CN100406552C

CN100406552C - 一株成团泛菌及其发酵培养方法与应用

Info

Publication number: CN100406552C
Application number: CNB2006100669815A
Authority: CN
Inventors: 薛梦林
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2006-04-03
Filing date: 2006-04-03
Publication date: 2008-07-30
Anticipated expiration: 2026-04-03
Also published as: CN1831116A

Abstract

本发明公开了成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCC No.1655及其发酵培养方法与应用。其发酵培养方法包括以下步骤：1)将成团泛菌(Pantoeaagglomerans)B501 CGMCC No.1655接种到其三角瓶、种子罐专用培养基中，在28-35℃、pH为7.0-8.0下培养24-48小时，得到种子液；2)将步骤1)制备的种子液接种到该菌的发酵罐专用培养基中，在28-35℃、pH为7.0-8.0下培养48-96小时。该菌及以该菌为活性成分的菌剂可用于防治果蔬真菌病害，并具有以下优点：1)抑菌谱较广，防病效果好；2)作用效率高；3)生物安全性高；4)发酵周期短，菌剂制备工艺简单，具有工业化生产的可能性。

Description

一株成团泛菌及其发酵培养方法与应用

技术领域

本发明涉及一株成团泛菌及其发酵培养方法与应用。

背景技术

1989年，Gavini等(Gavini，F.et al.Transfer of Enterobacter agglomerans(Beijerinck 1888)Ewing and Fife 1972 to Pantoea gen.nov.as Pantoeaagglomerans comb.nov.and description of Pantoea dispersa sp.nov.[J].Int.J.Syst.Bacteriol，1989，39：337-345.)创立了泛菌属(Genus Pantoea)，该属包括成团泛菌(Pantoea agglomerans)和分散泛菌(Pantoea dispersa)二个种，其中成团泛菌种(Pantoea agglomerans)与成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)和鸡血藤欧文氏菌(Erwinia milletiae)为同义名，它是产类胡萝卜素的黄色菌群，最早从植物、种子中分离获得，后来在多种环境中均发现了该菌群的存在。研究人员对成团泛菌进行了大量研究工作，发现它在医学、农业及遗传学上都具有重要作用，主要表现在以下方面：

1)生物代谢方面：具有脱卤素、降解三硝酸甘油及将甘油转化为1，3-丙二醇的能力。

2)促生方面：不仅具有溶磷、生物固氮能力，还可分泌植物激素及各种酶类，具有潜在的应用价值。

3)生物防治方面：近年来，研究人员发现该菌可以有效地抑制由不同细菌、真菌引起的植物病害。例如，从玉米根际土壤分离到的成团泛菌对引起植物病害的一种土著致病真菌(Fusarium moniliforme)具有抑制作用；对由解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)引起的水果火疫病也具有一定的防治效果；在大麦田间试验中，成团泛菌对由丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)引起的粒疫病的防治效果可达到45％-70％；从水稻分离到的内生成团泛菌对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)具有拮抗作用；从苹果表面分离的成团泛菌CPA-2能有效抑制苹果、梨和柑桔的主要真菌病害。

目前，大多数细菌的生防效果与抗生素的产生有关。频繁使用抗生素可使病原物产生抗药性，降低防病效果，并且还会对人类健康造成威胁。

发明内容

本发明的目的是提供一株对果蔬真菌病害具有防治作用且不产生抗生素的成团泛菌及其发酵培养方法。

本发明所提供的成团泛菌菌株是(Pantoea agglomerans)B501，该菌株已于2006年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1655。

成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655的是革兰氏阴性菌(0.5-0.8×1-3μm)，在LB培养基上划线后，经28℃培养1-2d后，可产生光滑、圆形、凸起的黄色菌落。D-甘露糖、D-木糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、蔗糖、乳糖、水扬甘、麦芽糖及海藻糖产酸为阳性；卫矛醇、间-肌醇(慢)、D-阿东醇、α-甲基-D-葡萄糖甘和D-山梨醇(慢)产酸为阴性。精氨酸脱酸酶、鸟氨酸脱酸酶、精氨酸双水解酶、苯丙氨酸脱氨酶、脲水解、氧化酶、吲哚产生、明胶液化、脂酶、D-葡萄糖产气、H₂S产生和KCN生长为阴性；运动性、七叶灵水解、丙二酸利用、柠檬酸盐及D-葡萄糖产酸为阳性。生长温度范围：3-42℃，最适生长温度：28-32℃；生长酸碱度范围：pH＝5-8.6，最适pH＝7.2-7.5。

本发明的第二个目的是提供一种成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCCNo.1655的发酵培养方法。

本发明所提供的成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCC No.1655的发酵培养方法，包括以下步骤：

1)将成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCC No.1655接种到三角瓶、种子罐专用培养基中，在28-35℃、pH为7.0-8.0下培养24-48小时，得到种子液；所述成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCC No.1655的三角瓶、种子罐专用培养基配方为：胰蛋白胨8-12g，酵母提取物4-6g，蔗糖10-20g，NaCl 8-12g，用水定容至1000mL；

2)将步骤1)制备的种子液接种到该菌的发酵罐专用培养基中，在28-35℃、pH为7.0-8.0下培养48-96小时；所述成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCCNo.1655的发酵罐专用培养基的配方为：蔗糖8-12g，胰蛋白胨4-6g，玉米粉15-25g，大豆粉15-25g，麦麸15-25g，Na₂HPO₄1.5-2.5g，NaH₂PO₄0.15-0.25g，MgSO₄0.2-0.4g，ZnSO₄0.4-0.6g，CaCO₃1.5-2.5g，泡敌0.08-0.12g，用水定容至1000mL。

在上述发酵培养方法中，接种比例为58％，培养条件优选为：在28-32℃、pH为7.2-7.5下通气培养，通气量为26-53mM O₂L^-1h^-1。

优选的成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655三角瓶、种子罐专用培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，蔗糖15g，NaCl 10g，用水定容全1000mL。

优选的成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655发酵罐专用培养基配方为：蔗糖10g，胰蛋白胨5g，玉米粉20g，大豆粉20g，麦麸20g，Na₂HPO₄2g，NaH₂PO₄0.2g，MgSO₄0.3g，ZnSO₄0.5g，CaCO₃2g，泡敌0.1g，用水定容至1000mL。

此外，为获得更好的培养效果，在进行种子罐培养前可先进行三角瓶培养，具体方法为：将成团泛菌(Pan toea agglomerans)B501CGMCC No.1655接种到其三角瓶专用培养基中，在28-35℃、pH为7.0-8.0下培养24-48小时。

在三角瓶培养方法中，接种比例为5-8％，培养条件优选为：在28-32℃、pH为7.2-7.5下振荡培养，振速为100-250rpm。

本发明的另一个目的是提供一种成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCCNo.1655菌剂。

本发明所提供的成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655菌剂，其活性成分为成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655。

用上述发酵培养方法获得的发酵液可直接作为成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655菌剂使用，并可根据需要调整发酵条件，得到不同浓度的菌剂。将发酵液经低温(32-35℃)干燥后，可得到干粉剂型的成团泛菌(Pantoeaagglomerans)B501CGMCC No.1655菌剂。此外，在上述发酵液的基础上，再添加一种或多种添加剂，如几丁质，胶原蛋白和纤维素等，可得到适用于不同病害程度的菌剂；几丁质与菌剂的重量份数比为3-5∶1000，胶原蛋白与菌剂的重量份数比为5-7∶1000。

本发明的第四个目的是提供一种果蔬真菌病害的防治方法。

本发明所提供的果蔬真菌病害的防治方法，是采收前一周在果蔬表面喷施浓度为5×10⁸cfu mL^-1-1×10⁹cfu mL^-1的成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655菌剂，或将采摘后的果实浸泡于浓度为5×10⁸cfu mL^-1-1×10⁹cfu mL^-1的成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655菌剂中处理1-3分钟，可使果蔬真菌病害得到有效防治。

本发明提供了成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655。该菌及以该菌为活性成分的菌剂可用于防治果蔬真菌病害，并具有以下优点：1)抑菌谱较广，防病效果好。室内和田间试验结果表明，该菌及其菌剂对多种果蔬真菌病害均具有较好的抑制作用，包括由链格孢引起的枣果黑斑病，枣果、苹果和梨的灰霉病害、青霉病害、软腐病害及褐腐病害，柑桔的青绿霉病，苹果轮纹病，白菜软腐病以及番茄早疫病等；其中对枣果黑斑病的田间防病效果达62-78％；2)作用效率高，在低浓度(10⁷-10⁹cfu mL^-1)下即能有效抑制各种果蔬真菌病害的发生；3)该菌不产生抗生素，生物安全性高；4)发酵周期短，菌剂制备工艺简单，具有工业化生产的可能性。

本发明在果蔬真菌病害的防治中具有广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为成团泛菌B501的聚类分析树状图

图2为成团泛菌B501在枣果伤口上的生长动态图

图3为成团泛菌B501不同处理液对枣果链格孢的抑制效果检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为水。

实施例1、成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655的分离、鉴定及保藏

一、分离、筛选对病原物拮抗效果好的菌株

病原物：

链格孢，是从田间冬枣黑斑病果表面分离，经纯化后接种在PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖15g，琼胶15g，用水定容至1000mL)上，在28℃下培养10-14d后，借助血球计，用无菌水配成浓度约为1×10⁶孢子mL^-1的孢子悬浮液。

果实：

冬枣，采收于中国山东省沾化，预冷2d后装入PVC袋，于-2℃冰箱中冷藏。枣果硬度12.53kg/cm²，可溶性固形物含量为36.8％，总酸为1.2％。接种前，将冬枣用2％NaOCl消毒2min，经蒸馏水冲洗后风干。

1、菌株的分离

枣果面存在大量能够对枣果病原物产生抑制作用的微生物。现从冬枣表面及伤口处分离菌株，具体方法如下：

1)从冬枣表面分离

取10个冬枣，将其放在盛0.2M磷酸缓冲液容器中，在100rpm旋转振荡器中洗涤10min，丢弃洗液。再用相同方法进行二次清洗(二次清洗前，先对冬枣进行30秒超声处理)，保留洗液。然后对二次洗液进行连续稀释后，将稀释液涂布在Luria-Bertani(LB)固体培养基上，每皿0.1mL，在28℃下培养24-48h至长出单菌落，依据不同的菌落特征随机选取单菌落，在LB固体培养基上重复划线后，挑取纯化的单菌落与配制的链格孢孢子悬液在PDA平皿上做对峙试验，放弃有清晰抑菌带的菌落，保留的菌落进一步在冬枣上筛选。

2)从冬枣伤口处分离

取10个冬枣，将其浸泡在盛有150mL灭菌去离子水的三角瓶中，在100rpm旋转振荡器中清洗二次，保留两次洗液。挑取枣果，每果刺3mm×3mm伤口一个，每次处理三个果实。在每个伤口放一次和二次洗液各20μL，2h后接种20μL链格孢孢子悬浮液，在25℃下保湿培养7d后，观察冬枣上未显示病症的伤口，用灭菌接种针刮取表层，经连续稀释后，取此稀释液100μL涂在LB固体培养基上，在28℃下培养1d后，挑选具有不同形态特征的单一菌落，在LB平皿上划线，挑取纯化后的单菌落与配制的链格孢孢子悬液在PDA平皿上做对峙试验，放弃有抑菌带的菌落，保留的菌落进一步在冬枣上筛选。

最终从冬枣表面和伤口两条途径，共分离和筛选到9株不产生抗生素的细菌，依次编号为B101-B901。

2、在冬枣上筛选

挑取成熟度一致，无病，大小均匀的冬枣试材。经表面消毒后，每果刺3mm×3mm伤口一个，分别移入用步骤1从冬枣表面、伤口分离的9株细菌的菌落配成的悬浮液(1×10⁹cfu/mL)50μL，2h后接种20μL链格孢孢子悬浮液，在25℃下保湿培养7d后，统计果实的发病率和病斑直径，以灭菌水作为对照(Control)。每个分离菌株处理24个果，每组8个果。试验重复三次。统计结果如表1所示，试验菌株的发病率和病斑直径均显著低于对照(P＝0.05)，其中菌株B501和B701，分别比对照的发病率下降了87％和68％，与其它菌株的差异也达到显著的程度(P＝0.05)。然后扩大供试枣果群体量，对拮抗效果较好的B501和B701继续进行试验：每菌株接种40个果，每组8个果，分别培养5d、7d、9d后，统计冬枣的发病率和病斑直径，试验重复三次。统计结果如表2所示，B501和B701接种培养5d、7d时，发病率和病斑直径与对照相比，均显著低于对照(P＝0.05)，培养9d时，B501和B701的发病率比对照分别下降了86％和62％，且B501比B701的发病率和病斑直径均低，两者呈显著差异(P＝0.05)。选择对病原物拮抗效果最好的菌株B501，对其用下述方法进行鉴定。

表1B101-B901细菌菌株对采后枣果链格孢的抑制效果

注：同列相同字母表示邓肯氏多重差异范围检测差异不显著(P＝0.05)；表中数字为三次重复的平均值

表2细菌菌株B501和B701对采后枣果链格孢的抑制效果

二、菌株B501的鉴定及保藏

1、16S rDNA序列的同源性分析

以菌株B501的基因组DNA为模板，以63F(5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’)与1387R(5’-GGGCGGTGATGTACAAGGC-3’)为引物，PCR扩增其16S rDNA部分序列，PCR反应条件为：先94℃变性5min；然后94℃变性40S，55℃复性40S，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电脉检测，结果PCR扩增出大小约为1.3kb的片段。用试剂盒E.Z.N.A.(OmegaBio-tec，USA)对该片段进行回收及纯化后，将其连接入经限制性内切酶EcoRV酶切的克隆载体pBluescript SK II(+)(Stratagene)中，再将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia cpli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明所克隆的菌株B501的16S rDNA片段具有序列表中序列1的核苷酸序列。采用BLAST软件对该16S rDNA片段的核苷酸序列进行同源性比较，并应用DNAMAN(LynnonBiosoft)软件进行遗传距离分析，建立聚类分析树状图。通过BLAST比对和DNAMAN软件分析，菌株B501的16S rDNA序列与泛菌属(Genus Pantoea)的成团泛菌(Pantoeaagglomerans)，成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)，鸡血藤欧文氏菌(Erwiniamilletiae)，草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的遗传距离最近，同源性达到99％以上，因细菌的16S rDNA序列的同源性达到97％以上可以归为同种。因此，根据16S rDNA序列比对结果，将B501归入成团泛菌(Pantoea agglomerans)，其聚类分析树状图如图1所示。

2、生理生化特征分析

依据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》第九版对成团泛菌菌株B501进行生理生化特征分析，结果如下：

菌株B501是革兰氏阴性菌(0.5-0.8×1-3μm)，在LB培养基上划线后，经28℃培养1-2d后，可产生光滑、圆形、凸起的黄色菌落。D-甘露糖、D-木糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、蔗糖、乳糖、水扬甘、麦芽糖及海藻糖产酸为阳性；卫矛醇、间-肌醇(慢)、D-阿东醇、α-甲基-D-葡萄糖甘和D-山梨醇(慢)产酸为阴性。精氨酸脱酸酶、鸟氨酸脱酸酶、精氨酸双水解酶、苯丙氨酸脱氨酶、脲水解、氧化酶、吲哚产生、明胶液化、脂酶、D-葡萄糖产气、H₂S产生和KCN生长为阴性；运动性、七叶灵水解、丙二酸利用、柠檬酸盐及D-葡萄糖产酸为阳性。生长温度范围：3-42℃，最适生长温度：28-32℃；生长酸碱度范围：pH＝5-8.6，最适pH＝7.2-7.5。

综合上述菌株B501的16S rDNA序列分析和生理生化特征分析结果，将菌株B501鉴定为泛菌属(Genus Pantoea)的成团泛菌种(Pantoea agglomerans)。该菌株已于2006年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1655。

实施例2、成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655发酵培养及其菌剂制备

成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655三角瓶、种子罐专用液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，蔗糖15g，NaCl 10g，用水定容至1000mL。

成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655发酵罐专用液体培养基的配方为：蔗糖10g，胰蛋白胨5g，玉米粉20g，大豆粉20g，麦麸20g，Na₂HPO₄2g，NaH₂PO₄0.2g，MgSO₄0.3g，ZnSO₄0.5g，CaCO₃2g，泡敌0.1g，用水定容至1000mL。

1、菌种的活化

挑取成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655原种，将其接种在LB液体培养基中，在28℃下摇床培养1-2d。

2、三角瓶培养

将步骤1活化的成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655按5％比例接种于盛有三角瓶专用液体培养基的三角瓶中，在28℃、150rpm下培养24小时。

3、种子罐培养

取4L步骤2经三角瓶培养的菌液，接入100L种子罐中(含有50L种子罐专用液体培养基)进行种子培养，在30℃、pH为7.2下搅拌培养48小时，通气量为26-53mMO₂L^-1h^-1。

4、发酵罐培养

按6％比例将步骤2的种子液接入1000L发酵罐中(含有600L发酵罐专用液体培养基)进行发酵培养，在32℃、pH为7.5下搅拌培养72小时，通气量为26-53mM O₂L^-1h^-1。

所得发酵液可直接作为成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655菌剂使用，并可根据需要调整发酵条件，得到不同浓度的菌剂。将发酵液经低温(32-35℃)干燥后，得到干粉剂型的成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCCNo.1655菌剂。此外，在上述发酵液的基础上，再添加几丁质，胶原蛋白和纤维素中的一种或几种，得到适用于不同病害程度的菌剂；所述几丁质与菌剂的重量份数比为3-5∶1000，胶原蛋白与菌剂的重量份数比为5-7∶1000。

实施例3、成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655的生防效果检测

现以枣果黑斑病，苹果灰霉病、青霉病，梨果软腐病及柑桔的青绿霉病为例，检测成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655(以下简称成团泛菌B501)对植物病害的防治效果，具体检测方法如下：

一、检测成团泛菌B501对枣果黑斑病的抑制效果

1、检测成团泛菌B501在冬枣伤口上的生长动态

果实的许多病害是从伤口入侵，因此成团泛菌B501在冬枣伤口上的有效定殖能力，是决定其防治效果的必要条件。本试验设计四种处理：成团泛菌B501(1×10⁹cfum^-1)+链格孢(枣果黑斑病病原物，1×10⁶孢子mL^-1)；成团泛菌B501(1×10⁹cfu mL^-1)+扑海因(50μg mL^-1)(Bayer Crop Science，前期试验证明其能有效抑制枣果链格孢)；CaCl₂(2％)+成团泛菌B501(1×10⁹cfu mL^-1)；成团泛菌B501悬浮液(1×10⁹cfumL^-1)。枣果经表面消毒后，每果刺3mm×3mm伤口一个，于伤口处将以上四种处理液分别接种20μL，25℃下保湿培养，1h后测定的菌数设为起始值(0h)，每天测1次，共测6d。测定方法是用打孔器从伤口取直径和高都为5mm的果肉组织，置于已添加1mL 0.2M pH6.5的磷酸缓冲液的研钵内，研磨后用稀释平板法记数。每次处理3个果实，试验重复3次。将所得细菌cfu转化为Log10对数。

根据试验结果数据绘制成团泛菌B501在冬枣伤口上的生长动态图，如图2所示(A：链格孢+成团泛菌B501组；B：扑海因+成团泛菌B501组；C：CaCl₂+成团泛菌B501组；D：成团泛菌B501悬浮液组。小垂线代表标准误)，成团泛菌B501悬浮液，接种后呈现快速生长，72h是0h的21倍，表明成团泛菌B501在72h前已在冬枣伤口有效定殖。CaCl₂和链格孢的存在有助于成团泛菌B501群体数量的增加，接种48h后，成团泛菌B501的菌群数量分别是相应悬浮液的5.4倍和8.8倍，表明CaCl₂在前期有助于提高成团泛菌B501在伤口上的菌群数量，提高了成团泛菌B501的生防能力，链格孢加速成团泛菌B501的生长速度是由于营养和空间的竞争促进了成团泛菌B501以更快的速度繁殖。低浓度扑海因的存在，明显地抑制了成团泛菌B501在冬枣伤口上的种群数量，但也呈快速上升的趋势，在培养6d时，菌数达到了2.3×10⁷cfu mL^-1，表明成团泛菌B501在低浓度扑海因存在的情况下可以在冬枣伤口定殖，能与低浓度扑海因结合使用来防治冬枣黑斑病。

本试验结果表明成团泛菌B501在冬枣伤口上的生长趋势为：前期快速增长，后期略显平稳上升的态势。表明该菌在冬枣伤口上能有效定殖，具有防治病害的潜力。

2、成团泛菌B501和链格孢的接种时间对防治效果的影响

试验设三组，一组将成团泛菌B501在接种病原物6h，12h后接种，另一组将成团泛菌B501在接种病原物0h，6h，24h，48h前接种，对照组为只接种病原物组。成团泛菌B501的接种浓度为1×10⁹cfu mL^-1，病原物-链格孢的接种浓度为1×10⁶孢子mL^-1。接种后在25℃下保湿培养，7d后测定发病情况，每处理10个果实，试验重复三次。

发病率统计结果如表3所示，结果表明成团泛菌B501和链格孢的接种时间对防治效果影响很大。其中，1×10⁷cfu mL^-1和1×10⁹cfu mL^-1两种浓度的B501均存在先于病原物链格孢接种的抑病效果显著好于同时或置后接种的，尤其是接种B50124h后再接种链格孢，获得的抑病效果最好，与对照和其它接种时间的抑病效果差异显著(P＝0.05)。

表3成团泛菌B501不同接种时间的抑病效果

3、成团泛菌B501不同接种浓度的生防效果

配制浓度分别为0(对照)、1×10⁵cfu mL^-1，1×10⁷cfu mL^-1和1×10⁹cfu mL^-1的成团泛菌B501悬浮液，枣果经表面消毒后，每果刺3mm×3mm伤口一个，于伤口处将以上四种浓度的成团泛菌B501悬浮液分别接种50μL，2h后再分别接种1×10⁴孢子mL^-1、1×10⁵孢子mL^-1及1×10⁶孢子mL^-1的链格孢孢子悬浮液20μL，将上述经处理的果实于25℃下保湿，7d后统计发病率。每处理10个果实，该试验重复三次。

发病率统计结果如表4所示，结果表明成团泛菌B501与病原物的不同接种浓度明显地影响抑病的效果。接种成团泛菌B501的冬枣伤口，其发病率显著低于对照(P＝0.05)。当病原物浓度为1×10⁴孢子mL^-1时，1×10⁵cfu mL^-1和1×10⁷cfu mL^-1成团泛菌B501接种浓度组的发病率低且两者无明显差异(P＝0.05)，1×10⁹cfu mL^-1成团泛菌B501接种浓度组无病斑出现。当病原物浓度为1×10⁵孢子mL^-1时，1×10⁷cfumL^-1与1×10⁹cfu mL^-1成团泛菌B501接种浓度组的发病率差异不显著(P＝0.05)，两者均显著地低于1×10⁵cfu mL^-1成团泛菌B501接种浓度组的发病率(P＝0.05)。当病原物浓度为1×10⁶孢子mL^-1时，1×10⁵cfu mL^-1，1×10⁷cfu mL^-1与1×10⁹cfu mL^-1成团泛菌B501接种浓度组的发病率相互间均呈显著差异，分别比对照下降了71％，80％及89％。成团泛菌B501三种浓度(1×10⁵cfu mL^-1，1×10⁷cfu mL^-1与1×10⁹cfumL^-1)接种组的发病率均未超过30％，表明成团泛菌B501对枣果黑斑病的抑病效果显著。

表4成团泛菌B501的不同接种浓度对枣果链格孢的抑制效果

注：同行相同字母表示邓肯氏多重差异范围检测差异不显著(P＝0.05)；表中数字为三次重复的平均值

4、成团泛菌B501菌剂对枣果黑斑病的田间防治效果

取用实施例2方法制备的浓度分别为5×10⁸cfu mL^-1和1×10⁹cfu mL^-1的成团泛菌B501菌剂。果实采摘前一周分别喷洒上述两种浓度的成团泛菌B501菌剂，每种浓度的菌剂喷洒5棵树，采果后室温贮藏，统计发病情况。结果上述二种不同浓度的成团泛菌B501菌剂对由链格孢引起的黑斑病都有较好的防治效果，且浓度越高防病效果越好，防效达62％78％。

5、成团泛菌B501菌剂对采后枣果黑斑病的防治效果

取用实施例2方法制备的成团泛菌B501干粉型菌剂，配制成浓度分别为(5×10⁸cfu mL^-1和1×10⁹cfu mL^-1)的菌悬液。枣果采摘后，将果实浸于上述不同浓度的成团泛菌B501菌液中3分钟，室温贮藏，统计发病情况。结果经成团泛菌B501菌剂处理后，果实具有较好的黑斑病防治效果，浓度越高防病效果越好，防效达65％-83％。

二、检测成团泛菌B501对采后苹果青霉病和灰霉病的抑制效果

配制浓度分别为0(对照)、5×10⁷cfu mL^-1，1×10⁸cfu mL^-1和1×10⁹cfu mL^-1的成团泛菌B501悬浮液，果实经表面消毒后，每果刺3mm×3mm伤口一个，于伤口处将以上四种浓度的成团泛菌B501悬浮液分别接种50μL，2h后再分别接种1×10³孢子mL^-1、1×10⁴孢子mL^-1及1×10⁵孢子mL^-1的青霉病菌及灰霉病菌孢子悬浮液20μL，将上述经处理的果实于25℃下保湿，7d后统计发病率。每处理10个果实，该试验重复三次。

接种青霉病菌孢子和灰霉病菌孢子后的发病率统计结果分别如表5、表6所示，在苹果伤口上接种低浓度(1×10³孢子mL^-1)青霉病菌时，只有在1×10⁹cfu mL^-1成团泛菌B501的接种浓度下，发病率才控制在10％。而灰霉病菌在此低浓度(1×10³孢子mL^-1)接种时，在5×10⁷，1×10⁸，1×10⁹cfu mL^-1三种成团泛菌B501接种浓度下的发病率均低于10％。当成团泛菌B501的接种浓度为1×10⁹cfu mL^-1，病原物为1×10³，1×10⁴，1×10⁵孢子mL^-1三种不同浓度时，青霉病的抑制效果分别为90％、64％、44％，对灰霉病的抑制效果分别为100％、77％、58％。上述结果表明在室温下，成团泛菌B501可有效地抑制采后苹果青霉病和灰霉病的发生，且成团泛菌B501对灰霉病的抑制效果好于青霉病。

表5成团泛菌B501对采后苹果青霉病的抑制效果

表6成团泛菌B501对采后苹果灰霉病的抑制效果

三、检测成团泛菌B501对采后梨果软腐病的抑制效果

配制浓度分别为0(对照)、5×10⁷cfu mL^-1，1×10⁸cfu mL^-1和1×10⁹cfu mL^-1的成团泛菌B501悬浮液，果实经表面消毒后，每果刺3mm×3mm伤口一个，于伤口处分别将以上四种浓度的成团泛菌B501悬浮液接种50μL，2h后再分别接种1×10³孢子mL^-1、1×10⁴孢子mL^-1及1×10⁵孢子mL^-1的软腐病菌孢子悬浮液20μL，将上述经处理的果实于25℃下保湿，7d后统计发病率。每处理10个果实，该试验重复三次。

发病率统计结果分别如表7所示，当成团泛菌B501以高浓度1×10⁹cfu mL^-1使用，而病原物在1×10³，1×10⁴，1×10⁵孢子mL^-1三种不同浓度下，软腐病的抑制效果分别为98％、87％、72％。表明成团泛菌B501可以有效抑制梨果软腐病。

表7成团泛菌B501对采后梨果软腐病的抑制效果

四、检测成团泛菌B501对柑桔青绿霉病的抑制效果

配制浓度分别为0(对照)、5×10⁷cfu mL^-1，1×10⁸cfu mL^-1和1×10⁹cfu mL^-1的成团泛菌B501悬浮液，果实经表面消毒后，每果刺3mm×3mm伤口一个，于伤口处将以上四种浓度的成团泛菌B501悬浮液分别接种50μL，2h后再分别接种1×10³孢子mL^-1、1×10⁴孢子mL^-1及1×10⁵孢子mL^-1的青绿霉病致病菌P.italicum和P.digitatum的孢子悬浮液20μL，将上述经处理的果实于25℃下保湿，7d后统计发病率。每处理10个果实，该试验重复三次。

结果1×10⁸cfu mL^-1浓度的成团泛菌B501能显著抑制由致病菌P.italicum(1×10⁵孢子mL^-1)和P.digitatum(1×10⁵孢子mL^-1)引发的柑桔青绿霉病的发生，发病率比对照分别下降了67％和85％。当成团泛菌B501的浓度提高为1×10⁹cfu mL^-1时，由P.italicum(1×10⁵孢子mL^-1)和P.digitum(1×10⁵孢子mL^-1)引起的青绿霉病的发病率分别比对照下降了75％和92％。表明成团泛菌B501可以有效抑制柑桔青绿霉病的发生。

实施例4、检测成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655的活细胞及其代谢物对冬枣黑斑病的影响

该实验采用如下四种成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655的处理液：

培养原液(A)：用血球计数板配成1×10⁹cfu mL^-1浓度；

滤液(B)：将培养原液用0.2μm滤膜过滤，收集滤液；

悬浮液(C)：将培养原液在12000rpm下离心5min，弃上清，加入无菌水，混匀后重复离心，弃上清，再加入无菌水，配成1×10⁹cfu mL^-1浓度的悬浮液；

热杀死液(D)：将培养原液在121℃下高压灭菌20min。

将上述四种处理液分别取50μL接种于冬枣伤口(3mm×3mm)，以灭菌水为对照，2h后再分别接种20μL 1×10⁶孢子mL^-1的链格孢孢子悬浮液，保湿于25℃下，7d后统计发病情况，该试验重复三次。

发病率统计结果如图3所示(A：原液；B：过滤液；C：悬浮液；D：热杀死液；对照：灭菌水。小垂线代表标准误)，浓度为1×10⁹cfu mL^-1的成团泛菌(Pantoeaagglomerans)B501CGMCC No.1655悬浮液对冬枣链格孢的抑制效果好于原液，两者的发病率呈显著差异(P＝0.05)。而滤液和灭菌液与对照一样，发病率均达到100％。该结果与成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501CGMCC No.1655在平皿上不产生抗生素的结果一致，表明成团泛菌(Pantoea afgglomerans)B501CGMCC No.1655的生防效果取决于活细胞而不是它的代谢产物，具有较高的安全性。

序列表

<160>1

<210>1

<211>1323

<212>DNA

<213>成团泛菌(Pantoea agglomerans)

<400>1

ggacggtagc acagaggagc ttgctccttg ggtgacgagt ggcggacggg tgagtaatgt 60

ctggggatct gcccgataga gggggataac cactggaaac ggtggctaat accgcataac 120

gtcgcaagac caaagagggg gaccttcggg cctctcacta tcggatgaac ccagatggga 180

ttagctagta ggcggggtaa tggcccacct aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga 240

tgaccagcca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300

atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca gccatgccgc gtgtatgaag aaggccttcg 360

ggttgtaaag tactttcagc ggggaggaag gcgatggggt taataaccct gtcgattgac 420

gttacccgca gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt 480

gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcatgca ggcggtctgt taagtcagat 540

gtgaaatccc cgggcttaac ctgggaactg catttgaaac tggcaggctt gagtcttgta 600

gaggggggta gaattccagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctggag gaataccggt 660

ggcgaaggcg gccccctgga caaagactga cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 720

aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gacttggagg ttgttccctt 780

gaggagtggc ttccggagct aacgcgttaa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 840

ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900

atgcaacgcg aagaacctta cctactcttg acatccagcg aacttagcag agatgctttg 960

gtgccttcgg gaacgctgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat 1020

gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatccttt gttgccagcg attcggtcgg 1080

gaactcaaag gagactgccg gtgataaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1140

atggccctta cgagtagggc tacacacgtg ctacaatggc gcatacaaag agaagcgacc 1200

tcgcgagagc aagcggacct cacaaagtgc gtcgtagtcc ggatcggagt ctgcaactcg 1260

actccgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tggatcagaa tgccacggtg aatacgttcc 1320

cgg 1323

Claims

1.成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCC No.1655。

2.一种发酵培养成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCC No.1655的方法，包括以下步骤：

1)菌种的活化：挑取成团泛菌B501原种，将其接种在LB液体培养基中，在28℃下摇床培养1-2d；

2)三角瓶培养：将经活化的成团泛菌B501接种到三角瓶、种子罐专用培养基中，在28-35℃、pH 7.0-8.0的条件下培养24-48小时，得到三角瓶培养菌液；所述三角瓶、种子罐专用培养基配方为：胰蛋白胨8-12g，酵母提取物4-6g，蔗糖10-20g，NaCl 8-12g，用水定容至1000mL；

3)种子罐培养：将三角瓶培养菌液接种到三角瓶、种子罐专用培养基中，在28-35℃、pH 7.0-8.0的条件下培养24-48小时，得到种子液；

4)发酵罐培养：将种子液接种到发酵罐专用培养基中，在28-35℃、pH7.0-8.0的条件下培养48-96小时；所述发酵罐专用培养基的配方为：蔗糖8-12g，胰蛋白胨4-6g，玉米粉15-25g，大豆粉15-25g，麦麸15-25g，Na₂HPO₄ 1.5-2.5g，NaH₂PO₄0.15-0.25g，MgSO₄ 0.2-0.4g，ZnSO₄ 0.4-0.6g，CaCO₃ 1.5-2.5g，泡敌0.08-0.12g，用水定容至1000mL。

3.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于：所述步骤3)和步骤4)中成团泛菌B501及其种子液的接种比例为5-8％，培养条件为：在28-32℃、pH 7.2-7.5条件下通气培养，通气量为26-53mM O₂L^-1h^-1。

4.根据权利要求2或3所述的发酵培养方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤3)中的成团泛菌B501三角瓶、种子罐专用培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，蔗糖15g，NaCl 10g，用水定容至1000mL；步骤4)中的成团泛菌B501发酵罐专用培养基配方为：蔗糖10g，胰蛋白胨5g，玉米粉20g，大豆粉20g，麦麸20g，Na₂HPO₄ 2g，NaH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄ 0.3g，ZnSO₄ 0.5g，CaCO₃ 2g，泡敌0.1g，用水定容至1000mL。

5.以成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCC No.1655为活性成分的菌剂。

6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中含有几丁质，胶原蛋白和纤维素中的一种或几种；所述几丁质与菌剂的重量份数比为3-5∶1000，胶原蛋白与菌剂的重量份数比为5-7∶1000。

7.权利要求1所述的成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCC No.1655菌在防治果蔬真菌病害中的应用。

8.权利要求5所述的成团泛菌(Pantoea agglomerans)B501 CGMCC No.1655菌剂在防治果蔬真菌病害中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：采收前在果蔬表面喷施浓度为5×10⁸cfu mL^-1和1×10⁹cfumL^-1的成团泛菌B501菌剂，或将采摘后的果实浸泡于浓度为5×10⁸cfumL^-1和1×10⁹cfumL^-1的成团泛菌B501菌剂中处理1-3分钟。