CN110468053B - 一种毡状地丝霉菌菌株及其在生物防治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种毡状地丝霉菌菌株及其在生物防治中的应用。所述菌株的菌种保藏号为CGMCC NO.13700。本发明还提供包含所述菌株的菌种制剂或包含所述菌株培养物的生物防治制剂。本发明还提供了所述菌株在抑制大丽轮枝菌等病原菌引起的病害或者造成的污染中的应用。采用本发明菌株对例如由大丽轮枝菌引起的黄栌枯萎病进行生物防治，可以有效降低黄栌枯萎病的发病率，抑菌率达到25％以上。

Description

一种毡状地丝霉菌菌株及其在生物防治中的应用
技术领域
本发明涉及园林植物土传病害防治领域，尤其是涉及一种毡状地丝霉菌菌株及其在生物防治中的应用。
背景技术
黄栌(Cotinus coggygria)作为北京香山公园的主要红叶树种，在红叶文化的传承中具有不可替代的作用。自上世纪80年代以来，北京香山公园的黄栌林因枯萎病出现了大面积枯死现象，每年枯死的黄栌一度达到数千株，是北京城市园林生态系统建设中函待解决的难题之一(宋立洲，杜万光，李维维.香山公园黄栌枯萎病防治技术研究[J].北京园林，2011，27(2):51-56；葛雨萱，周肖红，刘洋，王亮生.黄栌属种质资源、栽培繁殖、化学成分、叶色调控研究进展.园艺学报，2014，41(9)：1833-1845.)。
该病害是由大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)引起的系统性侵染病害，其病原菌具有广泛的寄主范围，在土壤和植物体内广泛分布，可侵染40科660种以上植物，包括农作物类、蔬菜类、水果类、观赏花卉类、纤维及油料作物和各种木本植物等，利用化学杀菌剂对其彻底清除是难以实现的，而且过量化学农药的使用对土壤微生态环境造成严重破坏，使植株长势衰弱，从而更加重了病害发生的严重度。目前对该病害的具体的防治措施主要集中在以下几个方面：(1)强调预防为主，严格控制病害扩散，强化检疫监督，严格控制带病苗木和土壤进入无病区。(2)物理防治方面，常采取土壤日晒法与生物土壤熏蒸法两种措施，但这两种物理防治方法见效缓慢。(3)化学防治中常使用溴甲烷、三氯硝基甲烷、甲基异硫氰酸酯等进行土壤熏蒸，或用植物生长调节剂缓解症状，或用苯并咪唑、苯菌灵、甲基托布津等直接注射入枝干防治(李伦光.土壤因子对黄栌枯萎病发生的影响及病害防治的初步研究[D].北京：北京林业大学，2008)。通过药剂筛选试验，韩婧等人证实萎菌净300倍和多菌灵400倍液对黄栌枯萎病的防治效果最佳(韩婧.香山黄栌枯萎病综合防治研究[D].北京：北京林业大学，2009)。然而伴随使用化学农药带来的环境污染、农药残留等严重后果，其施用力度逐渐引起争议。(4)应用拮抗菌进行生物防治为黄栌枯萎病的综合防控带来新的希望(葛瑾，颜蓉，宋立洲，等.黄栌枯萎病的综合防治策略[J].中国城市林业，2007，5(3):43-44；王建美.黄栌枯萎病病原菌及致病机理研究[D].北京：北京林业大学，2009)，但是目前拮抗菌筛选主要集中在农作物方面，而针对林木枯萎病的拮抗菌筛选则报道较少(王研.黄栌与大丽轮枝菌互作过程及病原菌定量研究[D].北京：北京林业大学，2012)。
本发明人意外分离到了一种菌株，经鉴定，发现该菌株属于毡状地丝霉菌的变异株，并且经过试验发现，该菌株对包括大丽轮枝菌在内的众多微生物具有显著的抑制作用，于是完成了本发明。
发明内容
(一)要解决的技术问题
目前对由例如大丽轮枝菌等真菌引起的病害或造成的污染采用的物理防治手段存在见效慢、化学防治措施污染大等问题，而且没有对这些真菌引起的病害或污染有效的生物防治方法。
(二)技术方案
为了解决上述问题，本发明在第一方面提供了一种毡状地丝霉菌菌株，所述菌株的菌种保藏号为CGMCC NO.13700。
本发明在第二方面提供了一种菌种制剂，所述菌种菌剂包含具有活力的本发明第一方面所述的菌株。
本发明第三方面提供了一种生物防治菌剂，所述生物防治菌剂包含由本发明第一方面所述的菌株培养得到的培养物。
本发明在第四方面提供了根据本发明第一方面所述的菌株在生物防治中的应用。
本发明在第五方面提供了一种分离本发明第一方面所述的菌株的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基的配制与制板：取去皮的新鲜马铃薯200g，加水1000ml煮沸20min，双层纱布过滤后加入葡萄糖15g，琼脂8g，补充适量的水至1000ml，充分摇匀后装入三角瓶中，121℃灭菌30min，倒入灭菌培养皿中制成平板；
(2)菌株分离：将培养皿盖打开以暴露出平板，在空气中静置30min，然后盖上培养皿盖，20℃条件下培养，待不同单菌落长出后，转接到PDA固体培养基平板上继续培养成纯菌株；
(3)菌株鉴定
提取所述纯菌株的DNA，然后以所得DNA为模板，使用序列如SEQ ID NO.1所示的通用引物ITS1和序列如SEQ ID NO.2所示的通用引物ITS4进行PCR扩增，得到扩增产物并测序，确认该序列与SEQ ID NO.3所示AP序列相似度达到90％以上，优选达到95％以上，更优选达到99％以上，最优选达到100％，确认所得菌株为权利要求1所述的菌株。
(三)有益效果
本发明人从冬季空气中意外地分离得到的一种真菌菌株，编号为IVD-2。经过鉴定，IVD-2菌株为毡状地丝霉菌株的变种。试验发现，该菌株对大丽轮枝菌(Verticilliumdahlia)的生长具有很强的抑制作用，抑菌率达到50％以上。利用该菌株制备生防菌粉剂或悬浮剂，在春季黄栌移栽时拌土使用时，能够有效降低黄栌枯萎病的发病率。而且，该菌株对月季黑斑病菌(Marssonina rosae)也具有极强的抑制效果，也可以用来对由月季黑斑病菌引起的病害或造成的污染进行生物防治。
附图说明
图1为IVD-2在PDA固体培养基上培养12天的菌落形态。
图2为光学显微镜下(400X)IVD-2的分生孢子梗和分生孢子形态。
图3为扫描电子显微镜下(4100X)IVD-2的分生孢子梗和分生孢子形态。
图4为利用真菌rDNA ITS通用引物对IVD-2扩增出的566bp的电泳条带。图中，M：核酸分子量D2000；1-10：IVD-2；11：阴性对照(双蒸水)。
图5为依据IVD-2的rDNA ITS1-5.8S-ITS2区域碱基序列构建的IVD-2系统进化树。
图6为黄栌枯萎病菌与IVD-2对峙培养50天的菌落形态(左面为黄栌枯萎病菌，右面为IVD-2)。
图7为黄栌枯萎病菌在PDA固体培养基上培养20天的菌落形态。
图8为黄栌枯萎病菌在PDA固体培养基+IVD-2无菌发酵液平板上培养20天的菌落形态。
图9为月季黑斑病菌在PDA固体培养基上培养15天的菌落形态。
图10为月季黑斑病菌PDA固体培养基+IVD-2无菌发酵液平板上培养15天的菌落形态。
图11为尖孢镰刀菌在PDA固体培养基上培养15天的菌落形态。
图12为尖孢镰刀菌在PDA固体培养基+IVD-2含菌发酵液平板上上培养15天的菌落形态。
图13为葡萄座腔菌与IVD-2对峙培养6天的菌落形态(左面为葡萄座腔菌，右面为IVD-2)。
图14为立枯丝核菌与IVD-2对峙培养6天的菌落形态(左面为立枯丝核菌，右面为IVD-2)。
图15为柳树腐烂病菌与IVD-2对峙培养6天的菌落形态(左面为柳树腐烂病菌，右面为IVD-2)
图16为杨树腐烂病菌与IVD-2对峙培养6天的菌落形态(左面为杨树腐烂病菌，右面为IVD-2)
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明人在冬季时从空气中意外地分离得到的一种真菌菌株(编号为IVD-2)。经过试验发现，该菌株对大丽轮枝菌的生长具有很强的抑制作用，抑菌率达到50％以上。利用该菌株制备生防菌粉剂或悬浮剂，在春季黄栌移栽时拌土使用时，能够有效降低黄栌枯萎病的发病率。而且，该菌株对月季黑斑病菌(拉丁文)也具有极强的抑制效果，也可以用来对由月季黑斑病菌引起的病害或造成的污染进行生物防治。
经过鉴定，发现该菌株为毡状地丝霉菌株的变种。由于地丝霉属真菌在真菌中所占比例很小，种类不多。因此，本发明人分离得到的对包括大丽轮枝菌和月季黑斑病菌具有显著抑制效果的上述菌株极其珍贵。目前该菌株已经于2017年3月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.13700，分类命名为Pseudogymnoascuspannorum。
于是，本发明在第一方面提供了一种毡状地丝霉菌菌株，所述菌株的菌种保藏号为CGMCC NO.13700。
本发明在第二方面提供了一种菌种制剂，所述菌种菌剂包含具有活力的本发明第一方面所述的菌株。
本发明第三方面提供了一种生物防治菌剂，所述生物防治菌剂包含由本发明第一方面所述的菌株培养得到的培养物。
在一些优选的实施方式中，所述生物防治菌剂为悬浮剂，并且所述培养物为发酵液。优选的是，所述发酵液通过如下方式获得：将所述菌株接种于马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基(取去皮的新鲜马铃薯200g，加水1000ml煮沸20min，双层纱布过滤后加入葡萄糖15g，补充适量的水至1000ml，充分摇匀后装入三角瓶中，121℃灭菌30min，全文同)中，20℃振荡培养后7天，将菌丝过滤后获得所述发酵液。另外优选的是，在接种到PD液体培养基之前还包括将所述菌株移植于PDA培养基(配方见实施例1，全文同)平板上进行活化的步骤。
在一些优选的实施方式中，所述生物防治菌剂还包含助剂和稳定剂。本发明对所述助剂没有特别的限制，但是优选的是，所述助剂选自由聚乙二醇(PEG)8000、聚乙烯醇(PVA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、茶皂素和阿拉伯树胶组成的组。本发明对所述稳定剂没有特别的限制，但是优选的是，所述稳定剂选自由碳酸钙、磷酸钾、磷酸氢二钾和羟甲基纤维素钠组成的组。
在一些实施方式中，所述生物防治菌剂为粉剂，并且所述培养物为固体培养物。优选的是，所述固体培养物通过如下方式获得：将所述菌株接种于固体培养基例如麦麸上，20℃暗培养15天后得到固体培养物，然后将固体培养物粉碎加工(粒径300-2500μm)，得到所述粉剂。
本发明在第四方面提供了根据本发明第一方面所述的菌株在生物防治中的应用。
本发明在第五方面提供了对本发明第一方面所述的菌株进行分离的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的配制与制板：取去皮的新鲜马铃薯200g，加水1000ml煮沸20min，双层纱布过滤后加入葡萄糖15g，琼脂8g，补充适量的水至1000ml，充分摇匀后装入三角瓶中，121℃灭菌30min，倒入灭菌培养皿中制成平板；
(2)菌株分离：将培养皿盖打开以暴露出平板，在空气中静置30min，然后盖上培养皿盖，20℃条件下培养，待不同单菌落长出后，转接到PDA固体培养基平板上继续培养成纯菌株。
(3)菌株鉴定
提取所述纯菌株的DNA，然后以所得DNA为模板，使用序列如SEQ ID NO.1所示的通用引物ITS1和序列如SEQ ID NO.2所示的通用引物ITS4进行PCR扩增，得到扩增产物并测序，确认该序列与SEQ ID NO.3所示序列(AP)相似度达到90％以上，优选达到95％以上，更优选达到99％以上，最优选达到100％，确认所得菌株为权利要求1所述的菌株。
实施例
下文将通过实施例的形式对本发明进行进一步说明。但是，这些实施例仅为举例说明目的。本发明的保护范围并不限于这些实施例。
实施例1：IVD-2的分离纯化与鉴定
(1)马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的配制
取去皮的新鲜马铃薯200g，加水1000ml煮沸20min，双层纱布过滤后加入葡萄糖15g，琼脂8g，补充适量的水至1000ml，充分摇匀后装入三角瓶中，121℃灭菌30min，倒入灭菌培养皿中制成平板。
(2)IVD-2的分离纯化
将PDA固体培养基平板的培养皿盖打开，在空气中静置30min，然后盖上培养皿盖，在20℃条件下培养，待不同的单菌落长出后，转接到铺有灭菌玻璃纸的新PDA平板上继续培养成纯菌落。
(3)IVD-2的鉴定
(a)形态学鉴定：在PDA固体培养基平板上，25℃培养11天，菌落直径达43mm，初为白色，后变灰白到浅黄色，毡状，气生菌丝常具有离散的簇，中央厚达2mm高，有时有放射状的脊，边缘局限，规则；背面淡红褐色，中心略带红褐色到黑褐色(如图1)。菌丝透明，分隔，表面光滑，宽1.2至3μm；分生孢子梗轮状分枝，顶生分生孢子具瘤，倒卵形，近球形，楔形或梨形，大小3.6至4.2μm×1.8至2.4μm，无厚垣孢子(参见图2和图3)。有性型未知。生长温度最低4℃，最适20℃，最高30℃，35℃以上不能生长。
(a)遗传学鉴定
利用步骤(2)分离得到的纯菌株提取DNA，采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工)提取菌株的DNA，采用rDNA ITS通用引物ITS1(序列如SEQ ID NO.1所示)和ITS4(序列如SEQ ID NO.2所示)进行rDNA ITS序列的PCR扩增，得了566bp的PCR产物(参见图4以及SEQ ID NO.1-3)，再利用T-载体PCR产物克隆试剂盒(上海生工)将得到的PCR产物连接至T载体，然后进行热激转化，挑取阳性克隆进行测序，获得菌株的rDNA ITS序列，在www.ncbi.nlm.nlh.gov数据库中进行BLAST比对，确定所分离到的菌株IVD-2属于毡状地丝霉菌(Geomyces pannorum)，但实验中未发现其有性阶段。利用MEGA软件中的Neighbor-joining Tree作进化树分析，结果表明IVD-2与毡状地丝霉菌(Geomyces pannorum)具有较近的亲缘关系(参见图5)，确认为所得菌株为毡状地丝霉菌的一个变种。
表1.ITS1、ITS4和扩增产物AP的序列。
Figure BDA0001661274430000081
实施例2：IVD-2的温度适应性试验
在培养15天的PDA固体培养基平板上用打孔器取直径为0.5cm的IVD-2菌株的菌丝块，接种于PDA固体培养基上，置于7个预先设定好温度的培养箱中培养，设7个温度处理：4℃、11℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃，每个处理重复3次，并用垂直十字法测量菌落大小，每7天测量1次，连续测量5次，记录数据，由此确定IVD-2的最适培养温度。结果发现，该菌株能够生长的最低温度为4℃，最适温度为20℃，能够生长的最高温度30℃，超过35℃后基本不能生长。
实施例3：IVD-2与黄栌枯萎病菌的对峙培养试验
在培养15天的PDA固体培养基平板上用打孔器取直径为0.5cm的IVD-2菌株和黄栌枯萎病菌株CCW2-4-2的菌丝块，同时接种于PDA固体培养基上，每个平板上各接种1块，二者相距3cm，置于20℃培养箱中培养，用垂直十字法测量黄栌枯萎病菌株的菌落大小，每7天测量1次，连续测量5次，记录数据，由此确定IVD-2对黄栌枯萎病菌的抑制作用。结果发现，IVD-2与黄栌枯萎病菌在PDA固体培养基上对峙培养时形成明显的抑菌圈，直径超过4cm，在IVD-2菌落周围黄栌枯萎病菌不能生长(图6)。
实施例4：IVD-2发酵液与黄栌枯萎病菌的共培养试验
将IVD-2在PD液体培养基中20℃200rpm振荡培养10天，发酵液经0.22μm细菌滤器过滤，获得无菌发酵液，与PDA培养基1：1混匀后制作平板，然后接种黄栌枯萎病菌，以不加无菌滤液的PDA平板为对照(图7)。结果表明IVD-2无菌发酵液对黄栌枯萎病菌有显著的抑制作用(图8)，与对照相比，培养20d时抑菌率为70.90％。
实施例5：IVD-2发酵液与月季黑斑病菌的共培养试验
将IVD-2在PD液体培养基中20℃200rpm振荡培养10天，发酵液经0.22μm细菌滤器过滤，获得无菌发酵液，与PDA培养基1：1混匀后制作平板，然后接种月季黑斑病菌，以不加无菌滤液的PDA固体培养基平板为对照(图9)。结果表明，在含IVD-2无菌发酵液的PDA固体培养基平板上黄栌枯萎病菌完全不能生长(图10)，与对照相比，培养15d时抑菌率为100％。
实施例6：IVD-2发酵液与尖孢镰刀菌的共培养试验
使用与实施例4基本相同的方法进行，不同之处在于，使用尖孢镰刀菌代替黄栌枯萎病菌。结果发现，与不添加IVD-2的发酵液的对照(图11)相比，IVD-2对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)没有明显抑制作用(图12)。
实施例7：与葡萄座腔菌、立枯丝核菌、柳树腐烂病菌和杨树腐烂病菌的对峙培养试验
采用与实施例3基本相同的方式进行，不同之处在于，分别使用与葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)(图13)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(图14)、柳树腐烂病菌(Valsa sordida)(图15)和杨树腐烂病菌(Valsa sordida)(图16)代替黄栌枯萎病菌。结果发现，进行上述对峙培养时均没有形成明显的抑菌圈，表明IVD-2对这四种病原菌没有抑制作用。
实施例8：IVD-2生物防治菌剂的制备(悬浮剂)
将保藏的IVD-2菌种移植于PDA平板上进行活化，将活化后菌株的接种到PD液体培养基中，20℃振荡培养后7天，将菌丝过滤后获得含孢子和培养滤液的发酵液，每100mL发酵液添加10g聚乙烯醇(PVA)作为助剂和2g羟甲基纤维素钠作为稳定剂，制备成悬浮剂。
实施例9：IVD-2生物防治菌剂的制备(粉剂)
将IVD-2菌种接种在灭菌麦麸上，20℃暗培养15天后，将发酵物粉碎加工(粒径300-2500μm)，制备成粉剂。
实施例10：IVD-2生物防治菌剂悬浮剂的使用
取IVD-2生物防治菌剂悬浮剂，用水稀释成孢子浓度为200个/mL的药液，于3月黄栌移栽时灌于根际，每树穴用量10L，以清水为对照。第二年6月份调查黄栌枯萎病的发病率和严重度，并计算病情指数。
(1)发病率：以整株为单位，调查一定株数的发病株数，计算发病率。
发病率＝发病株数/调查总株数×100％
(2)严重度：以整株为单位，按以下分级标准调查病害发生的等级。
表2.病害严重度分级标准
Figure BDA0001661274430000101
Figure BDA0001661274430000111
(3)病情指数：
病情指数＝各级病株数乘相应级数之和/调查总株数×最高级数×100％
结果表明，与对照相比，施用IVD-2生物防治菌剂悬浮剂后，黄栌枯萎病的病情指数可降低25％。
实施例11：IVD-2生物防治菌剂粉剂的使用
取IVD-2生物防治菌剂粉剂，于3月黄栌栽植时，均匀撒施于根际，每树穴用量250g，然后覆土。以不施用生防菌剂的处理为对照，第二年6月份调查黄栌枯萎病的发病率和严重度，并计算病情指数。
(1)发病率：以整株为单位，调查一定株数的发病株数，计算发病率。
发病率＝发病株数/调查总株数×100％
(2)严重度：以整株为单位，按表2所示的分级标准调查病害发生的等级。
(3)病情指数：
病情指数＝各级病株数乘相应级数之和/调查总株数×最高级数×100％
结果表明，与对照相比，栽植时根际施用IVD-2生物防治菌剂粉剂1年后，黄栌枯萎病的病情指数可降低28％。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 北京市园林科学研究院
<120> 一种毡状地丝霉菌菌株及其在生物防治中的应用
<130> GY17100350
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gcatatcaat aagcggagga 20
<210> 3
<211> 566
<212> DNA
<213> 毡状地丝霉菌（Geomyces pannorum）
<400> 3
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta cagtagtcgc ccgggttgcc gcaaggcctc 60
ccgggtaacc taccaccctt tgtttattac actttgttgc tttggcaggc ctgccctcgg 120
gctgctggct ccggccggcg agcgcctgcc agaggaccta aactctgttt gtctatactg 180
tctgagtact atataatagt taaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat 240
gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat 300
ctttgaacgc acattgcgcc ccctggtatt ccggggggca tgcctgtccg agcgtcatta 360
caaccctcaa gctcagcttg gtgttgggcc ccgccgcccc ggcgggccct aaagtcagtg 420
gcggtgccgt ccggctccga gcgtagtaat tcttctcgct ctggaggccc ggtcgcgtgc 480
ccgccagcaa cccccaattt ttttcaggtt gacctcggat caggtaggga tacccgctga 540
acttaagcat atcaataagc ggagga 566

Claims (15)

1.一种毡状地丝霉菌(Pseudogymnoascus pannorum) IVD-2 ，其特征在于，所述菌株的菌种保藏号为CGMCC NO.13700。
2.一种菌种制剂，其特征在于，所述菌种制剂包含具有活力的权利要求1所述的菌株。
3.一种生物防治菌剂，其特征在于，所述生物防治菌剂包含由权利要求1所述菌株培养得到的培养物。
4.根据权利要求3所述的生物防治菌剂，其特征在于，所述生物防治菌剂还包括助剂和稳定剂。
5.根据权利要求4所述的生物防治菌剂，其特征在于，所述助剂选自由聚乙二醇8000、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠、茶皂素和阿拉伯树胶组成的组；和所述稳定剂选自由碳酸钙、磷酸钾、磷酸氢二钾和羟甲基纤维素钠组成的组。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的生物防治菌剂，其特征在于，所述生物防治菌剂为悬浮剂，并且所述培养物为发酵液。
7.根据权利要求6所述的生物防治菌剂，其特征在于，所述发酵液通过如下方式获得：将所述菌株接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，20℃振荡培养7天后，将菌丝过滤后获得所述发酵液。
8.根据权利要求7所述的生物防治菌剂，其特征在于，在接种到马铃薯葡萄糖液体培养基之前还包括将所述菌株移植于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上进行活化的步骤。
9.根据权利要求3至5中任一项所述的生物防治菌剂，其特征在于，所述生物防治菌剂为粉剂，并且所述培养物为固体培养物。
10.根据权利要求9所述的生物防治菌剂，其特征在于，所述固体培养物通过如下方式获得：将所述菌株接种于固体培养基上，20℃暗培养15天后得到固体培养物，然后将固体培养物粉碎加工至粒径为300-2500µm的程度，得到所述粉剂。
11.根据权利要求10所述的生物防治菌剂，其特征在于，所述固体培养基为麦麸。
12.根据权利要求1所述的菌株在生物防治中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述生物防治是防治由真菌引起的病害或所造成的病原污染。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述真菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahlia）和/或月季黑斑病菌（Marssonina rosae）。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述生物防治为利用权利要求1所述的菌株来抑制大丽轮枝菌从而对黄栌枯萎病进行生物防治。
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