACCC11106、枯草芽胞杆菌ACCC11088分别制成浓度为100万/毫升的菌液100毫升，然后各取25毫升以1∶1∶1的比例配成混合菌液。将配好的上述菌液，分别接种于涂有浓度适中的不同病原指示菌培养基上培养，测定对各种作物土传病害的抑菌活性。将从田间采集到的鲜活线虫与韭蛆，分别于配好的上述3种菌液及混合菌液中浸蘸3秒钟，然后在30℃室温中饲养，测定对线虫与韭蛆的杀虫效果。(抑菌活性与杀虫效果见表1)。

表1、ACCC、ACCC、ACCC的抗菌活性与杀虫效果

病虫名称 ACCC11077 ACCC11106 ACCC11088 混合菌液

大豆枯、黄萎病

Fusarium oxysporum ++++ +++ ++++ +++++

F.graminearum +++ ++++ +++ ++++

Pythium ultimum ++++ ++++ +++++ +++++

Rhizoctonia solani +++ +++++ +++ ++++

西瓜枯、黄萎病

F.oxysporium f.sp niveum +++ ++++ +++ +++++

F.oxysporium f.sp melom ++++ +++ ++++ ++++

F.bulbigenum var.nireum ++++ ++++ +++ +++++

番茄枯、黄萎病

F.oxysporum f.sp Lycopersici ++++ ++++ ++++ +++++

Verticillium alb-atrum +++ +++ +++ ++++

辣椒疫病

Colletotrichum capasici +++ ++++ ++++ +++++

苹果根腐病

Helicobasidium mompa ++++ ++++ +++ +++++

大豆胞囊线虫

Heterodera glycines 83.5％ 75.3％ 78.2％ 98.2％

黄瓜根结线虫

Meloidogyne Goeld 82.2％ 71.2％ 76.5％ 96.7％

小麦粒线虫

Anguina tritici 75.3％ 78.5％ 82.2％ 95.3％

韭蛆(迟眼蕈蚊幼虫)

Bradysia odoriphaga 81.6％ 73.9％ 78.5％ 97.6％

注：“+”表示抑菌圈直径(mm)；+：10.0-15.0；++：15.0-20.0；+++：20.0-25.0；

++++：25.0-30.0；+++++：30.0以上

从表1可以看出蜡状芽胞杆菌ACCC11077、地衣芽胞杆菌ACCC11106、枯草芽胞杆菌ACCC11088本身抑菌活性与杀虫效果不是很高，但是经过混合以后，三者发挥复合共生的作用，共同抑菌杀虫的效果得到了显著的提高。

3、拮抗试验

将蜡状芽胞杆菌ACCC11077、地衣芽胞杆菌ACCC11106、枯草芽胞杆菌ACCC11088分别两两组合，在速生营养肉汁培养基上，两点放置相距4cm，每个组合重复三次，进行交叉拮抗试验，结果表明三者相互之间不存在拮抗，能够共同生长。将三者以1∶1∶1的比例混合配制成复合共生的“功能菌液”，然后在速生营养肉汁培养基上共同培养，试验表明三者能够共同均匀地生长形成一个“复合共生系统”。

4、菌种的培养与保藏

分别将蜡状芽胞杆菌ACCC11077、地衣芽胞杆菌ACCC11106、枯草芽胞杆菌ACCC11088接种于速生营养肉汁培养基中单独培养，然后划线接种于斜面试管的速生营养肉汁培养基中，在30℃下培养72小时后，在长好菌的斜面试管中倒入灭菌液体石蜡，液面高出培养基2cm，然后直立置于4℃冰箱中保存，每半年转管复壮一次。

5、菌株的鉴定

ACCC11077是芽孢杆菌属的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，生物学特性：菌体直杆状、成链，光学显微镜下长2.5-4.5微米，宽0.8-1.0微米，革兰氏反应阳性；芽孢近中生，近圆形，芽孢囊不膨大，原生质内含不着色颗粒，而且含量较大；菌落近椭圆形，直径0.5-1.2cm，边缘不整齐，无隆起，无光泽，不透明，蜡质；生长温度15℃-50℃，最适温度30℃-35℃，适宜PH6.0-7.5；能厌氧生长，PH5.7生长，接触酶阳性，碳水化合物产气阳性，不产生吲哚，苯丙氨酸脱氨酶阴性，液体培养形成菌膜；V.P反应阳性，V.P液培养后PH为4.5-6.0；7％NaCl中生长，适宜碳源为葡萄糖、蔗糖，适宜氮源为蛋白胨、牛肉膏，无机氮源为NH₄ ⁺，发酵葡萄糖、麦芽糖产酸，发酵木糖、乳糖、甘露醇不产酸，水解淀粉，利用柠檬酸盐，还原硝酸盐为亚硝酸盐，能产生蛋白酶和溶菌酶。

ACCC11106是芽孢杆菌属的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，生物学特性：菌体直杆状、成链，光学显微镜下长3.0-4.5微米，宽1.0-1.2微米，革兰氏反应阳性；芽孢近中生，近椭圆形，芽孢囊不膨大，原生质内无不着色颗粒；菌落近椭圆形，直径0.3-0.5cm，中间微凸起，边缘不整齐，微隆起，菌落无光泽，不透明；生长温度15℃-47℃，最适温度28℃-32℃，接触酶阳性，V.P阳性，V.P液生长后PH5.5-6.0；能厌氧生长，PH5.7生长，7％NaCl中生长，碳水化合物不产气；适宜碳源为麦芽糖、蔗糖，适宜氮源为蛋白胨、牛肉膏；水解淀粉，利用柠檬酸盐与丙酸盐，还原硝酸盐为亚硝酸盐，能产生几丁质酶。

ACCC11088芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，生物学特性：菌体直杆状，光学显微镜下长2.5-3.5微米，宽0.8-1.0微米，革兰氏反应阳性；芽孢近圆形，近中生，芽孢囊不膨大，原生质内没有不着色颗粒；菌落近圆形，直径0.6-0.8cm，中间微凹无褶皱，边缘不整齐，有隆起，不透明，乳黄色；生长温度10℃-50℃，最适温度28℃-32℃，PH4-9都能生长，最适PH为6.5-8；好氧，不能厌氧生长，PH5.7生长，7％NaCl生长；石蕊牛奶不产酸，过氧化氢酶反应产气，接触酶阳性；V.P反应阳性，V.P液生长后PH6.0，利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸，抗溶菌酶，不抗叠氮化钠，水解淀粉，利用柠檬酸盐，不利用丙酸盐，水解淀粉，还原硝酸盐为亚硝酸盐，能产生蛋白酶。

(B.E.布坎南和N.E.吉本斯等，伯吉细菌鉴定手册第八版)

二、“功能菌液-SS”与“功能菌肥-SS”的制备与发酵工艺

1、菌液的制备：

速生营养肉汁培养液配方：

蛋白胨-8克；NaCl-5克；牛肉膏-5克；葡萄糖-10克；酵母膏-5克；山梨醇-5克；0.2％的5-硝基愈创木酚钠(促进菌落快速良好生长)-1毫升；MgSO₄·7H₂O-0.2克；KCl-0.2克；(NH₄)H₂PO₄-1克；酒石酸钠-0.09克；钼酸铵-0.035克；FeCl₂-0.098克；ZnSO₄-0.8克；MnCl₂-0.07克；CaCl₂-0.3克；CuSO₄-0.2克；NaHCO₃-20毫克；MnSO₄-5毫克；营养琼脂-3克；添加蒸馏水至1000毫升；PH值6.5-7.5。

按上述配方将速生营养肉汁培养基配制好后，倒入三角摇瓶中，然后121℃高压灭菌30分钟，待冷却后在超洁净工作台上，在无菌操作的条件下，将保存培养的蜡状芽胞杆菌ACCC11077、地衣芽胞杆菌ACCC11106、枯草芽胞杆菌ACCC11088三个菌株各自配成菌液，分别接种到三角摇瓶中，每瓶接种比例为3％，在30℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，将三个菌株的菌液以1∶1∶1的比例混合摇匀，然后以3％的比例接种到发酵罐。

2、“功能菌液-SS”的发酵

发酵罐速生营养液配方：黄豆粉-3％；鱼粉-2％；玉米粉-1％；蔗糖-0.3％；甘油-0.2％；酵母片-0.1％；10％钙镁磷肥溶液-2％；10％草木灰水上清液-1％；NaCO₃-0.02％；NaCl-0.5％；5-硝基愈创木酚钠(促进菌落快速良好生长)2ppm；营养琼脂-3％；PH值6.5-7.5。

空罐在125℃/0.15Mpa压力下灭菌30分钟，装料后在121℃/0.12Mpa下灭菌2小时。冷却至30℃后按3％的比例接种；培养温度30℃，24小时后增至35℃，48小时后降至32℃；通气量开始在1∶1(v.v.m)，培养24小时后增至1∶1.5(v.v.m)，48小时后降至1∶1.2(v.v.m)。发酵至72小时发酵完毕，经过镜检蜡状芽胞杆菌ACCC11077、地衣芽胞杆菌ACCC11106、枯草芽胞杆菌ACCC11088的比例在1∶1∶1左右，含菌量达到80-100亿/毫升时为合格产品。

发酵液可直接装袋包装制成复合共生的“功能菌液-SS”；发酵液以有机载体(腐殖酸铵、草炭粉、污泥粉)为吸附剂制成生物有机的“功能菌肥-SS。

3、“功能菌肥-SS”的配制

吸附剂的制备：将腐殖酸、草炭、污泥粉按2∶3∶5的比例混配，再加入千分之一的5-硝基愈创木酚钠混匀，经121℃高温高压灭菌30分钟。

营养液的制备：尿素-20kg；磷酸二氢钾-30kg；硫酸钾-20kg；钼酸铵-0.1kg；硫酸镁0.1kg；柠檬酸铁0.1kg；硫酸锌0.1kg；硼酸0.1kg；加入100升水中溶解均匀后，经121℃高温高压灭菌30分钟。

菌肥的配制：将灭菌后温度降至30℃的吸附剂800kg加入搅拌装置的容器内，加入100升营养液，加入100升菌液，以每分钟250-300转的速度搅拌10分钟，直至搅拌均匀，即为生物有机的“功能菌肥-SS”，该菌肥经过镜检蜡状芽胞杆菌ACCC11077、地衣芽胞杆菌ACCC11106、枯草芽胞杆菌ACCC11088的比例在1∶1∶1左右，总含菌量在5-8亿个/克，杂菌数＜100个/克时为合格产品。

本发明的工艺流程详见附图1。

三、“功能菌液-SS”与“功能菌肥-SS”的施用方法

1、拌种：

每亩用30-50毫升菌液，加5倍的水均匀喷洒于种子表面，喷洒的过程中不断的翻动，使菌液均匀粘附于种子表面，稍晾干后即可播种。

2、蘸根：

每亩根苗用30-50毫升菌液，按按每亩蘸根所需水量进行稀释，然后将根苗均匀蘸上菌液，稍晾干即可栽植。

3、灌根：

每亩用30-50毫升菌液，稀释1000倍左右，随灌溉水少量不断地均匀喷洒于水中，灌溉水灌匀整个地块为止。

如若滴灌，可直接加入滴灌水中。

4、底肥：

采用条施、穴施的方法将菌肥均匀洒入条沟、穴内和种子或植株的根部附近，然后覆土，最好再配合灌水。

本“功能菌液-SS”与“功能菌肥-SS”适用于：小麦、玉米、水稻、大豆、棉花、花生、西瓜、黄瓜、韭菜、辣椒、茄子、西红柿、果树等多种植物，尤其是在土壤病虫害发生较严重的地块使用效果更好，能够显著抑制土壤病虫害，包括枯黄萎病、线虫、韭蛆、根腐等。

防病机理：初步研究表明，该复合菌株可以分泌抗菌蛋白、溶菌酶、几丁质酶等，对真菌的分生孢子、细菌细胞、虫蛆几丁质有溶解作用，对土壤中的有机质有分解转化的作用。施入土壤中可以迅速繁殖扩增，能够将土壤中被固定的磷、钾等元素转化为可被植物吸收利用的速效磷、钾，可以与根瘤固氮菌良好共生，促进植物对氮的吸收与利用。无毒无污染，不影响生态环境，在作物周围土壤形成局部优势，可以在土壤中长期存在，但菌量会逐步下降。

实施例1、对大豆枯、黄萎病的防效

浸种处理对大豆枯、黄萎病的防效苗期为100％，成株期为97.2％，田间灌根防效为83.6％，以菌肥做底肥防治效果为94.5％，增产26.2％。

实施例2、对西瓜枯、黄萎病的防效

浸种与蘸根处理对西瓜枯萎病苗期防效为100％，成株期防效96.4％，田间灌根防效为88.7％，以菌肥作底肥防治效果为95.6％，增产26.8％。

实施例3、对大豆线虫的防效

浸种处理对大豆线虫苗期的防效为100％，成株期防效为95.3％，田间灌根防效为85.8％，以菌肥作底肥防治效果为95.6％，增产28.5％。

实施例4、对黄瓜线虫的防效

浸种与蘸根处理对黄瓜线虫苗期的防效为100％，成株期防效为93.2％，田间灌根防效为84.5％，以菌肥作底肥防治效果为92.4％，增产25.3％。

实施例5、对韭菜韭蛆的防效

田间灌根防治效果为87.9％，以菌肥作底肥防治效果为92.1％，增产27.8％。

实施实例6、对辣椒疫病的防效

浸种与蘸根处理对辣椒疫病苗期的防治效果为100％，成株期防效为94.8％，田间灌根防效为90.3％，以菌肥作底肥防治效果为93.6％，增产23.5％。

Claims

1.一种复合共生的“功能菌液-SS”，其特征在于该复合共生菌液由蜡状芽胞杆菌ACCC11077、地衣芽胞杆菌ACCC11106、枯草芽胞杆菌ACCC11088三个菌株组成，其比例为1∶1∶1。

2.根据权利要求1的“功能菌液-SS”，所述的三个菌株是在速生营养肉汁培养基中培养，其中培养基的配方为：蛋白胨-8克；NaCl-5克；牛肉膏-5克；葡萄糖-10克；酵母膏-5克；山梨醇-5克；0.2％的5-硝基愈创木酚钠-1毫升；MgSO₄·7H₂O-0.2克；KCl-0.2克；(NH₄)H₂PO₄-1克；酒石酸钠-0.09克；钼酸铵-0.035克；FeCl₂-0.098克；ZnSO₄-0.8克；MnCl₂-0.07克；CaCl₂-0.3克；CuSO₄-0.2克；NaHCO₃-20毫克：MnSO₄-5毫克；营养琼脂-20克；添加蒸馏水至1000毫升。

3.根据权利要求1的“功能菌液-SS”，所述的三个菌株的发酵罐速生营养液配方是：黄豆粉-3％；鱼粉-2％；玉米粉-1％；蔗糖-0.3％；甘油-0.2％；酵母片-0.1％；10％钙镁磷肥溶液-2％；10％草木灰水上清液-1％；NaCO₃-0.02％；NaCl-0.5％；5-硝基愈创木酚钠-2ppm；营养琼脂-3％。

4.采用如权利要求1所述的“功能菌液-SS”防治土传病虫害的用途，用于防治：大豆与西瓜的枯黄萎病、大豆与黄瓜的线虫病、韭蛆。

5.一种生物有机的“功能菌肥-SS”，其特征在于该菌肥是以如权利要求1所述的“功能菌液-SS”的发酵液以有机载体为吸附剂制成生物有机的“功能菌肥-SS”。

6.根据权利要求5的“功能菌肥-SS”，所述的有机载体为腐殖酸铵、草炭粉、污泥粉，三者的比例为2∶3∶5。

7.根据权利要求5的“功能菌肥-SS”，该菌肥营养液的制备方法为：将尿素-20kg；磷酸二氢钾-30kg；硫酸钾-20kg；钼酸铵-0.1kg：硫酸镁0.1kg；柠檬酸铁0.1kg；硫酸锌0.1kg；硼酸0.1kg；加入100升水中溶解均匀后，经121℃高温高压灭菌30分钟。

8.采用如权利要求5所述的“功能菌肥-SS”防治土传病虫害的用途，用于防治：大豆与西瓜的枯黄萎病、大豆与黄瓜的线虫病、韭蛆。