CN115948301B - 一种防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂及其应用。所述寡糖素复合菌剂由阿比科恩链霉菌HN‑06(Streptomyces abikoensis HN‑06)菌液和氨基寡糖素混合制得，所述阿比科恩链霉菌HN‑06的保藏编号为CGMCC NO:25999。本发明选择阿比科恩链霉菌HN‑06(Streptomyces abikoensis HN‑06)与氨基寡糖复配菌剂，对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense race 4)具有显著的增效作用，防治香蕉枯萎病具有良好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及香蕉病害防控领域，特别涉及一种防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂及其应用。
背景技术
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder)引起的土传维管束病害。病原菌从受伤香蕉根部侵入，沿维管束向香蕉其它部位蔓延并造成维管束堵塞。病株出现凋萎、病株维管束变褐、叶片黄化，最终整株枯死。病原菌以孢子、菌丝体和菌核等在土壤中存活，随土壤、流水和农具等传播，传染性强，对蕉园危害严重。
对香蕉枯萎病的防治主要包括化学防治、生物防治和选育抗病品种。目前尚无有效防治香蕉枯萎病的化学农药和抗病品种。生物防治具有环境兼容性好，防效持久的特点。
由于单一施用生防菌易造成不同程度的抗药性，将不同结构和作用机理的成分进行复配，开发出高效、低毒的复配菌剂是延缓抗药性和提高药效的有效途径。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂及其应用，解决上述问题。
氨基寡糖素是由壳聚糖降解得到的一种低聚糖。能诱导植物产生植保素、几丁质酶、多酚氧化酶等多种抗性物质，启动植物的免疫系统，诱导作物的抗病性使作物对多种真菌和细菌性病害产生抗性和免疫作用。
发明人经过大量研究，筛选出阿比科恩链霉菌HN-06(Streptomyces abikoensisHN-06)与氨基寡糖复配菌剂具有显著的增效作用，防治香蕉枯萎病具有良好的效果。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂，其活性组分原料由阿比科恩链霉菌HN-06(Streptomyces abikoensis HN-06)菌液和氨基寡糖素组成，所述阿比科恩链霉菌HN-06的保藏编号为CGMCC NO:25999，保藏日：2022年10月31日，保藏中心：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
进一步的，所述阿比科恩链霉菌HN-06菌液由阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉制得，所述阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉的有效活菌数大于6.5×107g-1。
进一步的，所述复合菌剂中，阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉和氨基寡糖素的质量浓度比例为20～30：0.8～1.2。
进一步的，所述复合菌剂中，阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉和氨基寡糖素的质量浓度比例为25：1。
进一步的，所述复合菌剂中，阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉的浓度为20～30g/L，氨基寡糖素的浓度为0.8～1.2g/L。
进一步的，所述复合菌剂中还含有分散剂木质素磺酸钠15～25g/L。
进一步的，所述寡糖素复合菌剂的制备方法：取链霉菌孢子粉、氨基寡糖素和木质素磺酸钠加入液体发酵培养基中，混合均匀，即得寡糖素复合菌剂。
一种香蕉枯萎病的防控方法，使用本发明任一项所述的寡糖素复合菌剂用于防控香蕉枯萎病。
进一步的，使用时，将所述寡糖素复合菌剂加水稀释9～11倍后进行灌根，每株淋灌1.8～2.2L药液。每隔1月施药1次，连续施药3次。
进一步的，使用浓度为0.8～1.2g/L的氨基寡糖素加水稀释9～11倍后进行叶面喷施。每周喷药1次，连续喷施10次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明选择阿比科恩链霉菌HN-06(Streptomyces abikoensis HN-06)与氨基寡糖复配菌剂，对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense race4)具有显著的增效作用，防治香蕉枯萎病具有良好的效果。
(2)其中，本发明寡糖素复合菌剂中阿比科恩链霉菌HN-06及其代谢产物，对香蕉枯萎病菌有抑制作用及直接杀灭作用，氨基寡糖素可诱导植物产生抗病性、对病原菌产生免疫和杀灭作用。
(3)本发明选用氨基寡糖素与阿比科恩链霉菌复配，可能促进了阿比科恩链霉菌在土壤中的定植和生长，从而起到增效作用，而且延缓了病菌抗药性的产生。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明阿比科恩链霉菌HN-06为本实验室分离得到，命名为Streptomycesabikoensis HN-06，保藏编号为CGMCC NO:25999，保藏日：2022年10月31日，保藏中心：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例-拮抗菌菌液的制备
1.阿比科恩链霉菌HN-06种子活化和培养：
1).高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO3 1g，K2HPO4.3H2O0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，琼脂20g，水1L，pH 7.4-7.6。
2).种子培养基：可溶性淀粉20g，葡萄糖20g/L，酵母粉2g/L，NaCl 4g/L，K2HPO30.5g/L，MgSO4.H2O 0.5g/L，CaCO3 2g/L。
3).固体发酵培养基：大米100g，黄豆粉10g，麸皮15g，NaCl 0.5g，K2HPO30.5g，CaCO3 1g。料水比10:6。
4)液体发酵培养基：黄豆饼粉20g/L，大豆蛋白胨2g/L，葡萄糖20g/L，可溶性淀粉5g/L，酵母粉2g/L，NaCl 4g/L，K2HPO3 0.5g/L，MgSO4.H2O 0.5g/L，CaCO3 2g/L。
5)将阿比科恩链霉菌HN-06菌种接种于高氏一号固体培养基上，30℃培养至产孢。挑取孢子接种到液体种子培养基中，30℃、250r/min培养72h即得种子液。
固体发酵：按照体积质量比为10％的接种量将步骤5)种子液接种至固体发酵培养基中无菌培养，30℃、65％湿度培养96h。期间每隔24h翻耙一次。培养结束后于35℃烘干后粉粹，过120目筛即得阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉。有效活菌数大于6.5×107g-1。
6).拮抗菌复配菌剂制备：称取阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉25g，氨基寡糖素1g，木质素磺酸钠20g加入1L液体发酵培养基中，混合均匀，即得拮抗菌复配液体菌剂。使用时，按1:10倍稀释。
7).氨基寡糖素叶面喷剂制备：称取氨基寡糖素1g，木质素磺酸钠20g加入1L水中，混合均匀，即得氨基寡糖素叶面喷剂。使用时，按1:10倍稀释。
试验例
1.对病原菌的毒力测定
香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense race 4)由中国热带农业科学院热带生物技术研究所种质与基因资源研究室提供。
接种病原菌于PDA平板培养基中，28℃恒温培养，待菌丝长满培养皿时备用。
阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉与氨基寡糖素以不同质量配比成复配菌剂。阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉与氨基寡糖素的质量比例分别为100:1，50:1，25:1，12.5:1。
分别在融化的PDA固体培养基中加入不同处理的药剂，充分混匀，制成不同的含药平板。不同的药剂处理及浓度分别为：
(1)阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉浓度：50，100，200，400mg/L，
(2)氨基寡糖素浓度：2.5，5，10，20mg/L，
(3)复配菌剂浓度：50，100，200，400mg/L，
(4)无菌水对照。
用直径5mm打孔器切取培养好的病原菌菌饼，接种于不同的含药平板中央，置于28℃恒温培养，每处理重复3次。
结果分析：
当对照中菌丝生长直径达到培养皿直径的50％左右时，测量各处理菌落直径，计算各处理直径平均值。利用孙云沛法计算共毒系数(CTC)。当CTC>120时认为混剂具有协同增效作用，80≤CTC≤120时混剂具有相加作用。
表1.不同药剂处理对香蕉看枯萎病菌的共毒系数
由表1可知，复配菌剂1、2和4对香蕉枯萎病菌的共毒系数80≤CTC≤120，说明这三种复配菌剂对病原菌均具有相加作用。复配菌剂3共毒系数为136，大于120。所以复配菌剂3(25:1)具有协同增效作用。
2.复合菌剂的田间防效
1).枯萎病菌孢子液制备：将尖孢镰刀菌接种在PDA液体培养基中，28℃震荡培养4d。用无菌纱布过滤，滤液即为孢子液。用雪球计数板对孢子进行计数，将孢子浓度稀释为106CFU/mL-1。即得孢子悬浮液。4℃保存备用。
2).共设7个处理：(1)不施药处理(对照，CK)；(2)链霉菌处理(25g/L，T2)；(3)氨基寡糖素处理(1g/L，T3)；(4)链霉菌：氨基寡糖素质量比100:1处理(T4)；(5)链霉菌：氨基寡糖素质量比50:1处理(T5)；(6)链霉菌：氨基寡糖素质量比25:1处理(T6)；(7)链霉菌：氨基寡糖素质量比12.5:1处理(T7)。其中(1)、(2)和(3)处理加水稀释10倍后进行灌根，每株淋灌2L药液。每隔1月施药1次，连续施药3次。(4)、(5)、(6)和(7)处理除了同上进行灌根处理外，另外将浓度为1g/L的氨基寡糖素加水稀释10倍后进行叶面喷施。每周喷药1次，连续喷施10次。
3).采用随机区组排列，重复3次，小区面积50m2。香蕉苗移栽后约一个月，用各处理菌剂进行灌根。14天后，伤根接种香蕉枯萎病菌孢子液(镰刀菌4号生理小种，FOC 4)。以后每隔1月施药1次，共施药3次。最后一次施药后1个月调查发病情况，计算各处理防效。
5).病情指数分级如下：1级：叶片无症状，球茎、假茎解剖后未见褐变，根有少数褐变。2级：香蕉下部1-2叶片出现小面积黄色斑块，但少于叶面积1/2。球茎变褐面积少于1/4。有部分根变褐。3级下部叶片变褐面积达到叶面积的1/2以上，球茎变褐面积占1/4-1/2。部分根变褐。4级：叶片褐变，萎蔫。球茎约1/2褐变.假茎下部出现褐变。根大部褐变。植株轻度萎蔫。5级：植株萎蔫、枯死。球茎1/2以上褐变，腐烂。假茎大部褐变，根呈褐色或烂根。
发病率＝(发病株数/调查总株数)×100％
病情指数＝[∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)]×100
相对防效＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100
表2不同菌剂处理下发病率和病情指数
田间药效结果表明(表2)，阿比科恩链霉菌HN-06+氨基寡糖素+叶面喷施寡糖素组合能有效防治香蕉枯萎病，防治效果优于单剂的防效。
其中阿比科恩链霉菌HN-06与氨基寡糖素质量配比为25:1时，防治效果最好，相对防效为41.76％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂，其特征在于，所述寡糖素复合菌剂的活性组分原料组成包括阿比科恩链霉菌HN-06（Streptomyces abikoensis HN-06）菌液和氨基寡糖素，所述阿比科恩链霉菌HN-06的保藏编号为CGMCC NO: 25999。
2.根据权利要求1所述的防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂，其特征在于，阿比科恩链霉菌HN-06菌液由阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉制得，所述阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉的有效活菌数大于6.5×107g -1。
3.根据权利要求1或2所述的防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉和氨基寡糖素的质量浓度比例为20~30：0.8~1.2。
4.根据权利要求3所述的防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉和氨基寡糖素的质量浓度比例为25：1。
5.根据权利要求1所述的防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，阿比科恩链霉菌HN-06孢子粉的浓度为20～30g/L，氨基寡糖素的浓度为0.8～1.2g/L。
6.根据权利要求5所述的防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中还含有分散剂木质素磺酸钠15～25g/L。
7.权利要求6所述的防控香蕉枯萎病的寡糖素复合菌剂的制备方法，其特征在于，取链霉菌孢子粉、氨基寡糖素和木质素磺酸钠加入液体发酵培养基中，混合均匀，即得寡糖素复合菌剂，所述链霉菌为阿比科恩链霉菌HN-06，所述阿比科恩链霉菌HN-06的保藏编号为CGMCC NO: 25999。
8.一种香蕉枯萎病的防控方法，其特征在于，使用权利要求1-6任一项所述的寡糖素复合菌剂用于防控香蕉枯萎病。
9.根据权利要求8所述的防控方法，其特征在于，使用时，将所述寡糖素复合菌剂加水稀释9～11倍后进行灌根，每株淋灌1.8～2.2L药液。
10.根据权利要求9所述的防控方法，其特征在于，使用浓度为0.8-1.2g/L的氨基寡糖素加水稀释9～11倍后进行叶面喷施。
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