CN106906171A - 一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，将可以直接以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，同时能够诱导自身产生多种可降解病原菌细胞壁的胞外水解酶，且可以长期定殖于苹果树腐烂病病斑处的微白黄链霉菌Actin‑1经活化、产孢，制备成孢子悬液，然后将其接种到液体种子培养基中发酵制得发酵种子液，最后将发酵种子液接种于固体发酵培养基经固体发酵制成孢子原粉，然后与紫外保护剂、分散剂、载体等助剂科学筛选、复配，制得一种防治效果好、效率高、复发率低、适应环境能力强、稳定强、不易产生抗药性等多重优点的生防菌剂，是生物防治的首选，对提高苹果树腐烂病等果蔬病原菌的防治效果、防止病原菌复发、保护环境具有重要意义。

Description

一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生防菌剂的制备，具体涉及一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法。

背景技术

苹果树腐烂病(Valsa mali Miyabe et Yamada)俗称烂皮病、臭皮病，是由黑腐皮壳属(Valsa ceratosperma)引起的北方苹果树重要的病害。该病主要危害3年生以上的结果树，造成树势衰弱、枝干枯死、死树甚至毁园。该病症状主要以溃疡型为主。溃疡型在早春树干、树皮上出现红褐色、水渍状、微隆起、圆至长圆形病斑，质地松软，易撕裂，手压容易凹陷，流出黄褐色汁液，有酒糟味。后期干缩下陷，病部边缘裂缝，有明显的小黑点即分生孢子器，潮湿时小黑点涌出橘黄色卷须分生孢子。一般3-5月份侵染，7-8月开始发病，早春为发病高峰期。

苹果树腐烂病的防治一直以化学农药防治为主，但化学农药长期并大量的使用已经造成环境污染、生态失衡、人畜中毒及杀伤有益微生物等严重问题。目前生物防治越来越受到广大研究者和果农的认可，因此开发安全性高、环境兼容性好、有效性持久的生物防治剂成为植物真菌病害综合防治的热点研究方向。

目前，已经公开的防治苹果树腐烂病的生防菌剂涉及细菌和真菌的较多，比如：

中国专利CN 105331545 A公开了一种防治苹果树腐烂病的菌株、微生物菌剂及其制备方法。所述菌株61239已于2015年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015420。生防真菌来源于自然界中，无污染、无公害、无残留，对人畜无毒副作用，无论是对苹果树还是对人体、生态环境都相当的安全，可运用于苹果树的任何生育期，特别是休眠期，不产生任何抗性，可彻底控制和根治苹果腐烂病。实验证明，对苹果树腐烂病菌特异性强，控制效果好，平均防效在95％以上。所述菌株61239对苹果腐烂病菌具有显著的抑菌和杀菌活性，特别是能以苹果树体上的老翘皮、各个剪锯口处死组织上的纤维素和木质素为养分，长期定殖存活于苹果树上，既能预防新病斑的产生，又能防止原有老疤的复发，可持久地控制苹果腐烂病菌，从而达到彻底控制和根治苹果腐烂病的目的。

中国专利CN 105284902 A公开了一种防治苹果树腐烂病生防菌发酵液制备方法；所述菌株SL17和SL18均为枯草芽孢杆菌，已于2015年保藏于山西省农业科学院植物保护研究所菌种库，菌株SL17保藏编号为SAASIPPLF17，菌株SL18保藏编号为SAASIPPLF18。该专利对所述菌株进行液体培养并浓缩后制得发酵液药剂及发酵液膏剂，有效防治苹果树腐烂病，治愈率约80％，促进伤口愈合，伤口愈合平均宽度为9.46cm²，病斑复发率为4.21％。

中国专利CN 102851225 A公开了一株微嗜酸寡养单胞菌及其在苹果树腐烂病生防剂中的应用，所述菌株BJ1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:2011475，实验表明，微嗜酸寡养单胞菌BJ1在苹果离体枝条防效实验中。发酵滤液对苹果树腐烂病的防效达94.97％，在2-3年生苹果树幼树防效实验中也达70％以上，防效稳定，对环境友好，发酵工艺简单，生产成本低廉；

但是，细菌和真菌产生的抑菌性生物活性物质种类少，产量低，活性低，持效期短，防病效果不理想。

放线菌对靶标菌发挥生防作用一般通过两种途径：在寄主体外通过抗生作用、竞争作用、捕食和重寄生作用，导致病原菌的致病性及侵染效率降低；放线菌也可在寄主植物组织内，诱发其产生抗性或者产生抑菌物质，影响病原菌的生长、繁殖，最后导致其死亡。

链霉菌是一种放线菌，其产生的抗生素、胞外酶等抗真菌活性物质比益生细菌和真菌所产生的活性物质种类更多、活性更强，用其孢子和菌丝制成的活细胞制剂无毒、无害、无残留、不伤害非靶标微生物、与环境兼容性好、防病持效期长，且产孢量大、孢子抗逆性强、易于制成活细胞制剂如孢子粉剂、种衣剂、菌丝体培养物等以及便于生产和运输保存。被广泛应用于农业病害的生物防治。

目前，公开的防治苹果树腐烂病的链霉菌较少，比如：

中国专利CN 104673723 A公开了一种极长链霉菌株SL01(Streptomyceslongissimus SL01)及由该菌株制备的微生物菌剂(发酵液及发酵滤液)。该发明还公开了两种微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用。采用不同处理方法涂抹菌株SL01发酵液及发酵滤液发现，离体枝条和果实的防效均达到90％，与药剂对照甲基硫菌灵达到同一水平；2012年大田试验中，刮病斑后涂抹SL01菌剂防治效果100％，划线后涂抹防效为58％；2013年大田试验中，刮病斑后涂抹SL01菌剂防治效果97.8％，超过甲基硫菌灵药剂对照的防效(84.6％)，划线后涂抹防效为64.4％，均可有效降低为防治苹果树腐烂病而大量施用化学农药所造成的对生态环境的破坏，具有很好的生态和社会效益，开发应用前景广阔。

中国专利CN 101822272 B公开了一种灰黄链霉菌在生物防治植物病害中的应用。该应用具体为灰黄链霉菌(Streptomyces griseoflavus)NMG6-3-9 CGMCCNo.3441在生物防治植物病害中的应用。该菌株对苜蓿根腐病病原菌具有非常好的拮抗作用，能够用于生物防治苜蓿根腐病及其它多种植物病害，在生物防治植物病害领域具有广阔的应用前景。该发明为苜蓿根腐病的生物防治奠定基础，进而为该病生防放线菌制剂的研制与应用提供科学依据。张清明等研究了伍卡尔链霉菌发酵滤液对苹果树腐烂病的防效达70％。

上述公开的链霉菌防病效果仍不很理想，且防病机理同大多数细菌和真菌一样，主要是通过代谢产生抗生素、抗菌肽等抗菌物质产生拮抗效应抑制病原菌的生长和繁殖，防病效果不彻底，不能根治苹果树腐烂病。

研究表明：病原菌的细胞壁以几丁质、纤维素为骨架，以β-1,3-葡聚糖及蛋白质为主要填充物。放线菌是抗生素的主要产生菌，生防放线菌除通过抗生素的拮抗作用抑制病原菌外，在常规诱导物的作用下，产生几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶等胞外水解酶的放线菌对病原菌有抑菌作用，如果能直接以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，并且诱导生防菌自身产生多种可降解病原菌细胞壁的胞外水解酶，通过协同酶溶作用使病原菌细胞崩解，不仅可直接杀死病原菌，而且可长期定殖在苹果树腐烂病斑处，彻底防止苹果树腐烂病的发生，提高防病效果，有效防止腐烂病复发。

综上，制备一种可以直接以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，同时诱导生防菌自身产生多种可降解病原菌细胞壁的胞外水解酶以提高防病效果，防止苹果树腐烂病复发的苹果树腐烂病生防菌剂是本领域技术人员的期盼。

发明内容

本发明所解决的技术问题是克服现有苹果树腐烂病生防菌剂的缺陷，将可以直接以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，同时能够诱导自身产生多种可降解病原菌细胞壁的胞外水解酶，且可以长期定殖于苹果树腐烂病病斑处的微白黄链霉菌Actin-1经活化、产孢，制备成孢子悬液，然后将其接种到液体种子培养基中发酵制得到发酵种子液，最后将发酵种子液接种于固体发酵培养基经固体发酵制成孢子原粉，然后与紫外保护剂、分散剂、载体等助剂科学筛选、复配，制得一种有效提高防病效果，防止苹果树腐烂病复发的生防菌剂。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)发酵种子液的制备：将微白黄链霉菌Actin-1菌种划线接种于高氏一号琼脂培养基斜面上，28-32℃培养6-8天至产孢；然后向斜面加入5mL无菌水，用灭菌接种针将孢子刮下，加入无菌水中，震荡混匀得孢子悬液；将所述孢子悬液按接种量0.8-1.2％(v/v)接种到液体种子培养基中，28-32℃，180-220r/min，摇瓶培养46-50h即得发酵种子液；

2)固体发酵培养基的制备：按照固体发酵培养基配方，先用部分水将K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O溶解，然后与其它原料混匀，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃；平铺于长70cm，宽50cm，深5cm灭菌后的曲盘中；

3)固体发酵：按体积质量比10％的接种量将步骤1)发酵种子液接种至步骤2)盛有固体发酵培养基的曲盘中；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度28-32℃、湿度64-66％培养22-26h后将麻包、报纸掀开，翻耙，然后依次将报纸、麻包覆盖，每22-26h重复操作一次；同样条件下继续培养至94-98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、过120目筛即得微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉；

4)混匀：将步骤3)得到的微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉与载体、紫外保护剂、分散剂按质量比53-61:36-44:1-3:0.8-1.2均匀混合即得苹果树腐烂病生防菌剂。

优选地，步骤1)所述孢子悬液孢子浓度为0.5-1.5×10⁶个/mL；

优选地，步骤1)所述高氏一号琼脂培养基质量组成：可溶性淀粉：20g，K₂HPO₄·3H₂O：0.5g，NaCl：0.5g，KNO₃：1g，MgSO₄·7H₂O：0.5g，FeSO₄·7H₂O：0.01g，蒸馏水：1L，琼脂：20g，pH值7.2-7.4；

优选地，步骤1)所述液体种子培养基质量组成：玉米粉：10g，豆饼粉：10g，淀粉：10g，K₂HPO₄：0.2g，自来水：1L，pH值7.2；

优选地，步骤2)曲盘中料层厚度1-3cm；

优选地，步骤4)所述固体发酵培养基质量组成为：棉籽皮：160g，麸皮：280g，玉米粉：120g，豆饼粉120g，碳酸钙：10g，K₂HPO₄：2g，MgSO₄·7H₂O：2g，生石灰：5g，自来水：1L，pH值7.0；

优选地，步骤4)所述载体为碳酸钙、硅藻土、活性炭、钙基膨润土中的任意一种；

更优选地，步骤4)所述载体为硅藻土。

优选地，步骤4)所述分散剂为十二烷基硫酸钠、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、木质素磺酸钠中的任意一种；

更优选地，步骤4)所述分散剂为可溶性淀粉。

优选地，步骤4)所述紫外保护剂为腐殖酸、糊精、海藻酸钠、甲基纤维素中的任意一种；

更优选地，步骤4)所述紫外保护剂为腐殖酸。

上述方法制备的生防菌剂菌活量为6.2-6.9×10 ¹²cfu/g。

所述微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)Actin-1是从山东省烟台市果园土壤中分离、纯化、筛选得到的，保藏编号为CGMCC NO.13927，分类命名为微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus；

所述微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)Actin-1生长温度范围为15-45℃，最适生长温度为30℃；耐受pH值范围为3.0-10.0，最适生长pH值为7.0；可耐受1-10％的氯化钠溶液，生长良好，在浓度为3-5％时生长最好；能够在多种培养基上生长；

所述微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)Actin-1对苹果树腐烂病病原菌的抑菌率为89.82％；对贝伦格葡萄座腔菌、链格孢苹果专化型、恶疫霉、樱桃链格孢菌、大丽轮枝菌、樱桃球腔菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、苹果链格孢等多种病原菌具有较好的抑菌效果，抑菌率为76.08-87.10％，具有广谱抑菌性；

所述微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)Actin-1在以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为唯一碳源的基础培养基(液体和琼脂)中能够正常生长、繁殖，具有以下特性：

1)诱导自身产生多种胞外水解酶，其中几丁质酶活性峰值为140.26U/mL；β-1,3-葡聚糖酶活性峰值为49.46U/mL；多酚氧化酶活性峰值为39.25U/mL；蛋白酶活性峰值为10.90U/mL；

2)对苹果树腐烂病病原菌的孢子萌发有抑制作用：无菌水对照处理，苹果树腐烂病病原菌孢子萌发率为98.60％，而加入微白黄链霉菌粗酶液处理，苹果树腐烂病病原菌孢子萌发率仅仅为3.60％，较对照抑制率提高96.35％；

3)对苹果树腐烂病病原菌菌丝体有明显的溶解作用：与无菌水比较，72h时粗酶液处理的病原菌气生菌丝体下陷，溶菌圈直径可达6mm，产生明显溶解作用。蛋白酶K溶解作用最显著，溶解圈直径为10mm。而无菌水对照CK未出现菌丝溶解现象，仅表现出水滴作用的压痕；

4)对苹果树腐烂病病原菌有显著的抑菌效果：能产生活性较强的抑菌物质，抑菌率可达96.7％；

所述微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)Actin-1经传30代后，对苹果树腐烂病病原菌及其他病原菌的抑菌活性与微白黄链霉菌Actin-1第1代抑菌率基本一致，表明本发明所述的微白黄链霉菌Actin-1不会随传代次数的增加而降低抑制活性，具有较高的遗传稳定性。

有益效果：

1.本发明生防菌剂中微白黄链霉菌Actin-1可以以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，利于生防菌在苹果树腐烂病斑处长期定殖，发挥长期的生物防治作用，同时诱导自身产生多种胞外细胞壁水解酶，通过协同酶溶作用使病原菌细胞崩解，并且能够产生较强的抗菌活性物质，对苹果树腐烂病病原菌生长产生抑制作用，多种机制共同作用阻止苹果树腐烂病病原菌的生长、繁殖，大大提高了对苹果树腐烂病的生防效果。

2.本发明生防菌剂中微白黄链霉菌Actin-1对苹果树腐烂病病原菌的抑菌率为89.82％；对贝伦格葡萄座腔菌、链格孢苹果专化型、恶疫霉、樱桃链格孢菌、大丽轮枝菌、樱桃球腔菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、苹果链格孢等多种病原菌具有较好的抑菌效果，抑菌率为76.08-87.10％，具有广谱抑菌性；

3.本发明生防菌剂中微白黄链霉菌Actin-1耐受温度高，可以在45℃的条件下保持良好的生长状态，说明微白黄链霉菌Actin-1不仅在发酵过程中可以保持较强的菌种活力，另一方面也可以说明，其生防菌剂在应用于病原菌的防治过程中，不仅在常温条件下可以保持显著的抑菌效果，而且可以在高温天气，仍然保持良好的菌株活力以及抑菌效力，具有较强的耐候性。

4.本发明生防菌剂中微白黄链霉菌Actin-1具有耐酸性和耐碱性，在pH值3.0-10酸碱范围内，仍然呈现良好的生长状态，不仅在发酵过程中可以保持较强的菌种活力，在生防菌剂应用于病原菌的防治过程中，也可以抵抗外界不同的酸碱环境，同时保持较高的抑菌活力，耐酸碱性强。

5.本发明生防菌剂中微白黄链霉菌Actin-1经传30代后，对苹果树腐烂病病原菌及其他病原菌的抑菌活性与微白黄链霉菌Actin-1第1代抑菌率基本一致，表明微白黄链霉菌Actin-1不会随传代次数的增加而降低抑制活性，具有较高的遗传稳定性。

6.本发明生防菌剂中微白黄链霉菌Actin-1发酵活力高，通过液体发酵种子液和固体发酵及助剂的选择最终获得菌活量为6.2-6.9×10 ¹²cfu/g的生防菌剂，在苹果树腐烂病应用上防治效果达100％，复发率为零，同时该菌还可促进病斑伤口愈伤组织的愈合。再分离实验表明微白黄链霉菌Actin-1成功在苹果树腐烂病病斑出长期定殖，且定殖率很高。

本发明生防菌剂具有防治效果好(抑菌率高)、效率高(彻底降解病原菌细胞)、复发率低(病斑处定殖能力强)、适应环境能力强(耐高温、耐酸碱性强)、稳定强(遗传稳定性强)、不易产生抗药性等多重优点，是生物防治的首选，对提高苹果树腐烂病等果蔬病原菌的防治效果、防止病原菌复发、保护环境具有重要意义。

附图说明

图1实施例9对照组正常菌丝镜检图；

图2实施例9处理组变异菌丝镜检图；

图3生防菌剂治愈苹果树腐烂病病斑4年后的苹果树腐烂病病斑愈合效果图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)发酵种子液的制备：将微白黄链霉菌Actin-1菌种划线接种于高氏一号琼脂培养基斜面上，30℃培养7天至产孢；然后向斜面加入5mL无菌水，用灭菌接种针将孢子刮下，加入无菌水中，震荡混匀得孢子悬液；将所述孢子悬液按接种量1％(v/v)接种到液体种子培养基中，30℃，200r/min，摇瓶培养48h即得发酵种子液；

2)固体发酵培养基的制备：按照固体发酵培养基配方，先用部分水将K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O溶解，然后与其它原料混匀，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃；平铺于长70cm，宽50cm，深5cm灭菌后的曲盘中；

3)固体发酵：按体积质量比10％的接种量将步骤1)发酵种子液接种至步骤2)盛有固体发酵培养基的曲盘中；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度30℃、湿度65％培养24h后将麻包、报纸掀开，翻耙，然后依次将报纸、麻包覆盖，每24h重复操作一次；同样条件下继续培养至96h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、过120目筛即得微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉；

4)混匀：将步骤3)得到的微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉与载体、紫外保护剂、分散剂按质量比57:40:2:1均匀混合即得苹果树腐烂病生防菌剂。

步骤1)所述孢子悬液孢子浓度为1×10⁶个/mL；

步骤1)所述高氏一号琼脂培养基质量组成：可溶性淀粉：20g，K₂HPO₄·3H₂O：0.5g，NaCl：0.5g，KNO₃：1g，MgSO₄·7H₂O：0.5g，FeSO₄·7H₂O：0.01g，蒸馏水：1L，琼脂：20g，pH值7.3；

步骤1)所述液体种子培养基质量组成：玉米粉：10g，豆饼粉：10g，淀粉：10g，K₂HPO₄：0.2g，自来水：1L，pH值7.2；

步骤2)曲盘中料层厚度2cm；

步骤4)所述固体发酵培养基质量组成为：棉籽皮：160g，麸皮：280g，玉米粉：120g，豆饼粉120g，碳酸钙：10g，K₂HPO₄：2g，MgSO₄·7H₂O：2g，生石灰：5g，自来水：1L，pH值7.0；

步骤4)所述载体为硅藻土。

步骤4)所述分散剂为可溶性淀粉。

步骤4)所述紫外保护剂为腐殖酸。

所述微白黄链霉菌Actin-1保藏编号为CGMCC NO.13927，分类命名为微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus；

上述方法制备的生防菌剂菌活量为6.9×10¹²cfu/g。

实施例2

一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)发酵种子液的制备：将微白黄链霉菌Actin-1菌种划线接种于高氏一号琼脂培养基斜面上，28℃培养6天至产孢；然后向斜面加入5mL无菌水，用灭菌接种针将孢子刮下，加入无菌水中，震荡混匀得孢子悬液；将所述孢子悬液按接种量0.8％(v/v)接种到液体种子培养基中，28℃，180r/min，摇瓶培养46h即得发酵种子液；

2)固体发酵培养基的制备：按照固体发酵培养基配方，先用部分水将K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O溶解，然后与其它原料混匀，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃；平铺于长70cm，宽50cm，深5cm灭菌后的曲盘中；

3)固体发酵：按体积质量比10％的接种量将步骤1)发酵种子液接种至步骤2)盛有固体发酵培养基的曲盘中；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度28℃、湿度64％培养22h后将麻包、报纸掀开，翻耙，然后依次将报纸、麻包覆盖，每22h重复操作一次；同样条件下继续培养至94h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、过120目筛即得微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉；

4)混匀：将步骤3)得到的微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉与载体、紫外保护剂、分散剂按质量比53:36:1:0.8均匀混合即得苹果树腐烂病生防菌剂。

步骤1)所述孢子悬液孢子浓度为0.5×10⁶个/mL；

步骤1)所述高氏一号琼脂培养基质量组成：可溶性淀粉：20g，K₂HPO₄·3H₂O：0.5g，NaCl：0.5g，KNO₃：1g，MgSO₄·7H₂O：0.5g，FeSO₄·7H₂O：0.01g，蒸馏水：1L，琼脂：20g，pH值7.2；

步骤1)所述液体种子培养基质量组成：玉米粉：10g，豆饼粉：10g，淀粉：10g，K₂HPO₄：0.2g，自来水：1L，pH值7.2；

步骤2)曲盘中料层厚度1cm；

步骤4)所述固体发酵培养基质量组成为：棉籽皮：160g，麸皮：280g，玉米粉：120g，豆饼粉120g，碳酸钙：10g，K₂HPO₄：2g，MgSO₄·7H₂O：2g，生石灰：5g，自来水：1L，pH值7.0；

步骤4)所述载体为碳酸钙；

步骤4)所述分散剂为十二烷基硫酸钠；

步骤4)所述紫外保护剂为糊精；

所述微白黄链霉菌Actin-1保藏编号为CGMCC NO.13927，分类命名为微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus；

上述方法制备的生防菌剂菌活量为6.7×10 ¹²cfu/g。

实施例3

一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)发酵种子液的制备：将微白黄链霉菌Actin-1菌种划线接种于高氏一号琼脂培养基斜面上32℃培养8天至产孢；然后向斜面加入5mL无菌水，用灭菌接种针将孢子刮下，加入无菌水中，震荡混匀得孢子悬液；将所述孢子悬液按接种量1.2％(v/v)接种到液体种子培养基中，32℃，220r/min，摇瓶培养50h即得发酵种子液；

2)固体发酵培养基的制备：按照固体发酵培养基配方，先用部分水将K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O溶解，然后与其它原料混匀，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃；平铺于长70cm，宽50cm，深5cm灭菌后的曲盘中；

3)固体发酵：按体积质量比10％的接种量将步骤1)发酵种子液接种至步骤2)盛有固体发酵培养基的曲盘中；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度32℃、湿度66％培养26h后将麻包、报纸掀开，翻耙，然后依次将报纸、麻包覆盖，每26h重复操作一次；同样条件继续培养至98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、过120目筛即得微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉；

4)混匀：将步骤3)得到的微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉与载体、紫外保护剂、分散剂按质量比61:44:3:1.2均匀混合即得苹果树腐烂病生防菌剂。

步骤1)所述孢子悬液孢子浓度为1.5×10⁶个/mL；

步骤1)所述高氏一号琼脂培养基质量组成：可溶性淀粉：20g，K₂HPO₄·3H₂O：0.5g，NaCl：0.5g，KNO₃：1g，MgSO₄·7H₂O：0.5g，FeSO₄·7H₂O：0.01g，蒸馏水：1L，琼脂：20g，pH值7.4；

步骤1)所述液体种子培养基质量组成：玉米粉：10g，豆饼粉：10g，淀粉：10g，K₂HPO₄：0.2g，自来水：1L，pH值7.2；

步骤2)曲盘中料层厚度3cm；

步骤4)所述固体发酵培养基质量组成为：棉籽皮：160g，麸皮：280g，玉米粉：120g，豆饼粉120g，碳酸钙：10g，K₂HPO₄：2g，MgSO₄·7H₂O：2g，生石灰：5g，自来水：1L，pH值7.0；

步骤4)所述载体为活性炭；

步骤4)所述分散剂为羧甲基纤维素钠；

步骤4)所述紫外保护剂为海藻酸钠；

所述微白黄链霉菌Actin-1保藏编号为CGMCC NO.13927，分类命名为微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus；

上述方法制备的生防菌剂菌活量为6.6×10 ¹²cfu/g。

实施例4

一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)发酵种子液的制备：将微白黄链霉菌Actin-1菌种划线接种于高氏一号琼脂培养基斜面上，28℃培养8天至产孢；然后向斜面加入5mL无菌水，用灭菌接种针将孢子刮下，加入无菌水中，震荡混匀得孢子悬液；将所述孢子悬液按接种量0.8％(v/v)接种到液体种子培养基中，32℃，180r/min，摇瓶培养50h即得发酵种子液；

2)固体发酵培养基的制备：按照固体发酵培养基配方，先用部分水将K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O溶解，然后与其它原料混匀，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃；平铺于长70cm，宽50cm，深5cm灭菌后的曲盘中；

3)固体发酵：按体积质量比10％的接种量将步骤1)发酵种子液接种至步骤2)盛有固体发酵培养基的曲盘中；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度28℃、湿度66％培养26h后将麻包、报纸掀开，翻耙，然后依次将报纸、麻包覆盖，每22h重复操作一次；同样条件下继续培养至98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、过120目筛即得微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉；

4)混匀：将步骤3)得到的微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉与载体、紫外保护剂、分散剂按质量比53:44:1:1.2均匀混合即得苹果树腐烂病生防菌剂。

步骤1)所述孢子悬液孢子浓度为1×10⁶个/mL；

步骤1)所述高氏一号琼脂培养基质量组成：可溶性淀粉：20g，K₂HPO₄·3H₂O：0.5g，NaCl：0.5g，KNO₃：1g，MgSO₄·7H₂O：0.5g，FeSO₄·7H₂O：0.01g，蒸馏水：1L，琼脂：20g，pH值7.2；

步骤1)所述液体种子培养基质量组成：玉米粉：10g，豆饼粉：10g，淀粉：10g，K₂HPO₄：0.2g，自来水：1L，pH值7.2；

步骤2)曲盘中料层厚度1cm；

步骤4)所述固体发酵培养基质量组成为：棉籽皮：160g，麸皮：280g，玉米粉：120g，豆饼粉120g，碳酸钙：10g，K₂HPO₄：2g，MgSO₄·7H₂O：2g，生石灰：5g，自来水：1L，pH值7.0；

步骤4)所述载体为钙基膨润土；

步骤4)所述分散剂为木质素；

步骤4)所述紫外保护剂为甲基纤维素；

所述微白黄链霉菌Actin-1保藏编号为CGMCC NO.13927，分类命名为微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus；

上述方法制备的生防菌剂菌活量为6.5×10 ¹²cfu/g。

实施例5

一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)发酵种子液的制备：将微白黄链霉菌Actin-1菌种划线接种于高氏一号琼脂培养基斜面上，32℃培养6天至产孢；然后向斜面加入5mL无菌水，用灭菌接种针将孢子刮下，加入无菌水中，震荡混匀得孢子悬液；将所述孢子悬液按接种量1.2％(v/v)接种到液体种子培养基中，28℃，220r/min，摇瓶培养46h即得发酵种子液；

2)固体发酵培养基的制备：按照固体发酵培养基配方，先用部分水将K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O溶解，然后与其它原料混匀，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃；平铺于长70cm，宽50cm，深5cm灭菌后的曲盘中；

3)固体发酵：按体积质量比10％的接种量将步骤1)发酵种子液接种至步骤2)盛有固体发酵培养基的曲盘中；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度32℃、湿度64％培养22h后将麻包、报纸掀开，翻耙，然后依次将报纸、麻包覆盖，每26h重复操作一次；同样条件下继续培养至94h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、过120目筛即得微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉；

4)混匀：将步骤3)得到的微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉与载体、紫外保护剂、分散剂按质量比61:36:3:0.8均匀混合即得苹果树腐烂病生防菌剂。

步骤1)所述孢子悬液孢子浓度为1.5×10⁶个/mL；

步骤1)所述高氏一号琼脂培养基质量组成：可溶性淀粉：20g，K₂HPO₄·3H₂O：0.5g，NaCl：0.5g，KNO₃：1g，MgSO₄·7H₂O：0.5g，FeSO₄·7H₂O：0.01g，蒸馏水：1L，琼脂：20g，pH值7.2；

步骤1)所述液体种子培养基质量组成：玉米粉：10g，豆饼粉：10g，淀粉：10g，K₂HPO₄：0.2g，自来水：1L，pH值7.2；

步骤2)曲盘中料层厚度3cm；

步骤4)所述固体发酵培养基质量组成为：棉籽皮：160g，麸皮：280g，玉米粉：120g，豆饼粉120g，碳酸钙：10g，K₂HPO₄：2g，MgSO₄·7H₂O：2g，生石灰：5g，自来水：1L，pH值7.0；

步骤4)所述载体为碳酸钙；

步骤4)所述分散剂为羧甲基纤维素钠；

步骤4)所述紫外保护剂为甲基纤维素；

所述微白黄链霉菌Actin-1保藏编号为CGMCC NO.13927，分类命名为微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus；

上述方法制备的生防菌剂菌活量为6.3×10 ¹²cfu/g。

实施例6

一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，步骤及工艺参数同实施例1；

制备过程中高氏一号琼脂培养基、液体种子培养基、固体发酵培养基质量组成同实施例1；

制备过程中载体、分散剂、紫外保护剂为本领域常规市售产品；

所述微白黄链霉菌Actin-1保藏编号为CGMCC NO.13927，分类命名为微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus；

上述方法制备的生防菌剂菌活量为6.2×10 ¹²cfu/g。

实施例7 微白黄链霉菌Actin-1生长温度及耐酸碱试验

微白黄链霉菌Actin-1孢子悬液的制备：将微白黄链霉菌Actin-1划线接种于高氏一号琼脂培养基斜面上，30℃培养7天至产孢；加入5mL无菌水，用灭菌接种针将孢子刮入无菌水中，震荡混匀，调整孢子浓度为1×10⁶个/mL得到孢子悬液。

1.生长温度试验

配制2216E液体培养基，分装于48个500mL三角瓶中，100mL/瓶，121℃灭菌30min，备用；将上述孢子悬液按照5‰(V/V)接种于其中的36个三角瓶中，作为处理组，不接种的12个三角瓶作为对照组，按照0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃温度梯度分组，每组3个处理1个对照进行恒温培养，培养条件200rpm震荡培养5天，观察并记录各温度下微白黄链霉菌Actin-1的生长情况。结果见表7。

2.耐酸碱性试验

用稀HCl或NaOH溶液将2216E液体培养基调节成不同pH值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)，每个pH值2216E液体培养基分装4个500mL三角瓶中，100mL/瓶，于121℃灭菌30min。将上述孢子悬液按5‰(V/V)分别接种到上述装有不同pH值的2216E液体培养基中。每个pH值液体培养基接种3个，设为处理组，1个不接种，设为对照组，全部于30℃，200rpm震荡培养5天，记录各pH值下微白黄链霉菌Actin-1生长情况。结果见表1。

表1微白黄链霉菌Actin-1生长温度及耐酸碱结果

注：“+”代表生长，“-”代表不生长，“++”代表生长良好，“+++”代表生长茂盛。

由表1可以看出，微白黄链霉菌Actin-1具有较强的耐热性，可以在45℃的条件生长，由此说明，微白黄链霉菌Actin-1不仅在常温条件下可以保持显著的抑菌效果，而且可以在高温的天气，仍然保持良好的菌株活力以及抑菌效力。

微白黄链霉菌Actin-1具有耐酸性以及极强的耐碱性，在pH值3.0-10.0的酸碱胁迫下，能够生长，说明微白黄链霉菌Actin-1不仅在发酵过程中可以保持较强的菌种活力，而且在生防菌剂应用于病原菌的防治过程中，也可以抵抗外界不同的酸碱环境，从而保持较高的抑菌活力。

实施例8 微白黄链霉菌Actin-1广谱抑菌性验证及遗传稳定性试验：

进行微白黄链霉菌Actin-1对苹果树腐烂病病原菌(苹果黑腐皮壳菌)、苹果斑点落叶病病原菌(链格孢苹果专化型)等11株病原菌的抑菌实验，具体操作步骤如下：

1)将微白黄链霉菌Actin-1划线接种于高氏一号琼脂培养基平板，于30℃培养5天；将苹果树腐烂病病原菌点接于PDA培养基平板，于28℃培养7天；获得活化微白黄链霉菌Actin-1和活化病原菌；

2)对峙实验二：在直径90mm的PDA培养基平板背面画十字，以十字交叉点为平板圆心，在十字线上距圆心25mm处3个点分别接种3个6mm的活化微白黄链霉菌Actin-1菌饼作为处理组，第4个点不接菌作为对照组；在圆心处接种1个6mm的活化病原菌菌饼；分别置于30℃培养7天，分别统计对照病原菌半径和处理病原菌半径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照病原菌半径mm-处理病原菌半径mm)/对照病原菌半径mm×100。

将微白黄链霉菌Actin-1进行传代培养，并测定第10代菌、第20代菌和第30代菌对苹果树腐烂病病原菌(苹果黑腐皮壳菌)及贝伦格葡萄座腔菌、链格孢苹果专化型、恶疫霉、樱桃链格孢菌、大丽轮枝菌、樱桃球腔菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、苹果链格孢等其他10种病害病原菌的抑菌率，结果见表2，实验方法同上。

表2微白黄链霉菌Actin-1不同传代菌株对11种病原菌的抑菌率

可以看出，微白黄链霉菌Actin-1不仅对苹果树腐烂病病原菌有很强的抑制能力，对贝伦格葡萄座腔菌、链格孢苹果专化型、恶疫霉、樱桃链格孢菌、大丽轮枝菌、樱桃球腔菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、苹果链格孢等10种果蔬病原菌的抑制能力也很强，具有广谱抑菌性。

经传代10代、20代、30代的微白黄链菌菌株Actin-1对11种病原菌的抑菌率与第一代相比几乎没有降低，表明本发明所述的微白黄链霉菌Actin-1不会随传代次数的增加而降低对上述病原菌的抑制活性，具有较高的遗传稳定性。

实施例9 微白黄链霉菌Actin-1对苹果树腐烂病病原菌菌丝的影响

挑取实施例8中微白黄链霉菌Actin-1对苹果树腐烂病病原菌对峙实验二平板处理组边缘菌丝及空白对照组菌丝进行40倍镜检，镜检结果分别见图2和图1，镜检结果表明处理组菌丝不正常的分支增多，菌丝顶端膨大分支变异，菌丝顶端或中间有泡囊产生，还有部分菌丝扭曲集结的现象，说明微白黄链霉菌Actin-1既能抑制苹果树腐烂病病原菌孢子的萌发也能使病原菌菌丝变异从而抑制病原菌菌丝生长。

实施例10 微白黄链霉菌Actin-1对苹果树腐烂病病原菌菌丝体的利用及诱导产酶研究

(1)苹果树腐烂病病原菌菌丝体的制备：将苹果树腐烂病病原菌点接于PDA培养基平板，28℃培养7天获得活化病原菌；挑取所述活化病原菌菌丝，接种到装有100mL察氏液体培养基的500m L摇瓶中，30℃、160rpm摇床振荡培养10天。用灭菌的双层纱布过滤收集菌丝体，用去离子水冲洗5-10次至无残留培养液，45℃烘干，研磨至细粉状，过60目筛即得；

所述PDA培养基质量组成为：马铃薯(200g)滤液：1L，葡萄糖：20g，琼脂：20g，pH值自然；

所述察氏液体培养基质量组成：NaN0₃：3g，K₂HPO₄：1g，MgSO₄·7H₂O：0.5g，KCl：0.5g，FeSO₄·7H₂O：0.01g，蔗糖：30g，蒸馏水：1L，pH值自然；

(2)粗酶液的制备方法为：

将微白黄链霉菌Actin-1划线接种于高氏一号琼脂培养基平板，30℃培养7天获得活化链霉菌；并用接种环接种一环到装有100m L的液体培养基A、B、C、D的500m L三角瓶中，每种培养基设3个重复，30℃、160rpm摇床培养，在第3、5、7和9天于超净台上用无菌吸管吸出20m L培养液，将少量无菌脱脂棉置于漏斗底部过滤孢子，滤液于4 000rpm离心5min，上清液即为粗酶液；

所述基础液体培养基A质量组成为：苹果树腐烂病病原菌菌丝体：10g，K₂HPO₄·3H₂O：0.5g，KNO₃：1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO4·7H₂O：10mg，蒸馏水：1L，pH值自然；

所述基础液体培养基B质量组成为：胶体几丁质：10g，K₂HPO₄·3H₂O：0.5g，KNO₃：1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O：10mg，蒸馏水：1L，pH值自然；

所述基础液体培养基C质量组成为：淀粉：10g，K₂HPO₄·3H₂O：0.5g，KNO₃：1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O：10mg，蒸馏水：1L，pH值自然；

所述基础液体培养基D质量组成为：酵母菌粉：10g，K₂HPO₄·3H₂O：0.5g，KNO₃：1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O：10mg，蒸馏水：1L，pH值自然；

所需说明的是：基础液体培养基A所制备的粗酶液测定胞外几丁质酶(Chitinase)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucosidase)、多酚氧化酶(PPO)及蛋白酶(Protease)活性；基础液体培养基B制备的粗酶液测定以胶体几丁质作为几丁质酶诱导时所产生的几丁质酶活性；基础液体培养基C制备的粗酶液测定以淀粉作为β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶诱导物时产生的β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶活性；基础液体培养基D制备的粗酶液以酵母菌粉作为蛋白酶诱导物时产生的蛋白酶活性；

a.几丁质酶活性测定：取1m L粗酶液，加1m L 10g/L的胶体几丁质，混匀后置于37℃恒温水浴中水解3h，沸水浴中煮5min终止反应，反应液于4 000rpm离心5min，取1mL上清液或稀释液用DNS法测定水解液中N-乙酰氨基葡萄糖含量。

将37℃时1m L酶液在1h内水解几丁质产生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的几丁质酶活性定义为1U。

结果：基础液体培养基A中添加苹果树腐烂病病原菌菌丝体作为唯一碳能源时，微白黄链霉菌Actin-1培养液中可检出几丁质酶活性，酶活较高。不同培养时间微白黄链霉菌Actin-1粗酶液的几丁质酶活性不同，随培养时间增加，几丁质酶活性增加，第5天，酶活达峰值，为140.26U/mL，达酶活性峰值后随培养时间增加酶活性降低；在基础液体培养基B中以胶体几丁质为诱导时酶活也是第5天达峰值，为120.47U/mL，低于病原菌菌丝体的粗酶液的几丁质酶活性。

b.β-1,3-葡聚糖酶活性测定：取0.5mL粗酶液，加入0.5m L 10g/L的昆布多糖，混匀后置于45℃恒温水浴中水解30min。将水解液置于沸水浴中5min终止反应。取1mL水解液或稀释液用DNS法测定水解液中葡萄糖含量。

将45℃时1mL酶液在1min内水解昆布多糖产生1μg葡萄糖的β-1,3-葡聚糖酶活性定义为1U。

结果：基础液体培养基A中添加苹果树腐烂病病原菌菌丝体作为唯一碳能源时，微白黄链霉菌Actin-1培养液中可检出β-1,3-葡聚糖酶活性，酶活较高。酶活性随着培养时间增加而增加，在第7天时酶活达到峰值49.46U/mL，达到峰值后随着培养时间增加，酶活降低；当基础液体培养基C中以淀粉为诱导物时，酶活峰值比以菌丝体为碳源时稍高，达50.25U/mL。

c.多酚氧化酶活性测定：取0.02mol/L的邻苯二酚溶液3mL、0.1mol/L的醋酸盐缓冲液(pH值4.8)3mL、粗酶液1mL加入到试管中，充分摇匀，于30℃恒温水浴中水解10min，在400nm波长下测定吸光度值，以每分OD值变化0.01定义为1U；

结果：基础液体培养基A中添加苹果树腐烂病病原菌菌丝体作为唯一碳能源时，微白黄链霉菌Actin-1粗酶液中可检出多酚氧化酶活性。酶活性随培养时间增加而增高，第7天时酶活性达峰值39.25U/mL，达峰值后随培养时间增加酶活降低。当基础液体培养基C中以淀粉为诱导物时,第5天多酚氧化酶的活性达峰值，为24.91U/mL，低于菌丝体为唯一碳源时的多酚氧化酶活性。

d.蛋白酶活测定：福林试剂法，将1mL粗酶液40℃1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的蛋白酶活性定义为1U。

结果：基础培养基A中添加苹果树腐烂病病原菌菌丝体作为唯一碳氮能源时,微白黄链霉菌Actin-1培养液中可检出蛋白酶活性。培养第7天时的酶活性为10.90U/mL，表明苹果树腐烂病病原菌丝体对微白黄链霉菌Actin-1的蛋白酶合成有诱导作用。微白黄链霉菌Actin-1在基础培养基D中以酵母粉作为碳氮能源时蛋白酶活性第7天达峰值，为9.90Um/L，与以病原菌菌丝体诱导产生的蛋白酶活性差异不大。

表3微白黄链霉菌Actin-1 4种水解酶峰值活性(U/mL)

(3)微白黄链霉菌Actin-1粗酶液在皿内对病原菌气生菌丝的溶解作用：

将苹果树腐烂病病原菌点接于PDA培养基平板，28℃培养7天，用无菌水洗脱、刮取孢子和菌丝于装有搅拌子的三角瓶中，得到含苹果树腐烂病病原菌孢子和菌丝的悬液，震荡、磁力搅拌使孢子充分分散，过滤除去菌丝得孢子悬液，用无菌水稀释使孢子含量为1×10⁷个/mL得苹果树腐烂病病原菌孢子悬液；将其均匀涂布于PDA平板上，28℃下培养8天，待平皿培养基表面均匀长满气生菌丝后，用微量移液器分别吸取50μL步骤(2)中用基础液体培养基A所制备的第3天、5天、7天和9天的微白黄链霉菌Actin-1的粗酶液，以点滴方式滴加于平皿内气生菌丝表面，同时以10mg/L的蛋白酶K及无菌水为对照，30℃培养72h，观察病原菌气生菌丝溶解现象。

结果：微白黄链霉菌Actin-1对苹果树腐烂病病原菌菌丝有明显的溶解作用，与无菌水比较，72h时观察，粗酶液处理的病原菌气生菌丝体下陷，溶菌圈直径可达6mm，产生明显溶解作用。蛋白酶K溶解作用最显著，溶解圈直径为10mm。而无菌水对照CK未出现菌丝溶解现象，仅表现出水滴作用的压痕。说明微白黄链霉菌Actin-1在苹果树腐烂病病原菌菌丝体诱导下合成水解酶以及蛋白酶都参与了溶解病原菌的作用。

(4)微白黄链霉菌Actin-1粗酶液对苹果树腐烂病病原菌孢子萌发的影响

苹果树腐烂病病原菌孢子悬液的制备：同步骤(3)；

孢子萌发实验：取步骤(2)中用基础液体培养基A培养7天所制备的微白黄链霉菌Actin-1的粗酶液2mL按照1:4(V/V)的比例与无菌水混合，同时接入100μL上述苹果树腐烂病病原菌孢子悬液，以无菌水为对照，30℃避光培养18h后，取50μL萌发悬液在40倍镜下观察孢子萌发情况，并按公式计算萌发率及抑制率；

萌发率(％)＝萌发孢子数/总孢子数×100

抑制率(％)＝(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100

结果：基础液体培养基A培养7天所制备的微白黄链霉菌Actin-1的粗酶液对苹果树腐烂病病原菌的孢子萌发有抑制作用。无菌水对照处理，苹果树腐烂病病原菌孢子萌发率为98.60％，而加入微白黄链霉菌Actin-1粗酶液处理的苹果树腐烂病病原菌孢子萌发率仅仅为3.60％，较对照抑制率提高96.35％；

(5)苹果树腐烂病病原菌菌丝体添加量对微白黄链霉菌Actin-1产抑菌活性物质的影响

将基础液体培养基A中苹果树腐烂病病原菌菌丝体量分别设置为5g/L、10g/L、20g/L三个浓度处理，将微白黄链霉菌Actin-1分别接种到装有100mL上述三个浓度液体培养的500mL三角瓶中，30℃、160rpm摇床培养7天，发酵液用无菌0.22μm滤膜过滤器过滤获得无菌滤液。将无菌滤液按照10％(V/V)比例与冷却至50℃左右的PDA培养基进行混合，以10％(V/V)无菌水为对照，制成平板，于平板中央接种6mm苹果树腐烂病病原菌菌饼，每种处理3个重复，7天后，计算抑菌率。

抑菌率％＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-6mm)

结果：如表4所示不同菌丝体用量时的抑菌率均在培养第7天时最高。分别为52.1％，83.4％和96.7％。随着菌丝体量增加抑菌率提高。说明菌丝体可诱导微白黄链霉菌Actin-1抑菌物质的产生。

表4不同菌丝体添加量无菌液抑菌率(％)

结论：以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为唯一碳源时，可诱导微白黄链霉菌Actin-1同步合成几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、多酚氧化酶以及蛋白酶等真菌细胞壁溶解酶；大大提高了微白黄链霉菌Actin-1对苹果树腐烂病的防治效果；微白黄链霉菌Actin-1粗酶液对苹果树腐烂病病原菌菌丝有溶解作用。以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为碳源时微白黄链霉菌Actin-1能产生活性较强的抑菌物质，抑菌率可达96.7％。

可知，在苹果树腐烂病病灶处施用微白黄链霉菌Actin-1生防菌剂时,当苹果树腐烂病病原菌菌丝体与微白黄链霉菌Actin-1接触，微白黄链霉菌Actin-1会以其为碳源生长，并诱导合成多种胞外细胞壁水解酶，通过协同酶溶作用是病原菌细胞崩解，同时产生抗菌活性物质对苹果树腐烂病菌生长产生抑制作用，两种机制共同作用组织苹果树腐烂病病原菌的繁殖，提高微白黄链霉菌Actin-1对苹果树腐烂病的生防效果。

实施例11 实验室内苹果树离体枝条生防实验

(1)离体枝条实验方法：

微白黄链霉菌Actin-1培养滤液的制备方法：

培养滤液制备：接种5％(V/V)微白黄链霉菌Actin-1孢子悬液，制备方法同实施例2，于盛有50m L高氏一号液体培养基的250m L三角瓶中，30℃、180rpm摇床震荡培养8天。发酵结束后，先将发酵液4000rpm离心后，上层发酵清液经定性滤纸粗滤，再用装有直径为0.45μm滤膜的砂芯过滤器抽滤，最后再用装有直径为0.22μm滤膜的无菌细菌滤器过滤，即得到培养滤液，装入灭菌三角瓶中于4℃冰箱保藏备用。

微白黄链霉菌Actin-1菌饼和培养滤液对苹果树腐烂病的防治效果-离体枝条实验；

采集试验田1-2年生富士苹果枝条，剪取40cm长、粗细一致的枝段，用75％乙醇进行表面消毒，然后用灭菌水冲洗干净，两端用湿润的脱脂棉保湿。用直径6mm的打孔器烧红后打孔，每个枝条2个孔，作为接种点：

实验1(预防保护作用)：向上述接种点接种微白黄链霉菌Actin-1菌饼，以接种空白培养基PDA为阴性对照，两天后去除菌饼并接种旺盛生长的苹果树腐烂病菌菌饼，该处理设为处理1；向上述接种点涂抹培养滤液，以涂抹无菌水作为阴性对照，涂抹0.5g/L的苯醚甲环唑溶液作为阳性对照(向接种孔中先涂抹100μL，室温晾干，再涂抹100μL，室温晾干)，晾干后当天接种旺盛生长的苹果树腐烂病菌菌饼，该处理设为处理2；每个枝条2个接种点，每处理设置3个重复，每个处理组6个接种点，上述接种点用保鲜膜保湿72h，于25℃恒温培养箱中培养3-14天，观察苹果树腐烂病的发生情况，测量病斑大小，计算病斑面积和防治效果，见表4。

实验2(治理作用)：向上述接种点接种旺盛生长的苹果树腐烂病菌菌饼，保鲜膜保湿2天后，去掉腐烂病菌菌饼，然后接种微白黄链霉菌Actin-1菌饼，以接种空白培养基PDA为阴性对照，该处理设为处理1；向上述接种点接种旺盛生长的苹果树腐烂病菌菌饼，保鲜膜保湿2天后，去掉腐烂病菌菌饼，涂抹培养滤液，以涂抹无菌水作为阴性对照，涂抹0.5g/L的苯醚甲环唑溶液作为阳性对照(向接种孔中先涂抹100μL，室温晾干，再涂抹100μL，室温晾干)每个枝条2个接种点，每处理设置3个重复，每个处理6个接种点，。上述接种点用保鲜膜保湿72h，于25℃恒温培养箱中培养3-14天，观察苹果树腐烂病的发生情况，测量病斑大小，计算病斑面积和防治效果。见表5。

病斑面积＝1/4×Π×长径×短径

防治效果(％)＝[(对照病斑面积－菌饼面积)－(处理病斑面积－菌饼面积)]/(对照病斑面积－菌饼面积)×100

表4.微白黄链霉菌Actin-1对离体枝条苹果树腐烂病的保护作用

注：同一列数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平；

表5.微白黄链霉菌Actin-1对离体枝条苹果树腐烂病的治疗作用

注：同一列数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平；

可以看出，预防保护作用菌饼和培养滤液防效差异不大，均可达95％以上，菌饼防效为95.50％，培养滤液为95.12％。治疗效果二者相近，菌饼对苹果树腐烂病离体枝条治疗效果达86.05％，培养滤液治疗效果达83.48％，与化学药剂苯醚甲环唑效果相当。

实施例12 本发明生防菌剂对苹果树腐烂病的防治作用-田间实验

田间试验设计：共4个处理，取本发明实施例1制备的，按照生防菌剂:净土(m/m)＝1:1、生防菌剂:净土(m/m)＝1:5、生防菌剂:净土(m/m)＝1:10复配，设为处理组；对照组仅仅为净土。试验地点在陕西省宝鸡市千阳县陕西枫丹百丽苹果园进行，试树品种为5年生“富士”。

(1)通过田间实验，验证微白黄链霉菌对苹果树腐烂病的保护和治疗效果

预防保护作用：5年生，长势相近的富士苹果树，主枝上用6mm打孔器打孔造成新鲜伤口2cm²，将以上4种处理微白黄链霉菌Actin-1生防菌剂用适量水和成泥状，贴到伤口出处，菌泥的厚度为1.5cm左右，用保鲜膜包裹保湿，3天后，接种旺盛生长的苹果树腐烂病菌饼，用保鲜膜包裹保湿，7天后，除去保鲜膜。每处理3个重复，每重复6棵树。4周后观测腐烂病的发病情况，计算发病率、病斑面积和防治效果；结果如表6。

治疗作用：5年生、长势相近的富士苹果树，主枝上用6mm打孔器打孔造成新鲜伤口2cm²，接种旺盛生长的苹果树腐烂病菌饼，用保鲜膜包裹保湿，3天后，去除腐烂病病原菌菌饼，将以上4种处理的微白黄链霉菌Actin-1生防菌剂用适量水和成泥状，贴到伤口出处菌泥的厚度为1.5cm左右，用保鲜膜包裹保湿，7天后，除去保鲜膜。每处理3个重复，每重复6棵树。4周后观测腐烂病的发病情况，计算发病率、病斑面积和治疗效果；结果如表7。

发病率(％)＝病株树/总株数

病斑面积＝1/4×Π×长径×短径

防治效果(％)＝[(对照病斑面积－菌饼面积)－(处理病斑面积－菌饼面积)]/(对照病斑面积－菌饼面积)×100

表6田间微白黄链霉菌对苹果树腐烂病的保护作用

注：同一列数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平；

表7田间微白黄链霉菌对苹果树腐烂病的治疗作用

注：同一列数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平；

田间保护效果显示，微白黄链霉菌Actin-1生防菌剂与净土以比例1：1和1:5混合作用时，只有一棵树染病，预防效果显著，当比例为1:10时，病株树增加1棵，效果也较好。治疗效果显示，微白黄链霉菌Actin-1生防菌剂与净土以比例1：1和1:5混合作用时，苹果树发病率为16.67％，防治效果分别达87.80％和87.60％，治疗果显著，当比例为1:10时，防治效果略低，但是也达到95.23％，于对照相比，效果显著；说明微白黄链霉菌Actin-1可有效抑制腐烂病菌的侵入和扩展，对苹果树腐烂病田间防治作用极为明显。

需要说明的是本发明实施例2-6所制备的生防菌剂同样具有上述效果，各实施例之间效果差异性不大。

实施例13 通过田间实验微白黄链霉菌对苹果树腐烂病病斑的愈合效果

田间腐烂病树病斑的刮除治疗实验：将病斑部位及其周围1cm健康部位用刮刀刮至韧皮部，然后将实施例1制备的生防菌剂与净土1:1混合均匀，用水和成泥状，贴到腐烂病疤处，菌泥的厚度为1.5cm，后裹上黑色塑料薄膜保湿，3棵/组，共9棵，同时以净土和泥作为对照，3棵/组，共9棵，开始每个月进行一次调查，后期半年或一年进行一次调查。记录病斑复发情况并测量愈伤组织的宽度，计算防治效果，结果见表8。

防治效果(％)＝(对照复发率-处理复发率)/对照复发率×100

半年后观察18块病斑，对照组9块全部复发，且病斑面积随时间延长增大，处理组没有复发病斑，防效达100％。处理组平均伤组织宽6.36cm，两年后愈伤组织宽10.23cm，四年后，愈伤组织17.3cm，且没有复发，见图3；说明微白黄链霉菌Actin-1生防菌剂对苹果树腐烂病的治疗效果有效且持久；

表8微白黄链霉菌对田间苹果树腐烂病病斑的愈伤效果

注：同一列数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平；

需要说明的是本发明实施例2-6所制备的生防菌剂同样具有上述效果，各实施例之间效果差异性不大。

实施例14 微白黄链霉菌Actin-1定殖能力检测

将实施例13处理组的9棵苹果树半年后愈伤组织边缘皮剥取下来，带回实验室保湿，分离培养，结果9株树上均分离到Streptomyces albidoflavus Actin-1，说明该菌可以定殖于苹果树干，且定殖率很高，能长期发挥防治作用。

具体操作如下：取回的苹果树腐烂病愈伤组织树皮用自来水冲洗干净，剪成0.25cm²小块，置于75％酒精中浸泡30s，再用4％次氯酸钠表面消毒3.5min后，放入灭菌水中冲洗4次，每次至少1min，用灭菌滤纸吸干多余水分后，每4个小块用灭菌研磨器研磨，再用无菌水稀释涂布于高氏一号琼脂培养基中，每个组织3个重复，30℃培养3-10天。以最后一次冲洗的灭菌水涂布于高氏一号培养基上，验证组织表面消毒情况。

结果：9棵苹果树均分离到链霉菌，将对分离得到的链霉菌进行形态学和分子鉴定，并与Streptomyces albidoflavus Actin-1进行序列比对，最终得到的链霉菌与Actin-1序列同源性均为100％，可知，分离得到的链霉菌是微白黄链霉菌Actin-1。

可知，本发明所用微白黄链霉菌不仅实验室内对苹果树腐烂病防治效果较好，田间防治效果及愈伤效果均较为理想，可应用于腐烂病多发的地区苹果果园。

需要说明的是本发明实施例2-6所制备的生防菌剂同样具有上述效果，各实施例之间效果差异性不大。

Claims (10)

1.一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)发酵种子液的制备：将微白黄链霉菌Actin-1菌种划线接种于高氏一号琼脂培养基斜面上，28-32℃培养6-8天至产孢；然后向斜面加入5mL无菌水，用灭菌接种针将孢子刮下，加入无菌水中，震荡混匀得孢子悬液；将所述孢子悬液按接种量0.8-1.2％(v/v)接种到液体种子培养基中，28-32℃，180-220r/min，摇瓶培养46-50h即得发酵种子液；

2)固体发酵培养基的制备：按照固体发酵培养基配方，先用部分水将K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O溶解，然后与其它原料混匀，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃；平铺于长70cm，宽50cm，深5cm灭菌后的曲盘中；

3)固体发酵：按体积质量比10％的接种量将步骤1)发酵种子液接种至步骤2)盛有固体发酵培养基的曲盘中；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度28-32℃、湿度64-66％培养22-26h后将麻包、报纸掀开，翻耙，然后依次将报纸、麻包覆盖，每22-26h重复操作一次；同样条件下继续培养至94-98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、过120目筛即得微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉；

4)混匀：将步骤3)得到的微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉与载体、紫外保护剂、分散剂按质量比53-61:36-44:1-3:0.8-1.2均匀混合即得苹果树腐烂病生防菌剂；

所述微白黄链霉菌Actin-1保藏编号为CGMCC NO.13927，分类命名为微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus；

步骤1)所述液体种子培养基质量组成：玉米粉：10g，豆饼粉：10g，淀粉：10g，K₂HPO₄：0.2g，自来水：1L，pH值7.2；

步骤4)所述固体发酵培养基质量组成为：棉籽皮：160g，麸皮：280g，玉米粉：120g，豆饼粉120g，碳酸钙：10g，K₂HPO₄：2g，MgSO₄·7H₂O：2g，生石灰：5g，自来水：1L，pH值7.0。

2.如权利要求1所述的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤1)所述孢子悬液孢子浓度为0.5-1.5×10⁶个/mL。

3.如权利要求1所述的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤2)曲盘中料层厚度1-3cm。

4.如权利要求1所述的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤4)所述载体为碳酸钙、硅藻土、活性炭、钙基膨润土中的任意一种。

5.如权利要求1所述的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤4)所述载体为硅藻土。

6.如权利要求1所述的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤4)所述分散剂为十二烷基硫酸钠、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、木质素磺酸钠中的任意一种。

7.如权利要求1所述的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤4)所述分散剂为可溶性淀粉。

8.如权利要求1所述的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤4)所述紫外保护剂为腐殖酸、糊精、海藻酸钠、甲基纤维素中的任意一种。

9.如权利要求1所述的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，其特征在于，步骤4)所述紫外保护剂为腐殖酸。

10.如权利要求1-9任一所述的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述生防菌剂菌活量为6.2-6.9×10 ¹²cfu/g。