CN101352178B - 一种黄瓜专用复合抗重茬微生态制剂及其专用菌株与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄瓜专用复合抗重茬微生态制剂及其专用菌株与应用。本发明的复合抗重茬微生态制剂是以多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565和哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563为活性成分的制剂。所述多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565的含量为50亿cfu/克制剂；所述哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563的含量为5亿cfu/克制剂。本发明的复合抗重茬微生态制剂高效、无毒、无污染，不仅可以预防和控制黄瓜重茬引起的多种病害，而且还可以提高黄瓜产量、改善品质和增强黄瓜植株的抗逆性，有利于减少化学农药的用量和在农产品上的残留，对保护人体健康和防止环境污染都极为重要。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄瓜专用复合抗重茬微生态制剂及其专用菌株与应用。
背景技术
黄瓜富含多种维生素和蛋白质，具有补血开胃、增进食欲、美容等多种作用功效，而且常年供应。因此，黄瓜的健康生长关系到食用者的身体健康。但是，近年来随着农业产业结构的调整，保护地黄瓜种植面积在不断扩大，然而产量得不到明显提高，而且有逐年下降的趋势，其主要原因是病害造成的，造成病害的原因之一是重茬种植。黄瓜重茬病害主要有立枯猝倒病、霜霉病、枯萎病、灰霉病、根腐病等，随着重茬病害发生频率增高，病情加重，轻者减产20％～30％，重者达50％以上，甚至绝收，成为制约黄瓜产量、持量和效益的主要因素。此外，由于长期连作及农药的使用导致病原菌产生抗药性，致病力增强，致使病害日趋蔓延和猖撅，从而给种植者带来严重的经济损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄瓜专用复合抗重茬微生态制剂及其专用菌株与应用。
本发明所提供的复合抗重茬微生态制剂，是以多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCCNo.2565和哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563为活性成分的制剂。本发明的复合抗重茬微生态制剂能防治由于黄瓜重茬引起的黄瓜立枯猝倒病、霜霉病、枯萎病、灰霉病和根腐病等。
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)KTF002已于2008年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2563。多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)KTB002已于2008年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2565。
其中，所述多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565和哈茨木霉KTF002 CGMCCNo.2563的集落形成单位数目比为(10-30)∶(1-10)。所述多粘类芽孢杆菌KTB002CGMCC No.2565的含量具体可为50亿cfu/克制剂；所述哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563的含量为5亿cfu/克制剂。
本发明的复合抗重茬微生态制剂可以是固体或者液体制剂。可加入吸附剂将所述复合抗重茬微生态制剂制成固体制剂，所述吸附剂具体可为轻质碳酸钙和/或草炭。所述固体制剂的粒度优选为0.09mm。
经田间试验，本发明的复合抗重茬微生态制剂能够有效控制黄瓜灰霉病、立枯病、根腐病和霜霉病等重茬病害的发生，防治效果均达到30％以上；且有促生增产的作用效果，能够明显提高黄瓜单株鲜重、单株结瓜数，增产效果显著，达到20％左右。此外，还可以改善黄瓜品质，增强抗逆性，因此可以在黄瓜种植区大面积推广应用。
本发明的复合抗重茬微生态制剂高效、无毒、无污染，不仅可以防治病害提高产量，而且可以减少化学农药的用量和在农产品上的残毒，对保护人体健康和防止环境污染都极为重要。所以本发明的复合抗重茬微生态制剂具有重大的现实意义及有广阔的发展前景。
具体实施方式
实施例1、复合抗重茬微生态制剂的制备
1.控制黄瓜重茬病的菌株的获得
从黄瓜重茬重病田的健康植株体内和根内分离筛选获得2株控制黄瓜重茬病的高效菌株——哈茨木霉(Trichoderma harzianum)编号是KTF002和多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)编号是KTB002。
控制黄瓜重茬病的高效菌株——哈茨木霉(Trichoderma harzianum)KTF002和多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)KTB002的分离和筛选方法如下：
(1)分离
哈茨木霉分离平板培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加水1000ml，丙酸钠1g。然后分装克氏瓶或试管，置于灭菌锅内，在0.11MPa压力，121℃下灭菌30min，冷却后制成斜面备用。
多粘类芽孢杆菌分离平板培养基(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)：牛肉膏0.3g/100ml，蛋白胨0.5g/100ml，NaCl 0.5g/100ml，琼脂2g/100ml。将琼脂加热溶化后用NaOH或Hcl调pH值至7.0-7.2，然后分装克氏瓶或试管，置于灭菌锅内，在0.11MPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用。
在黄瓜重茬重病田选择健康植株的根、茎、叶等组织，用蒸馏水冲洗干净，用70％的酒精浸30s，然后用1g/100ml NaClO处理15min，无菌水冲洗3次，最后一次无菌水冲洗液涂营养琼脂(NA)平板，28℃培养3-5d，检测表面灭菌是否彻底，每处理3次重复。取经检验表面灭菌彻底的材料剪碎，取1g加适量无菌水研碎，将上清液稀释到10-1，振荡均匀(用于分离多粘类芽孢杆菌的上清液放入80℃的水中处理20分钟)稀释到10-2，取0.1ml分别接种到哈茨木霉分离平板培养基和多粘类芽孢杆菌分离平板培养基上，涂布均匀，置于26-28℃恒温箱中培养3-5d，待单菌落长出后，纯化，转管，保存。
(2)筛选
分别接种黄瓜重茬病原菌(立枯猝倒病、霜霉病、枯萎病、灰霉病、根腐病的病原菌)于PDA平板中央，将待测木霉和芽孢杆菌接种于平板四周，每皿在4个方位各接种1株，重复3次，进行初筛；取拮抗性明显的菌株，再进行单株与病原菌对峙培养，采取一边接木霉或芽孢杆菌，一边接病原菌的对峙培养法进行复筛。结果得到2株对黄瓜重茬病原菌具有拮抗作用的菌株，命名哈茨木霉KTF002和多粘类芽孢杆菌KTB002。
哈茨木霉KTF002在PSA平板上，菌落暗绿色，中部为密实产孢区，外缘也产孢，菌丝较少，分生孢子梗丛束疏松，环状排列，主分枝呈树状，其上有众多次级分枝，常2-3个一组，直角伸出，瓶梗短，基部变细，中间膨大，以大角度伸出，终极瓶梗长而细，5个以内的瓶梗近似轮枝排列，产孢细胞大小为长7.50-12.50微米，宽2.00-3.75微米，分生孢子呈球形或倒卵圆形，大小为(2.50-3.75)×(2.50-3.00)微米，经形态学鉴定哈茨木霉KTF002为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。
提取多粘类芽孢杆菌KTB002的基因组DNA，分别以530F和1494R，67F和1387R为引物对进行PCR扩增，
530F：5′GTGCCAGCMGCCGCGG 3′，
1494R：5′GGYTACCTTGTTACGACTT 3′；
67F：5′CAGGCCTAACACATGCAAGTC 3′，
1387R：5′GGGCGGTGATGTACAAGGC 3′。
530F/1494R扩增出约1kb的片段，67F/1387R扩增出约1.3kb的片段，将得到的DNA纯化后，连接到pMD-18T载体上，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选，得到含有插入片段的转化子，进行EcoR I和Hind III酶切验证，测序，拼接所得到的序列，BLAST比对结果表明KTB002与多粘类芽孢杆菌的16S rDNA的序列同源性很高(95％以上)，分析细菌的16S rDNA的系统发生树状图也确定了此菌株的初步分类学的地位，与BLAST比对结果保持一致。在此基础上，进行属内的各种生理、生化指标的检测，KTB002菌体杆状，长2.5-5.2微米，宽0.7-0.8微米，革兰氏反应阳性，芽孢卵圆形，孢囊膨大；pH5.6生长，8d/100ml NaCl可抑制生长，不能利用柠檬酸盐，可产酸，V-P反应呈阳性，V-P肉汤pH6，水解淀粉，NO3 -还原为NO2 -，可厌氧生长，接触酶阳性，多粘类芽孢杆菌KTB002为多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)。
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)KTF002已于2008年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2563。多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)KTB002已于2008年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2565。
2.复合抗重茬微生态制剂的制备
复合抗重茬微生态制剂经液体深层发酵法制成粉剂，主要步骤为原菌种活化→菌种扩大培养→种子罐培养→发酵罐培养→后处理。
A.原菌种活化和菌种扩大培养
(1)多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565培养基制备：牛肉膏0.3g/100ml，蛋白胨0.5g/100ml，NaCl 0.5g/100ml，琼脂2g/100ml。将琼脂加热溶化后用NaOH或Hcl调pH值至7.0-7.5，然后分装克氏瓶或试管，置于灭菌锅内，在121-125℃，0.11-0.14MPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用。
(2)哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563培养基制备：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，然后分装克氏瓶或试管，置于灭菌锅内，在121-125℃，0.11-0.14MPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用。
(3)菌种活化与扩大培养：用培养基在无菌条件下从原菌种斜面上挑取少许菌苔，置放试管斜面内进行划线，然后置30-32℃温箱内培养，多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCCNo.2565培养24h，哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563培养48h，经检查无杂菌、菌体生长整齐；最后置30-32℃温箱内培养，多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565培养24h，哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563培养48h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片、染色检查无杂菌，孢子整齐，作为发酵生产的菌种。
B.种子罐培养
(1)多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565种子罐培养基：豆饼粉0.5g/100ml、鱼粉0.3g/100ml、玉米粉0.5g/100ml、葡萄糖0.3g/100ml，豆油0.2-0.3g/100ml(或泡敌0.3g/100ml)，pH值7.0-7.5。
(2)哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563种子罐培养基：蔗糖20g/L，牛肉膏3.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1.5g/L，用NaOH或HCl调pH值至6.5-7.0。
(3)空发酵罐灭菌：发酵罐在使用前清洗干净，排除污物，并在121-125℃，0.11-0.14MPa压力下，灭菌30min。
(4)种子罐装料：分别按照(1)和(2)的培养基装料，投料量不超过罐容积70％。
(5)种子罐灭菌：装好料后，在121-125℃，0.11-0.14MPa压力下灭菌30min，冷却至30℃后接种。
(6)悬浮液制备：在无菌条件下将每个克氏瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液。
(7)接种：将(6)制备的哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563或多粘类芽孢杆菌KTB002CGMCC No.2565的悬浮液，按1％的比例接种于冷却至30℃的种子罐内进行培养。
(8)种子罐培养：多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565接种后在温度为28-30℃，转速220rpm搅拌条件下，培养8-10h；哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563接种后在温度为29-30℃转速160rpm，培养3-4天。
C.发酵罐发酵
(1)多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565发酵罐培养基：豆饼粉2g/100ml，鱼粉0.5g/100ml，玉米浆1.8g/100ml，淀粉0.4g/100ml，硫酸镁0.06g/100ml，碳酸钙0.5g/100ml，磷酸二氢钾0.03g/100ml，豆油0.1g/100ml或泡敌0.05g/100ml，用NaOH或HCl调pH值7.0-7.5。
(2)哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563发酵罐培养基：蔗糖20g/L，牛肉膏3.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1.5g/L，用NaOH或HCl调pH值至6.5-7.0。
(3)空发酵罐灭菌：发酵罐在使用前清洗干净，排除污物，并在121-125℃，0.11-0.14MPa压力下，灭菌30min。
(4)发酵罐装料：分别按照(1)和(2)的培养基装料，投料量不超过罐容积70％。
(5)发酵罐灭菌：装好料后，在121-125℃，0.11-0.14MPa压力下灭菌30min，冷却至30℃后即可接种。
(6)接种：将种子罐培养的哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563或多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565菌液按发酵培养基的1ml/100ml接种于冷却至30℃的发酵罐内进行培养。
(7)发酵培养
多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565发酵：搅拌速度190-200转/min，罐压0.05MPa；通气量(每分钟进出的气体体积之比)：1∶1.5；发酵培养周期为15-20小时，在芽孢70％形成，个别芽孢开始脱落时，即可放罐，这时杂菌污染＜0.3％含菌量＞50亿cfu/ml；
哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563发酵：搅拌速度160-180转/min，罐压0.05MPa；流量：50L/min，发酵培养周期为3-4天，厚垣孢子70％形成，即可放罐，这时杂菌污染＜0.3％含菌(厚垣孢子)量＞5.0×108cfu/ml。
D.后处理
(1)吸附剂：多粘类芽孢杆菌采用粒度为0.09mm的轻质碳酸钙为吸附载体，哈茨木霉采用普通草炭为吸附载体，加入量分别按下列公式计算。
(2)压滤：按(1)计算的量向C中步骤7得到的发酵液中加入吸附剂，机械搅拌3-6h，使芽孢或/和孢子全部被吸附，然后再用板框压滤。
(3)干燥：将板框压滤后的滤饼捣碎后，置于烘干机或烘干装置内进行烘干，烘干时的温度不超过40℃(为了防止菌体死亡)，要不断翻动，使受热均匀，当含水率≤5％时，即进行粉碎。
(4)粉碎：高细度粉碎机(0.09mm孔径筛)粉碎，制成哈茨木霉KTF002 CGMCCNo.2563和多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565固体制剂。
(6)制备复合抗重茬微生态制剂
哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563和多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565固体制剂按1∶1的质量比混合，制备防治黄瓜灰霉病、霜霉病、立枯病、枯萎病等病害的复合抗重茬微生态制剂，每克复合抗重茬微生态制剂中含有哈茨木霉KTF002 CGMCCNo.2563的厚垣孢子为5亿cfu，多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565的芽孢为50亿cfu。
(7)成品检验
用干燥失重法测定含水率，HG2-896标准的湿筛法测定细度。成品含水率≤5％，且100％通过0.09mm筛为合格。检验结果表明步骤(6)制备的复合抗重茬微生态制剂的含水率为4％，100％能通过0.09mm筛。
(8)包装
用编制袋(内有塑料袋)25Kg包装，于干燥通风处贮存，保存期3年。
实施例2、复合抗重茬微生态制剂的制备
复合抗重茬微生态制剂的制备方法同实施例1，不同之处仅在于：哈茨木霉KTF002CGMCC No.2563和多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565固体制剂按10∶3的质量比混合，制备防治黄瓜灰霉病、霜霉病、立枯病、枯萎病等病害的复合抗重茬微生态制剂，每克复合抗重茬微生态制剂中含有哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563的厚垣孢子为50亿cfu/克，多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565的芽孢为150亿cfu。
实施例3、实施例1的复合抗重茬微生态制剂的田间实验效果
试验地选在北京市绿富隆蔬菜公司延庆基地，该基地已有连续5年种植黄瓜的历史，灰霉病历年发病均较重，试验期间大棚温度为10～20℃，湿度在85％以上，自然发生灰霉病。黄瓜津春3号(北京博通农艺科技中心)2006于12月中旬定植，行株距0.6m×0.3m，选择地势平坦，土壤性状一致，肥力均匀中等，发病相对均匀的塑料大棚地块。
设2个处理，处理1为分别于次年的3月14日和4月3日进行叶面喷施实施例1的复合抗重茬制剂各1次，4千克/亩；处理2为分别于次年的3月14日和4月3日进行叶面喷施清水作为对照；每个处理设3次重复，共6个小区，随机区组排列。每小区5垄(10行约250株)。各小区其他管理一致，田间管理按当地习惯进行。
每20天调查1次黄瓜灰霉病发病情况，共调查3次。每次取每重复中间3垄的右边一行(3行约75株)，记载全部整株的好瓜数及病瓜数，计算发病率，统计防治效果。
发病率(％)＝发病瓜数/调查总瓜数×100
防治效果(％)＝(对照区发病率-处理区发病率)/对照区发病率×100
每10天统计1次产量，共统计4次。每次在每重复中间3垄的右边一行(3行约75株)，每行随机取大小相对比较均匀的黄瓜摘取5条进行称重记载，计算单个黄瓜重和亩产量。
亩产量(Kg)＝亩株数×每株平均结瓜数×单瓜重(g)/1000
增减效果(％)＝(处理区平均亩产量-对照区平均亩产量)/对照区平均亩产量×100。
发病率和防治效果统计的实验结果如表1，表明3月14日在处理区未进行叶面喷施复合抗重茬微生态制剂时，对处理区和对照区的黄瓜进行病害调查，发现处理区黄瓜灰霉病发病率高于对照区，发病率分别为28.3％和22.6％；第一次喷施复合抗重茬制剂20天后，于4月3日调查，发现处理区和对照区的发病率分别为16.0％和24.0％，防效达到33.6％；第二次喷施复合抗重茬制剂20天后，4月23日调查处理区和对照区的发病率分别为9.8％和16.6％，防效为40.9％。经SAS统计分析，2次喷施复合抗重茬制剂后，其对黄瓜灰霉病的防效均达到显著水平。
表1.复合抗重茬微生态制剂对大棚黄瓜灰霉病的防治效果
亩产量和增减效果的统计实验结果如表2，表明第一次喷施复合抗重茬微生态制剂10天后，于3月24日调查黄瓜产量，处理区比对照区结瓜数增加6.7％、亩产量增加3.9％；喷洒复合抗重茬微生态制剂20天后于4月3日调查，处理区比对照区结瓜数增加11.3％、亩产量增加4.2％。第二次喷洒复合抗重茬微生态制剂10天后4月13日调查发现处理区比对照区结瓜数增加9.2％、亩产量增加16.9％；第二次喷洒复合抗重茬微生态制剂20天后4月23日调查处理区比对照区结瓜数增加18.6％、亩产量增加24.2％；调查结果表明喷施复合抗重茬微生态制剂后，黄瓜亩产量明显增加，经SAS统计分析达到显著水平。
表2.复合抗重茬微生态制剂对大棚黄瓜产量调查结果
实施例4、实施例2的复合抗重茬微生态制剂的黄瓜田间实验
选择已有连续6年种植黄瓜历史的试验地，立枯病、霜霉病及根腐病历年发病均较重，试验期间自然发生立枯病、霜霉病及根腐病。
设2个处理，处理1为分别于育苗前拌种和苗期喷施实施例2的复合抗重茬微生态制剂各1次，4千克/亩；处理2为分别育苗前清水拌种和苗期喷施清水作为对照；每个处理设4次重复，共8个小区，随机区组排列。每小区面积30m2。各小区其他管理一致，田间管理按当地习惯进行。
每隔30m2的地块中(即一次重复)进行田间调查，采用五点取样法，每点取60株，调查黄瓜立枯病、根腐病和霜霉病的发病率并计算防治效果，计算产量和增产效果。记载调查株数及病株数，计算发病率，统计防治效果。
发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100
防治效果(％)＝(对照区发病率-处理区发病率)/对照区发病率×100
试验结果表明，实施例2的复合抗重茬微生态制剂可增强黄瓜的抗病能力，死苗率下降，对黄瓜立枯病、根腐病和霜霉病均有明显的防治效果。从试验调查结果分析，施用该抗重茬微生态制剂后，黄瓜立枯病的发病率达到17.1％，而对照的发病率为67.5％，防效达到77.3％，而在对照黄瓜的根腐病发病率为0.84％，处理的发病率为2.88％，防效达到70.8％，黄瓜霜霉病病叶发病率为4.3％，而对照为19.3％，防效达77.7％。观察还发现施用该抗重茬微生态制剂的黄瓜叶片厚重，而对照叶片微薄；其次对黄瓜株高、单株鲜重、开花数量均有显著提高，分别较对照增加12.5％、34.5％、26.2％；其次对黄瓜有明显的增产效果，平均增产在15％～30％之间。
上述试验结果表明，使用本发明的复合抗重茬微生态制剂可适当减少化学农药的施用量，减少黄瓜的农药残留，进一步验证了复合抗重茬微生态制剂的作用效果。
Claims (9)
1.一种抗黄瓜重茬复合微生态制剂，是以多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)KTB002 CGMCC No.2565和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)KTF002 CGMCC No.2563为活性成分的制剂；
所述多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565和哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563的菌落形成单位数目比为(10-30)∶(1-10)。
2.根据权利要求1所述微生态制剂，其特征在于：所述多粘类芽孢杆菌KTB002 CGMCC No.2565的芽孢含量为50亿cfu/克制剂。
3.根据权利要求1所述微生态制剂，其特征在于：所述哈茨木霉KTF002 CGMCC No.2563的厚垣孢子含量为5亿cfu/克制剂。
4.根据权利要求2或3所述微生态制剂，其特征在于：所述制剂为固体。
5.根据权利要求4所述微生态制剂，其特征在于：所述制剂的粒度为0.09mm。
6.根据权利要求5所述微生态制剂，其特征在于：所述制剂还含有吸附剂。
7.根据权利要求6所述微生态制剂，其特征在于：所述吸附剂为轻质碳酸钙和/或草炭。
8.多粘类芽孢杆菌KTB002，其保藏编号为CGMCC No.2565。
9.哈茨木霉KTF002，其保藏编号为CGMCC No.2563。
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