CN113881571B - 一种快速分离、定量检测香蕉枯萎病菌的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种培养基，含有香蕉根系分泌物干粉8‑12mg/L和NSG‑2L菌株提取物18‑22mg/L，NSG‑2L菌株为芽孢杆菌NSG‑2L，保藏编号CCTCC M2021008。本发明还提供了一种快速分离香蕉枯萎病菌的方法，采用该培养基进行培养。本发明首次从香蕉植株内分离到新的芽孢杆菌NSG‑2L，将该菌株的发酵液提取物与香蕉根系分泌物添加到培养基中，能够抑制多种土壤常见菌，而对香蕉枯萎病菌没有抑制，可快速地从含有香蕉枯萎病菌的混合菌或土壤中粗分离香蕉枯萎病菌。用该培养基对不同发病率蕉园土壤样品进行培养后，香蕉枯萎病菌的检出数量与枯萎病的发病率存在正相关性，可用来推测大田枯萎病发病率。

Description

一种快速分离、定量检测香蕉枯萎病菌的方法及应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种快速分离、定量检测香蕉枯萎病菌的方法及应用。
背景技术
香蕉枯萎病是典型的土传真菌病害，病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cubense)，侵染源主要是带菌土壤、吸芽及病株残体。病菌从香蕉根部伤口侵入，经维管束向球茎和假茎扩展蔓延，导致木质部导管堵塞，植株枯萎死亡。香蕉枯萎病菌的潜伏期较长，田间植株苗期感染到发病需要3-5个月或更长时间，症状出现通常在开花现蕾期。香蕉枯萎病菌根据鉴别寄主的不同分为4个生理小种，其中1号小种侵染粉蕉，4号生理小种几乎对所有香蕉栽培种均致病，尚无有效的化学药剂和高抗或者免疫品种(Zhou.,2019)，前期通过对全国蕉园土壤微生物分析表明，土壤中病原菌的数量与枯萎病的发生程度成正比。因此明确蕉园土壤中病原菌的含量，对蕉园土壤病原菌进行定量分析，从而对发病率进行预测并有针对性的选择防控技术，是控制该病的蔓延的首要措施。但是目前相关定量的检测技术存在操作过程繁琐、可行性较差、杂菌量高等问题，严重影响香蕉枯萎病的定量检测结果和效率，阻碍了该病的检验检疫和防控体系建立。
本发明针对目前香蕉枯萎病菌定量尚无有效快速检测技术和方法的问题，通过对选择性培养基的配方筛选和优化，形成一套可行性高的香蕉枯萎病菌快速定量检测技术，通过该技术可实现蕉园土壤病原菌的快速定量检测，为香蕉枯萎病综合防控体系的建立提供技术支撑。
发明内容：
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种快速分离、定量检测香蕉枯萎病菌的方法及应用。
本发明的第一个方面是提供一种培养基，其含有香蕉根系分泌物干粉8-12mg/L和NSG-2L菌株提取物18-22mg/L，其中，NSG-2L菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.Nov.)NSG-2L，保藏编号CCTCC M 2021008。
其中，所述香蕉根系分泌物干粉按照下述方法制得：取5-6片叶的香蕉二级苗，去除根部的土壤和杂质，然后将香蕉苗转入无菌室内，在无菌水中培养20-28h，培养温度为25-30℃，光照周期为14-18h光照/4-8h黑暗；取出幼苗，将培养过香蕉苗的无菌水过滤浓缩既得。
其中，所述NSG-2L菌株提取物为NSG-2L菌发酵液的乙酸乙酯提取物。
优选地，所述培养基含有：马铃薯水提物，香蕉根系分泌物干粉8-12mg/L，NSG-2L菌株提取物18-22mg/L，硫酸链霉素0.8-1.2g/L，琼脂16-22g/L，70％敌克松可湿性粉剂3-5g/L，乙醇7-12g/L，蒸馏水余量，pH6.8-7.2；其中，马铃薯水提物中马铃薯的用量与培养基的体积比为(180-220g):1L。
本发明的第二个方面是提供一种快速分离香蕉枯萎病菌的方法，采用本发明第一个方面所述的培养基进行培养分离。
优选地，培养时间为48-72h。
本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的培养基在从含有香蕉枯萎病菌的土壤常见菌混合菌或含香蕉枯萎病菌的土壤中粗分离香蕉枯萎病菌中的应用。
其中，所述土壤常见菌混合菌含有香蕉枯萎病菌，以及黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum f.sp.cucumebrium、和/或根瘤菌Rhizobium.sp.、和/或黑曲霉Aspergillussp.、和/或青霉菌Penicillium sp.、和/或木霉菌Trichoderma sp.、和/或乳球菌Lactococcus sp.、和/或假单胞菌Pseudomonas sp.、和/或伯克霍尔德氏菌Burkholderiasp.、和/或芽孢杆菌Bacillus sp.。
本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的培养基在抑制黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumebrium、和/或根瘤菌Rhizobium.sp.、和/或黑曲霉Aspergillus sp.、和/或青霉菌Penicillium sp.、和/或木霉菌Trichoderma sp.、和/或乳球菌Lactococcus sp.、和/或假单胞菌Pseudomonas sp.、和/或伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp.、和/或芽孢杆菌Bacillus sp.中的应用。
本发明的第五个方面是提供一种芽孢杆菌，其命名为芽孢杆菌(Bacillussp.Nov.)NSG-2L，保藏编号CCTCC M 2021008。
本发明的第六个方面是提供本发明第五个方面所述的芽孢杆菌的发酵液或发酵液的提取物。
本发明的第七个方面是提供本发明第五个方面所述的芽孢杆菌、或者本发明第六个方面所述的发酵液或发酵液的提取物在从含有香蕉枯萎病菌的土壤常见菌混合菌或含香蕉枯萎病菌的土壤中粗分离香蕉枯萎病菌中的应用。
其中，所述土壤常见菌混合菌含有香蕉枯萎病菌，以及黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum f.sp.cucumebrium、和/或根瘤菌Rhizobium.sp.、和/或黑曲霉Aspergillussp.、和/或青霉菌Penicillium sp.、和/或木霉菌Trichoderma sp.、和/或乳球菌Lactococcus sp.、和/或假单胞菌Pseudomonas sp.、和/或伯克霍尔德氏菌Burkholderiasp.、和/或芽孢杆菌Bacillus sp.。
本发明的第八个方面是提供本发明第五个方面所述的芽孢杆菌、或者本发明第六个方面所述的发酵液或发酵液的提取物在抑制黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumf.sp.cucumebrium、和/或根瘤菌Rhizobium.sp.、和/或黑曲霉Aspergillus sp.、和/或青霉菌Penicillium sp.、和/或木霉菌Trichoderma sp.、和/或乳球菌Lactococcus sp.、和/或假单胞菌Pseudomonas sp.、和/或伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp.、和/或芽孢杆菌Bacillus sp.中的应用。
本发明的第九个方面是提供一种香蕉根系分泌物干粉，其照下述方法制得：取5-6片叶的香蕉二级苗，去除根部的土壤和杂质，然后将香蕉苗转入无菌室内，在无菌水中培养20-28h，培养温度为25-30℃，光照周期为14-18h光照/4-8h黑暗；取出幼苗，将培养过香蕉苗的无菌水过滤浓缩既得。
本发明的第十个方面是提供本发明第九个方面所述的香蕉根系分泌物干粉在从含有香蕉枯萎病菌的土壤常见菌混合菌或含香蕉枯萎病菌的土壤中粗分离香蕉枯萎病菌中的应用。
其中，所述土壤常见菌混合菌含有香蕉枯萎病菌，以及黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum f.sp.cucumebrium、和/或根瘤菌Rhizobium.sp.、和/或黑曲霉Aspergillussp.、和/或青霉菌Penicillium sp.、和/或木霉菌Trichoderma sp.、和/或乳球菌Lactococcus sp.、和/或假单胞菌Pseudomonas sp.、和/或伯克霍尔德氏菌Burkholderiasp.、和/或芽孢杆菌Bacillus sp.。
本发明的第十一个方面是提供本发明第九个方面所述的香蕉根系分泌物干粉在抑制黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumebrium、和/或根瘤菌Rhizobium.sp.、和/或黑曲霉Aspergillus sp.、和/或青霉菌Penicillium sp.、和/或木霉菌Trichodermasp.、和/或乳球菌Lactococcus sp.、和/或假单胞菌Pseudomonas sp.、和/或伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp.、和/或芽孢杆菌Bacillus sp.中的应用。
本发明的第十二个方面是提供发明第一个方面所述的培养基、或者本发明第五个方面所述的芽孢杆菌、或者本发明第六个方面所述的发酵液或发酵液的提取物、或者本发明第九个方面所述的香蕉根系分泌物干粉在推测大田枯萎病发病率中的应用。
本发明的第十三个方面是提供一种定量检测土壤中香蕉枯萎病菌的方法，将定量的土壤样品制成悬浮液，量取悬浮液涂布于本发明第一个方面所述的培养基，25-30℃培养2天后，计数培养基上的菌落数量，菌落数量×稀释倍数即为定量的土壤中的香蕉枯萎病菌相对含量。
本发明首次从香蕉植株内分离到一种新的芽孢杆菌NSG-2L，将该菌株的发酵液提取物与香蕉根系分泌物添加到培养基中，能够抑制多种土壤常见菌黄瓜枯萎病菌、根瘤菌、黑曲霉、青霉菌、木霉菌、乳球菌、假单胞菌、伯克霍尔德氏菌、芽孢杆菌等，而对香蕉枯萎病菌没有抑制，从而采用该培养基来快速地从含有香蕉枯萎病菌的混合菌或土壤中粗分离香蕉枯萎病菌，此外，通过不同发病率蕉园土壤样品检测结果发现，采用本发明的培养基进行培养后，香蕉枯萎病菌的检出数量与香蕉园枯萎病的发病率存在正相关性，本发明的培养基可用来推测大田枯萎病发病率，可行性高。
附图说明
图1为香蕉枯萎病菌在PGZ1培养基上的培养特征。
图2为香蕉枯萎病菌致病性回接试验结果，图A和图C为枯萎病菌孢子悬浮液处理，图B和图D为对照处理，其中图C和图D为球茎及假茎纵切图。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的芽孢杆菌NSG-2L，保藏编号为CCTCC M 2021008，保藏日期为2021.1.4，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，位于中国武汉的武汉大学，是从香蕉植株内分离到一种新的芽孢杆菌。本菌株是采用LB培养基，将香蕉根系表面灭菌后研磨，采用梯度稀释涂布法将研磨后的组织液涂布，培养24-48小时后，分离单菌落，该菌菌落呈淡黄色，生长较快，菌落周围有不规则波浪型褶皱，菌落生长速度快。挑取单菌落纯化后，进行16S rRNA测序，将测序结果在EzBioCloud上进行序列比对，结果显示该菌株与Peribacillus asahii菌株相似率最高，相似率为96.60％，远远低于新种的相似率标准值98.65％，因此可以判断该菌株为一种新种，又因其与芽孢杆菌属相似率最高，结合其形态特征，判定其为一种芽孢杆菌属新种。
1.供试菌株
黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium，根瘤菌Rhizobium.sp.，黑曲霉Aspergillus sp.，青霉菌Penicillium sp.，木霉菌Trichoderma sp.，乳球菌Lactococcus sp.，假单胞菌Pseudomonas sp.，伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp.，芽孢杆菌Bacillus sp.，香蕉枯萎病1号生理小种Fusarium oxysporum.sp.cubense race.1，香蕉枯萎病4号生理小种Fusarium oxysporum.sp.cubense race.4均来源于中国热带农业科学院热带生物研究所实验室保存菌株。
2.供试土样
土样采自海南省海口市儋州两院试验场未发生过香蕉枯萎病的香蕉园。
3.培养基制备
香蕉根系分泌物收集：
将5-6片叶的香蕉二级苗，从培养盆中移出，无菌水反复冲洗掉根部的土壤和杂质，然后将香蕉苗转入装有无菌水的50mL三角瓶，并置于无菌室内28℃中培养24h，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。每次同时收集50株根系代谢产物。培养结束后取出幼苗，将三角瓶中的根系分泌物合并，过滤除去溶液中的根系碎片，通过冷冻干燥浓缩根系分泌物，得到的干粉保存于-80℃待用。
NSG-2L菌株提取物制备：
将NSG-2L菌株接种到细菌液体培养基进行发酵培养，细菌液体培养基为：蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL、pH 7.2；发酵条件为：温度28-35℃、转速为150-200rpm、摇床培养2-3天。将发酵液在8000转速下离心3min，取上清液，将得到的上清液用适量乙酸乙酯萃取(比如萃取比例为1:1)，将萃取后的乙酸乙酯相通过旋转蒸发仪进行旋蒸，去除有机溶剂，得到提取物，将得到的提取物溶解在无菌水中备用，溶解后的浓度为20mg/mL,保存于4℃冰箱中备用。
A1培养基
组分Ⅰ：1.0gK2HPO4，0.5gKCl，0.5gMgSO4·7H2O，0.01gFeNaEDTA，2.0gL-天门冬酰胺，10.0gD-半乳糖，16.0g琼脂和适量蒸馏水。
组分Ⅱ：0.682g五氯硝基苯(pentachloronitrobenzene,PCNB)(纯度>99％)，0.45g牛胆粉，0.5gNa2B4O7·10H2O，0.3g硫酸链霉素和适量灭菌水。
将组分Ⅰ经121℃，0.1MPa灭菌20min，冷却至45℃，加入组分Ⅱ，然后冷却至室温，添加适量无菌水使整个培养基体积为1L，调节pH6.8-7.2。
A2培养基
去皮马铃薯200g，CuSO4·5H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.6g，KH2PO4 0.1g，敌克松结晶粉(75％)3g，硫酸链霉素0.75g，95％酒精10mL，琼脂18-20g，添加适量无菌水使整个培养基体积为1L，调节pH 5.8左右。
PGZ1培养基
取去皮马铃薯块200g加适量水煮15-20min，取其滤液，加入10mg香蕉根系分泌物干粉，1mLNSG-2L菌株提取物备用液(即NSG-2L菌株提取物20mg)，硫酸链霉素1g，18-20g琼脂和适量蒸馏水，经121℃，0.1MPa灭菌20min，冷却后加入70％敌克松可湿性粉剂3-5g，95％酒精10-15mL，添加适量无菌水使整个培养基体积为1L，调节pH6.8-7.2。
PGZ2培养基
取去皮马铃薯块200g加适量水煮15-20min，取其滤液，加入10mg香蕉根系分泌物干粉，硫酸链霉素1g，18-20g琼脂和适量蒸馏水，经121℃，0.1MPa灭菌20min，冷却后加入70％敌克松可湿性粉剂3-5g，95％酒精10-15mL，添加适量无菌水使整个培养基体积为1L，调节pH6.8-7.2。
PGZ3培养基
取去皮马铃薯块200g加适量水煮15-20min，取其滤液加入1mL NSG-2L菌株提取物(即NSG-2L菌株提取物20mg)，硫酸链霉素1g，18-20g琼脂和适量蒸馏水，经121℃，0.1MPa灭菌20min，冷却后加入70％敌克松可湿性粉剂3-5g，95％酒精10-15mL，添加适量无菌水使整个培养基体积为1L，调节pH6.8-7.2，
PGZ4培养基
取去皮马铃薯块200g加适量水煮15-20min，取其滤液加入硫酸链霉素1g，18-20g琼脂和900mL蒸馏水,调节pH6.8-7.2，经121℃,0.1MPa灭菌20min，冷却后加入70％敌克松可湿性粉剂3-5g，95％酒精10-15mL。
4.香蕉枯萎病孢子悬浮液的制备
切取直径约1cm左右的香蕉枯萎病4号生理小种FOC.4和香蕉枯萎病1号生理小种FOC.1菌丝块，将菌丝块接种在新的PDA平板上，每个菌株接种约10个培养皿。28℃培养7d后，用无菌水冲洗孢子，并在3000rpm离心1min，取上清。在显微镜下计数孢子含量，并用无菌水稀释，使FOC.4孢子悬浮液浓度6.5×104CFU/mL，FOC.1孢子悬浮液浓度为7.5×104CFU/mL。
5.土壤常见菌的混合液制备
取土壤常见菌黄瓜枯萎病菌、根瘤菌、黑曲霉、青霉菌、木霉菌、乳球菌、假单胞菌、伯克霍尔德氏菌、芽孢杆菌，真菌采用PDB培养基，室温下震荡培养48小时，细菌采用液体LB培养基，室温下震荡培养24小时，离心去掉菌丝体，分别取上述单菌株培养液过滤液10mL，制备成100mL的混合液。
6.几种不同菌悬液样品处理的制备
6.1FOC.4孢子悬浮液+9种常见菌的混合液处理：取孢子浓度为6.5×106CFU/mL的FOC.4孢子悬浮液0.5mL加入到45mL混合液中，制备成多种微生物混合液(用“FOC.4+混合菌液”表示)。
6.2FOC.1孢子悬浮液+9种常见菌的混合液处理：取孢子浓度为7.5×106CFU/mL的FOC.1孢子悬浮液0.5mL加入到45mL混合液中，制备成多种微生物混合液(用“FOC.1+混合菌液”表示)。
6.3FOC.4孢子悬浮液+土壤样品制备：取孢子浓度为6.5×106CFU/mL FOC.4孢子悬浮液0.1mL加入到45mL无菌水中，再加入5g新鲜的蕉园土壤(未检出香蕉枯萎病菌)，150-180rpm震荡15-30min，使病原菌孢子混合均匀，既得(用“FOC.4+土壤”表示)(该样品处理中，FOC.4的理论浓度应为1.3Х104CFU/mL)。
6.4FOC.1孢子悬浮液+土壤样品制备：取孢子浓度为7.5×106CFU/mL FOC.1孢子悬浮液0.1mL加入到45mL无菌水中，在加入5g新鲜的蕉园土壤(未检出香蕉枯萎病菌)，150-180rpm震荡15-30min，使病原菌孢子混合均匀，既得(用“FOC.1+土壤”表示)(该样品处理中，FOC.4的理论浓度应为1.5Х104CFU/mL)。
7.不同培养基对6种菌悬液样品枯萎病菌的检测效果比较
将FOC.4菌悬液和FOC.1菌悬液以及6.1-6.4中的4种菌悬液，分别稀释10倍后，分别取0.1mL进行6种不同培养基涂布，每个处理3个培养皿重复，并将涂布后的培养皿置于室温25-30℃，培养2天后，分别与FOC.4孢子悬浮液、FOC.1孢子悬浮液生长的菌落数量进行对比，确定香蕉枯萎病菌FOC.4和FOC.1的菌落在不同培养基上的形态，并根据生长出的FOC.4和FOC.1菌落数量×稀释倍数(100)即为检出的菌含量，并分别计算杂菌率和检出率。结果见图1和表1。
如附图1所示，在PGZ1上生长的菌落，杂菌极少，只观察到枯萎病菌的菌落长满平板，而其他杂菌受到抑制，并未在培养基上生长，因此可以看出，经过PGZ1培养基的培养，抑制了其他土壤常见菌的生长，而枯萎病菌能正常生长，且枯萎病菌FOC.4和FOC.1悬浮液培养在PGZ1上菌落特点与分别土壤混合后培养出的菌落特点无明显差异，表明该选择性培养基可用于枯萎病菌的粗分离。
香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在筛选出的PGZ1培养基上主要特征如图1所示。其主要区别与其他真菌的特征表现为：培养2天时，枯萎病菌的菌落较小，通常只有0.5-1mm，菌落为纯白色，中央的气生菌丝浓密，边缘有稀疏的菌丝，呈放射状沿着中心浓密菌丝向四周扩展，周围稀疏菌丝长度通常为1-1.5mm，肉眼观察菌落四周好像锯齿性状，而其他土壤真菌和细菌不具备上述特征。而且枯萎病1号和4号小种菌落形态特征也有较细微的差异，表现在1号小种的菌落相对比4号小种大，且1号小种中央菌丝不如四号小种浓密，而且边缘菌丝的锯齿状特征不明显，而4号小种菌落更小，菌落边缘稀疏的菌丝更多，锯齿状特征明显。因此形态特征可以对枯萎病菌的生理小种进行初步判断，但还需要结合PCR方法进行进一步验证。
表1
Figure BDA0002964304930000081
Figure BDA0002964304930000091
从表1中可知，6种培养基对香蕉枯萎病菌(FOC.4和FOC.1)的检出率差异明显，其中PGZ1培养基对FOC.4的检出率分别达92.31％(混合菌液)和84.62％(土壤混合)，FOC.1的检出率分别达94.67％(混合菌液)和85.33％(土壤混合)显著高于其他5种培养基处理。此外，与其他5种培养基相比，PGZ1的杂菌率最低在1.85％～6.87％，由此可以看出，PGZ1培养基可以用于香蕉枯萎病定量培养，且杂菌率低，检出率高于80％，可用于大田土壤等复杂环境中枯萎病菌的分离和定量检测。
8.香蕉枯萎病菌1号和4号小种的进一步验证
为了进一步验证是否香蕉枯萎病菌及确认属于哪个生理小种，挑取生长形态一致的单菌落3个，分别接种到3个PDA培养皿进行纯化培养，纯化后的单菌落在黑暗条件下生长3-5天，收集菌丝体，采用DNA提取试剂盒提取菌体DNA，然后分别用尖孢镰刀菌1号、4号的特异性引物进行PCR扩增，并分别以4号和1号生理小种的菌体DNA为阳性对照。
特异性引物：
1号小种：W1805F：5′GTTGAGTCTCGATAAACAGCAAT 3′，W1805R：5′GACGAGGGGAGATATGGTC 3
4号小种：W2987F：5′GCCGATGTCTTCGTCAGGTA3′W2987R：5′CTGAGACTCGTGCTGCATGA3′
PCR反应体系为：模板DNA 1μL(相当于10-20ng DNA)，10×PCR缓冲液(含Mg2+2.5μL，2.5mmol·L-1dNTP 2μL，特异性上、下游引物(浓度为5μmol·L-1)各1μL，Taq酶(5U·μL-1)1U，加ddH2O至25μL总体积。扩增程序：95℃预变性2min，94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。将扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪成像后分析结果。根据4号和1号生理小种扩增条带的大小确定，4号生理小种特异性引物、1号生理小种特异性引物能分别扩增出相应的条带，大小分别为590bp和350bp，而其他菌株则没有扩增产物。由此进一步验证培养基PGZ1所分离出的菌落属于FOC.4或者FOC.1。
9.培养时间优化
采用FOC.4孢子悬浮液+土壤样品的菌悬液，接种至PGZ1培养基上进行培养，分别在培养12h，24h，36h，72h，96h，120h，144h观察菌落生长情况，并记录菌落的可识别度。结果见表2。随着培养时间的增加，菌落逐渐长大，单菌落特征无法进行识别，因此合理的观察计数时间对识别枯萎病菌非常重要。
表2
Figure BDA0002964304930000101
备注：--代表无菌落生长或者无法识别，*可识别度低，**可识别度中等，***可识别度高
10.选择性培养基的田间样品检测实验
采用PGZ1培养基进行田间样品检测灵敏度试验。分别取6种不同发病率的土壤样品，发病率分别为0-5％、6-10％、11-15％、16-30％、31-50％、50％以上；取样方法为采集10-20cm土层的香蕉根际土壤，避开施肥点。每种发病率取3个蕉园土壤样品，每个蕉园样品采用全园10点随机取样并混合。土壤样品采集后转入冰盒中，拿回实验室迅速进行土壤悬浮液的制备和悬浮液的涂布。
土壤悬浮液制备：取1g新鲜土壤样品加入无菌水中，150-180rpm震荡15-30min，使土壤充分悬浮混合均匀，再加无菌水定容至10mL制成悬浮液，再量取0.1mL悬浮液均匀涂布于选择性培养基平板上，25-30℃培养2天后，计数培养皿上的菌落数量，计数所得的菌落数量×稀释倍数(100)，即为每g土壤中的香蕉枯萎病菌相对含量。每个土壤样品重复涂布5个培养皿。
土壤中的香蕉枯萎病菌相对含量计算公式如下：
香蕉枯萎病菌相对含量＝菌落数量X稀释倍数
由于所有的土壤样品均采用相同的培养条件进行培养，因此，计数所得的每g土壤中香蕉枯萎病菌的相对含量可以用于比较不同田地中香蕉枯萎病菌数量上的差异。结果见表3。
通过不同发病率蕉园土壤样品检测结果发现，香蕉枯萎病菌的检出数量与香蕉园枯萎病的发病率存在正相关性，即随着枯萎病发病率增加，可检出的枯萎病菌数量逐渐增加，证明检测结果与大田实际发病率相符合，因此可以采用本发明的培养基进行培养，根据可检出的枯萎病菌数量，来大致推测该块田地是否会发生枯萎病以及大田枯萎病发病率。对于检出香蕉枯萎病的田地，可以进一步采用尖孢镰刀菌1号、4号的特异性引物进行PCR扩增，确认检出的病原菌是否为香蕉枯萎病病菌，进而提前选择合适的防控手段，做到有效预防，可行性高。
表3
Figure BDA0002964304930000111
11.土壤检出菌对香蕉致病性验证
孢子悬浮液制备：将在“10.选择性培养基的田间样品检测实验”中从土壤中检出并拟定为香蕉枯萎病菌的菌株转入PDA平板于室温下培养7d，无菌水冲洗菌落，洗出的孢子离心后用鲍尔血球计数板测定孢子数，接种用的孢子悬浮液孢子浓度为106CFU·mL-1。
致病性回接试验：将巴西蕉品种的组培苗(杯苗)，大约3-5片叶，从营养基质中取出后，自来水冲洗根部，移栽于灭菌的栽培土，采用伤根浸菌液法接种，从栽培盆中取出蕉苗用剪刀剪伤根尖，将根在孢子悬浮液浸30min后，移植回栽培盆中，每株香蕉苗根部浇灌香蕉枯萎病菌孢子悬浮液2mL；以伤根浸浇无菌水为对照，每处理10株，试验重复3次。
随机挑取上述土壤样品检测平板上的单菌落，进行回接试验，发现巴西蕉幼苗在接种7d后开始表现出最下部叶片黄化，香蕉苗叶尖和叶缘出现焦枯卷缩，10天后下部叶严重黄化萎凋，第15天假茎基部开始变褐萎缩中间会裂开，病害由下至上扩展逐渐枯死，球茎纵切面变褐，而对照的维管束健康，无变褐症状。叶色浓绿，假茎粗壮发达，根系发达且白(图2)。将病株重新用PGZ1培养基分离，分离出的菌落形态与接种的菌株相同。证明土壤中检出的菌落即为香蕉枯萎病菌。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种培养基，其特征在于，其含有香蕉根系分泌物干粉8-12mg/L和NSG-2L菌株提取物18-22mg/L，其中，NSG-2L菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp. Nov.）NSG-2L，保藏编号CCTCCM 2021008；
其中，所述香蕉根系分泌物干粉按照下述方法制得：取5-6片叶的香蕉二级苗，去除根部的土壤和杂质，然后将香蕉苗转入无菌室内，在无菌水中培养20-28h，培养温度为25-30℃，光照周期为14-18h光照/4-8h黑暗；取出幼苗，将培养过香蕉苗的无菌水过滤浓缩即得；
所述NSG-2L菌株提取物为NSG-2L菌发酵液的乙酸乙酯提取物。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基含有：马铃薯水提物，香蕉根系分泌物干粉8-12mg/L，NSG-2L菌株提取物18-22mg/L，硫酸链霉素0.8-1.2g/L，琼脂16-22g/L，70% 敌克松可湿性粉剂3-5g/L，乙醇7-12 g/L，蒸馏水余量，pH6.8-7.2；其中，马铃薯水提物中马铃薯的用量与培养基的体积比为（180-220g）:1L。
3.一种快速分离香蕉枯萎病菌的方法，其特征在于，将样品制成悬浮液，涂布于权利要求1或2所述的培养基进行培养分离。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，培养时间为48-72h。
5.一种定量检测土壤中香蕉枯萎病菌的方法，其特征在于，将定量的土壤样品制成悬浮液，量取悬浮液涂布于权利要求1或2所述的培养基，25-30℃培养2天后，计数培养基上的菌落数量，菌落数量×稀释倍数即为定量的土壤中的香蕉枯萎病菌相对含量。
6.一种芽孢杆菌，其特征在于，其命名为芽孢杆菌（Bacillus sp. Nov.）NSG-2L，保藏编号CCTCC M 2021008。
7.权利要求6所述的芽孢杆菌的发酵液或发酵液的提取物，所述的发酵液提取物为发酵液的乙酸乙酯提取物。
8.如权利要求1或2所述的培养基、或者如权利要求6所述的芽孢杆菌、或者权利要求7所述的发酵液或发酵液的提取物在从含有香蕉枯萎病菌的土壤常见菌混合菌或含香蕉枯萎病菌的土壤中粗分离香蕉枯萎病菌中的应用。
9.如权利要求1或2所述的培养基、或者如权利要求5所述的芽孢杆菌、或者权利要求6所述的发酵液或发酵液的提取物在抑制黄瓜枯萎病菌、和/或根瘤菌、和/或黑曲霉、和/或青霉菌、和/或木霉菌、和/或乳球菌、和/或假单胞菌、和/或伯克霍尔德氏菌、和/或芽孢杆菌中的应用。
10.如权利要求1或2所述的培养基、或者如权利要求6所述的芽孢杆菌、或者权利要求7所述的发酵液或发酵液的提取物在推测大田枯萎病发病率中的应用。
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