CN112961784B - 一株内生链格孢菌Aa-Lcht及其在防治苹果树腐烂病中的用途 - Google Patents

一株内生链格孢菌Aa-Lcht及其在防治苹果树腐烂病中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体公开了一株内生链格孢菌Aa‑Lcht及其在防治苹果树腐烂病中的用途，所述内生链格孢菌Aa‑Lcht分类命名为链格孢菌(Alternaria alternata)。本发明获得的内生链格孢菌Aa‑Lcht对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制率可达93.33％，能有效的防治苹果树腐烂病。

Description

一株内生链格孢菌Aa-Lcht及其在防治苹果树腐烂病中的 用途
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株内生链格孢菌Aa-Lcht及其在防治苹果树腐烂病中的用途。
背景技术
由子囊菌苹果黑腐皮壳(Valsa mali)引起的苹果第一大病害——苹果树腐烂病在我国分布广泛，危害苹果枝干，发病严重时甚至会造成死树毁园，带来巨大的经济损失。目前对于苹果树腐烂病的防治主要还依赖化学药剂。长期使用化学药剂会带来农药残留、果园生态环境污染(水体、大气和土壤)、病原菌产生抗药性等问题。因此，探索开发苹果树腐烂病的生物防治资源尤为重要。然而，现有研究中，对于防治苹果树腐烂病的有效生物菌株较少，且防控效率也较低。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一株内生链格孢菌Aa-Lcht，该菌株对苹果树腐烂病菌有明显的拮抗抑制作用，对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制率可达93.33％。
本发明的第一个目的是提供了一株内生链格孢菌Aa-Lcht，所述内生链格孢菌Aa-Lcht于2021年01月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21456，分类命名为互隔交链孢霉 (Alternaria.alternata)。
本发明第二个目的是提供了上述内生链格孢菌Aa-Lcht在防治苹果树腐烂病中的用途。
本发明第三个目的是提供了由所述内生链格孢菌Aa-Lcht制备获得的培养滤液。
本发明第四个目的是提供了所述培养滤液Aa-Lcht的制备方法，制备过程为：无菌条件下用打孔器打取已培养4-6d的海棠内生链格孢菌饼，放入PDB 培养基中，25-28℃、150-170r·min-1培养8-10d后，用2-3层灭菌滤纸和0.22 μm微孔滤膜细菌过滤器过滤，获得培养滤液。
进一步的，具体制备过程中：将培养5d的海棠内生链格孢菌饼5个，放入100ml PDB培养基中，25℃、160r·min-1培养10d后，用2层灭菌滤纸和 0.22μm微孔滤膜细菌过滤器过滤，获得培养滤液。
本发明第五个目的是提供了所述内生链格孢菌Aa-Lcht培养滤液在防治苹果树腐烂病中的用途。
本发明还提供了一种包含所述的内生链格孢菌Aa-Lcht的制剂。
进一步地，所述制剂为内生链格孢菌Aa-Lcht菌体与无菌水的混合物。
本发明还提供了所述的包含内生链格孢菌Aa-Lcht的制剂在防治苹果树腐烂病中的用途。
进一步地，所述苹果树腐烂病是由苹果黑腐皮壳菌引起的。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明从海棠树皮中分离获得的内生链格孢菌Aa-Lcht于2021年01 月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.21456，分类命名为互隔交链孢霉(Alternaria alternata)，该菌株优先接种2d后对苹果树腐烂病菌生长的抑制率可达93.33％，能够有效防治苹果树腐烂病；
2、本发明获得的内生链格孢菌Aa-Lcht具有专一性和稳定性，对于苹果树腐烂病的枝条具有保护作用，保护效果可达64％，为后期生产病害预防保护制剂奠定基础。
3、本发明获得的内生链格孢菌Aa-Lcht制备得到的培养滤液，在含量为5.0％的情况下对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制率达到82.43％，且效果稳定。
生物材料保藏信息说明
Aa-Lcht，在本申请中称作内生链格孢菌Aa-Lcht，已于2021年01月28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCC No.21456，该菌株分类命名为互隔交链孢霉(Alternaria alternata)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1内生链格孢菌Aa-Lcht对苹果树腐烂病菌的抑制作用效果图；
图2为本发明实施例1内生链格孢菌Aa-Lcht的抑菌谱示意图；
图3为本发明实施例1内生链格孢菌Aa-Lcht对苹果树腐烂病菌拮抗前后的菌丝形态图；
其中，图3(a)表示拮抗前苹果树腐烂病菌的菌丝形态图；
图3(b)表示拮抗后苹果树腐烂病菌的菌丝形态图；
图4为本发明实施例1内生链格孢菌Aa-Lcht对苹果树腐烂病离体枝条保护治疗作用效果图；
其中，图4(a)表示内生链格孢菌Aa-Lcht对苹果树腐烂病的保护作用直观效果图；
a为对照组，b为处理组；
图4(b)表示内生链格孢菌Aa-Lcht对苹果树腐烂病的治疗作用直观效果图；
c为对照组，d为处理组；
图4(c)表示内生链格孢菌Aa-Lcht对苹果树腐烂病的保护作用效果统计分析图；
a为对照组，b为处理组；
图4(d)表示内生链格孢菌Aa-Lcht对苹果树腐烂病的治疗作用效果统计分析图；
c为对照组，d为处理组；
图5为不同含量的内生链格孢菌Aa-Lcht培养滤液对苹果树腐烂病菌的抑制作用；
其中，图5(a)表示不同含量的内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌抑制作用的菌落示意图；
图5(b)表示不同含量的链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌抑制率；
图6表示海棠内生链格孢培养滤液抑制苹果树腐烂病菌的热稳定性；
其中，图6(a)表示不同温度下10％内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌的抑制情况；
图6(b)表示不同温度下10％内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌的抑制率；
图7表示内生链格孢培养滤液抑制苹果树腐烂病菌的酸碱稳定性；
其中，图7(a)表示不同pH环境10％海棠内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌的抑制情况；
图7(b)表示不同pH环境10％内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌的抑制率；
图8表示内生链格孢培养滤液抑制苹果树腐烂病菌的紫外稳定性；
其中，图8(a)表示不同时长紫外照射下10％内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌的抑制情况；
图8(b)表示不同时长紫外照射下10％内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌的抑制率；
图9为本发明实施例1内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病保护治疗作用效果图；
其中，图9(a)表示链格孢培养滤液对苹果树腐烂病的保护作用直观效果图；
a为对照组，b为处理组；
图9(b)表示链格孢培养滤液对苹果树腐烂病的治疗作用直观效果图；
c为对照组，d为处理组；
图9(c)表示链格孢培养滤液对苹果树腐烂病的保护作用效果统计分析图；
a为对照组，b为处理组；
图9(d)表示链格孢培养滤液对苹果树腐烂病的治疗作用效果统计分析图；
c为对照组，d为处理组。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明提供了一株内生链格孢菌及其在防治苹果树腐烂病中的用途。
具体实施例如下：
实施例1
一、材料
(1)供试培养基
PDA培养基：称取去皮马铃薯200g，切成小块双蒸水煮沸至可戳散，四层纱布过滤煮沸液至1L的量杯，加入20g葡萄糖和15g琼脂搅拌均匀后双蒸水定容至1L，封口121℃高压灭菌25min待用。
PDB培养基：称取去皮马铃薯200g，切成小块双蒸水煮沸至可戳散，四层纱布过滤煮沸液至1L的量杯，加入20g葡萄糖搅拌均匀后双蒸水定容至1 L，封口121℃高压灭菌25min待用。
(2)供试菌株
供试内生链格孢菌株Aa-Lcht：由本实验室从健康海棠树皮中分离得到，经过鉴定确定其为链格孢菌(Alternaria alternata)，置于4℃小斜面保存；
供试病原菌：苹果树腐烂病菌(V.mali)，苹果黑腐皮壳菌；
二、具体实验过程
(1)菌株活化及平板对峙试验
菌株活化：在超净工作台中于4℃小斜面试管中挑少量菌丝，接种于 PDA培养基上，25℃培养2-3d，完成活化，供试验使用(注：试验中所用的菌丝都是菌落最外围的部分)。
平板对峙：采用两点对峙法明确链格孢对苹果树腐烂病的拮抗作用。在 PDA平板中央放置直径为5mm已活化的腐烂病菌菌饼，在距离病原菌菌饼左右各2.5cm处放置内生链格孢，以单独放置病原菌菌饼的处理为对照。由于链格孢生长速度比腐烂病菌慢，设置处理为优先接种链格孢2d，1d，0 d，每个处理3个重复。25℃黑暗培养，待对照近乎长满皿后，测量对照菌落直径和病原菌菌落朝链格孢方向扩展的直径，按如下公式计算抑菌率：
抑菌率(％)＝[(对照菌落直径－病原菌菌落朝链格孢方向扩展的直径)/对照菌落直径]×100
(2)内生链格孢的抑菌谱
进一步利用平板对峙试验确定此链格孢对其他病原菌是否有拮抗作用。选用的病原菌有黄瓜灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽叶枯病菌和小麦赤霉病菌，参考(1)的试验步骤。
(3)拮抗前后苹果树腐烂病菌菌丝的观察
参考(1)进行平板对峙培养后，分别于两个洁净的载玻片中央滴加一滴灭菌水，接着用灭菌后的牙签分别轻挑正常生长的腐烂病菌菌丝和内生链格孢拮抗后的腐烂病菌菌丝置于提前准备好的载玻片上，盖好盖玻片。通过显微观察拮抗前后苹果树腐烂病菌菌丝形态的变化，重复6次。
(4)内生链格孢对苹果树腐烂病防治效果
枝条处理：采集富士苹果枝条(1-2年生)，剪成10cm长短，挑选粗细长势一致的枝条，经清水冲洗干净，0.6％次氯酸钠溶液消毒15-20min后，无菌水再清洗3-4次直至无异味，晾干，用融化的石蜡封住枝条两端，静置晾干。
保护作用：将处理好的枝条用消毒后的打孔器在枝条上打孔(孔径5 mm)，然后处理组b先接种内生链格孢菌菌饼，2d后将链格孢菌饼刮除，并在原位置接种苹果树腐烂病菌菌饼；对照组a将接种内生链格孢菌菌饼替换成空白PDA培养基，喷水用保鲜膜保湿，在25℃恒温培养箱中培养5d后，观察苹果树腐烂病的发生情况，测量病斑长度和防治效果。每个处理6根枝条，每个枝条一个接种点，试验重复3次。
治疗作用：将处理好的枝条用消毒后的打孔器在枝条上打孔(孔径5 mm)，然后先接种苹果树腐烂病菌菌饼，2d后将苹果树腐烂病菌菌饼刮除，处理组d在原位置接种内生链格孢菌菌饼；对照组c将接种内生链格孢菌菌饼替换成空白PDA培养基，喷水用保鲜膜保湿，在25℃恒温培养箱中培养5d 后，观察苹果树腐烂病的发生情况，测量病斑长度和防治效果。每个处理6 根枝条，每个枝条一个接种点，试验重复3次。
(5)内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌的抑制作用
内生链格孢培养滤液制备：无菌条件下用打孔器打取已培养5d的内生链格孢菌饼(直径5mm)，放入分装成100ml PDB培养基的三角瓶中，每瓶放5个菌饼，25℃、160r.min-1培养10d后，用2层灭菌滤纸和0.22μm微孔滤膜细菌过滤器过滤，培养滤液(原液)-20℃保存备用。
培养滤液对腐烂病菌菌丝生长的抑制作用：将收集的链格孢培养滤液和融化的PDA分别混合，配成培养滤液含量分别为 0.5％、1.0％、2.5％、5.0％、10.0％的培养基平板，凝固后在平板中央接种一个生长旺盛的苹果树腐烂病菌菌饼，以不含内生链格孢培养滤液的处理为对照，每处理6次重复，25℃黑暗培养至对照长满皿后进行菌落直径测量，计算菌丝抑制率，抑制率计算公式如(1)中所示。
(6)内生链格孢培养滤液的稳定性测定
热稳定性：将装于离心管的10ml内生链格孢培养滤液分别置于 30℃、60℃、90℃及121℃温度条件下30min，待培养滤液自然冷却，采用菌丝生长速率法进行生物测定，将融化的PDA培养基与培养滤液混合，配成滤液含量为10.0％的平板，待凝固在平板中央放置一个培养2-3d的苹果树腐烂病菌菌饼，每处理6次重复，以没有进行温度处理的培养滤液和空白培养基为对照，25℃黑暗培养至对照长满皿后进行菌落直径测量并计算菌丝生长的抑制率。
酸碱稳定性：将内生链格孢培养滤液用1mol·L-1的HCl和1mol·L-1的 NaOH将pH值调整为3、4、5、6、7、8、9和10，室温放置24h后将pH调回原值，采用菌丝生长速率法进行生物测定，将融化的PDA培养基与培养滤液混合，配成滤液含量为10.0％的平板，待凝固在平板中央放置一个培养2- 3d的苹果树腐烂病菌菌饼，每处理6次重复，以没有进行紫外处理的培养滤液和空白培养基为对照，25℃黑暗培养至对照长满皿后进行菌落直径测量并计算菌丝生长的抑制率。
紫外稳定性：将装于小三角瓶中的10ml内生链格孢培养滤液置于紫外灯光下，分别放置15min、30min、45min和60min后采用菌丝生长速率法进行生物测定，将融化的PDA培养基与培养滤液混合，配成滤液含量为10.0％的平板，待凝固在平板中央放置一个培养2-3d的苹果树腐烂病菌菌饼，每处理6次重复，以没有进行紫外处理的培养滤液和空白培养基为对照，25℃黑暗培养至对照长满皿后进行菌落直径测量并计算菌丝生长的抑制率。
(7)内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病防治效果
保护作用：枝条处理同(4)中的方法，用直径为5mm的打孔器对枝条进行打孔，处理组b用灭过菌的毛笔蘸取适量内生链格孢培养滤液刷枝条3次，晾干后接着接种苹果树腐烂病菌菌饼，每个枝条1个接种点，每处理设置6个重复，以无菌水代替内生链格孢培养滤液为对照组c，喷水用保鲜膜保湿，在 25℃恒温培养箱中培养5d后，观察苹果树腐烂病的发生情况，测量病斑长度和防治效果，试验重复3次。
治疗作用：枝条处理同(4)，用直径为5mm的打孔器对枝条进行打孔，处理组d先接种生长旺盛的苹果树腐烂病菌菌饼，喷水保鲜膜保湿25℃恒温培养箱中培养2d后，去除苹果树腐烂病菌菌饼，接着用灭过菌的毛笔蘸取适量内生链格孢培养滤液刷枝条3次，晾干，每个枝条1个接种点，每处理设置 6个重复，以无菌水代替内生链格孢培养滤液为对照组c，喷水用保鲜膜保湿，继续在25℃恒温培养箱中培养5d后，观察苹果树腐烂病的发生情况，测量病斑长度和防治效果，试验重复3次。
三、实验结果如下
(1)本实施例中内生链格孢对苹果树腐烂病菌的抑制作用
由图1可以看出，内生链格孢对苹果树腐烂病菌有明显的拮抗抑制作用，优先接种链格孢2天后，其对苹果树腐烂病菌生长的抑制率可达93.33％。
(2)本实施例中内生链格孢的抑菌谱
由图2可以看到，本实施例的内生链格孢对黄瓜灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽叶枯病菌和小麦赤霉病菌无拮抗抑制作用，该内生链格孢只抑制苹果树腐烂病菌，具有专一性。
(3)本实施例中内生链格孢拮抗对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响
由图3可以看出，经过对峙培养，显微镜观察发现，链格孢拮抗后，苹果树腐烂病菌菌丝明显增粗，说明腐烂病菌菌丝的生长受到严重抑制。
(4)内生链格孢对苹果树腐烂病离体枝条的防治效果
从图4可以看出，链格孢菌对苹果树腐烂病有较好的防治效果，其保护作用优于治疗作用，保护防效可达64％，为后期生产链格孢预防保护制剂，用于防治苹果树腐烂病奠定基础。
(5)内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌的抑制作用
从图5可以看出，链格孢培养滤液对苹果树腐烂病菌菌丝生长具有明显抑制作用，并且随着滤液含量的增多，抑制效果越强，在内生链格孢培养滤液含量为5.0％的时候，对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制率达到82.43％。
(6)内生链格孢培养滤液的稳定性测定
从图6可以看出，链格孢培养滤液经不同温度处理后抑菌活性不受影响，热稳定性良好。
从图7可以看出，链格孢培养滤液经酸碱处理后抑菌活性基本不受影响，酸碱稳定性良好。
从图8可以看出，链格孢培养滤液经不同时间紫外辐射后抑菌活性不受影响，说明其在接收了紫外照射1h后仍能保持抑菌活性。
因此，内生链格孢培养滤液具有良好的稳定性。
(7)内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病防治效果
从图9可以看出，内生链格孢培养滤液对苹果树腐烂病有良好的防治效果，防效达54％，为后期田间用于防治苹果树腐烂病奠定基础。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一株内生链格孢菌Aa-Lcht，其特征在于，所述内生链格孢菌Aa-Lcht于2021年01月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21456，分类命名为互隔交链孢霉Alternariaalternata。
2.如权利要求1所述的内生链格孢菌Aa-Lcht在防治苹果树腐烂病中的用途。
3.由权利要求1所述的内生链格孢菌Aa-Lcht制备获得的培养滤液。
4.如权利要求3所述的培养滤液的制备方法，其特征在于，制备过程为：无菌条件下用打孔器打取已培养4-6d的权利要求1所述的内生链格孢菌饼，放入PDB培养基中，25-28℃、150-170r·min-1培养8-10d后，用2-3层灭菌滤纸和0.22μm微孔滤膜细菌过滤器过滤，获得培养滤液。
5.如权利要求3所述的培养滤液的制备方法，其特征在于，具体制备过程中：将培养5d的权利要求1所述的内生链格孢菌饼，放入PDB培养基中，25℃、160r·min-1培养10d后，用2层灭菌滤纸和0.22μm微孔滤膜细菌过滤器过滤，获得培养滤液。
6.如权利要求3所述的内生链格孢菌Aa-Lcht培养滤液在防治苹果树腐烂病中的用途。
7.一种包含权利要求1所述的内生链格孢菌Aa-Lcht的制剂。
8.如权利要求7所述的包含内生链格孢菌Aa-Lcht的制剂，其特征在于，所述制剂为内生链格孢菌Aa-Lcht菌体与无菌水的混合物。
9.如权利要求7所述的包含内生链格孢菌Aa-Lcht的制剂在防治苹果树腐烂病中的用途。
10.如权利要求9所述的内生链格孢菌Aa-Lcht的制剂在防治苹果树腐烂病中的用途，其特征在于，所述苹果树腐烂病是由苹果黑腐皮壳菌引起的。
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