CN116240113B - 一种抑制草莓炭疽病的生防菌jsnl-b47及其应用 - Google Patents

一种抑制草莓炭疽病的生防菌jsnl-b47及其应用 Download PDF

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Abstract

欧本发明公开了一种抑制草莓炭疽病的生防菌及其应用，所述生防菌命名为金色毛壳菌(Arcopilusaureus)JSNL‑B47，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.40437。本发明提供的金色毛壳菌(Arcopilusaureus)JSNL‑B47可以显著降低草莓炭疽病的病害严重度，当JSNL‑B47胞外代谢物浓度为30mL/100mL时，对C.siamense抑制率达到了47.42％，当JSNL‑B47胞外代谢物浓度为60mL/100mL时，对C.siamense抑制率均达到了67.74％。同时，可以诱导草莓叶片产生对C.siamense的抗性。

Description

一种抑制草莓炭疽病的生防菌JSNL-B47及其应用
技术领域
本发明属于草莓生防技术领域，涉及一种抑制草莓炭疽病的生防菌JS NL-B47及其应用。
背景技术
炭疽菌(刺盘孢)属(Colletotrichum spp.)真菌寄主范围广，除了可侵染草莓，还可侵染葡萄、苹果、辣椒、芒果、柑橘、桃、梨、可可、香蕉、豌豆、大豆、玉米和铁皮石斛等植物。常为害植物叶、茎、花和果实，造成叶斑、叶枯、花腐、果腐和枝枯等症状，严重降低作物品质。2009年植物炭疽病被列为世界第九大病害。
由炭疽菌引起的草莓炭疽病已成为近几年草莓的主要病害，主要发生在草莓育苗期和定植初期。草莓炭疽病发生时，草莓叶片、叶柄、托叶、匍匐茎、花瓣和果实均可受害。叶片染病时常呈黑色，形状不一。叶柄和匍匐茎发病初期稍凹陷，中央红褐色，边缘紫红色，蔓延后叶柄和匍匐茎折断，湿度大时病斑上会长出霉斑。根颈部染病初期，新叶在晴天萎蔫，5-7天后整株枯死，切断根茎，横切面上可观察到从边缘向内部扩大的褐色腐败斑。果实染病时产生近圆形或不规则病斑，呈浅褐色至黑色，软腐状并凹陷，最终皱缩或干缩。该病危害性大、毁灭性强，一般造成草莓减产25％-30％，严重时达80％，甚至毁灭性损失。草莓炭疽病是制约中国草莓产业的第三大病害。
现有技术中草莓炭疽病的防治主要包括以下方式：①加强化学防治。化学药剂虽然能够在一定程度上防治草莓炭疽病，但是大量使用化学药剂一方面给生态环境和食品安全带来极大威胁，尤其是我国草莓消费主要以鲜食为主，其绿色生态生产格外重要；另一方面会导致病原菌抗药性不断增强，出现农药防治无效的现象。②选育抗病品种。选育抗病品种是防控草莓炭疽病最经济有效的途径。但一方面由于我国草莓主栽品种大多是来自国外抗病性较差的品种，草莓品种的抗病资源筛选工作还不完善；另一方面由于引起该病害的病原菌致病群体复杂，致使草莓品种的抗性容易丧失。
因而，找到一种环境友好且行之有效的炭疽病防治措施是现今亟待解决的问题。植物内生真菌(endophyte)不同于病原菌，病原菌会导致病害发生，并降低宿主植物的适应性，而内生真菌栖息于无症状的宿主植物组织内，是影响植物生长、营养和健康的关键因素之一，可以帮助植物获得营养物质，抑制植物病原菌以及抵抗生物和非生物胁迫。内生真菌和陆生植物相互作用已超过4亿年。由于植物内生真菌来源于植物，对植物安全、对环境友好且不易产生抗药性，使用这些微生物防治植物病害有利于保持生态平衡。因此，植物内生真菌是促进有机农业的新型化合物的来源。
综上所述，现有技术还缺少一种预防草莓炭疽病的绿色、高效的益生菌。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供了一种能够有效防治草莓炭疽病的生防菌金色毛壳菌(Arcopilus aureus)JSNL-B47及其应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种防治草莓炭疽病菌(Colletotrichum siamense)引起的草莓炭疽病的生防菌，所述生防菌命名为金色毛壳菌JSNL-B47，分离自镇江市句容市白兔镇健康草莓根部。
金色毛壳菌JSNL-B47，分类命名为Arcopilus aureus，已于2022年12月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)登记保藏，保藏编号为CGMCCNO.40437，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
第二方面，本发明提供了一种工程菌，所述工程菌包含本发明第一方面所述的金色毛壳菌JSNL-B47的核酸片段。
进一步地，所述核酸片段的序列为与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列同一性达到90％以上的核苷酸序列。
进一步地，所述核酸片段的序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
SEQ ID NO.1:
AATTACGAGATGCAAACTCCCTAACCATTGTGGACGCTACCTTTTAACGTTGCTTCGGCGGGCGGCCCGCTCCCCTGGAAAGCCCCTGTGGCCGCCCGGGGCTGCGAGCCCCCCGGCCCCCCTCGCGGGGGCGCCCGCCGGAGGATACCCAACTCTTGATTATTTTAGGCCTCTCTGAGTCTTCTGTACTGAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCATCAAGCCCCAGGCTTGTGTTGGGGACCTGCGGCTGCCGCAGGCCCTGAAATCCAGTGGCGGGTTCGCTGTCACCCCGAGCGTAGTAGCAATATCTCGCTCAGGGCGTGCTGCGGGCACCGGCCGTTAAAAGCTGCCTTCTGGCAACACCCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAAGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGCGGGAAGGAAAAACC
SEQ ID NO.2:
TGTTATGCTACCTGCCGGATATCCACGTCGCGTCAGGAGGCATTCAAAATTAACTTCTCTACAGGCAGACCATCTCCGGCGAGCACGGCCTTGACAGCAATGGCGTGTATGTGACTGTCGCCAGTCCAACTTCGGTTAACCCCACGCTCACCGCCCTATTAGGTACAACGGCACCTCGGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAACGTCTACTTCAACGAGGTGAGTTGTATTGCGAGGACCCGGGCTCAACAGTAGAATTCTGCTTGCTGACGGCATCTTTTCTGCA GGCCTCCGGCAACAAGTATGTCCCCCGTGCCGTCCTGGTCGATCTGGAGCCCGGCACCATGGACGCCGTCCGCGCCGGCCCCTTCGGCCAGCTCTTCCGCCCCGACAACTTCGTCTTCGGCCAGTCCGGCGCCGGCAACAACTGGGCCAAGGGTCATAC
第三方面，本发明提供了一种能够防治草莓炭疽病菌(C.siamense)引起的草莓炭疽病的生防菌剂，其活性成分为如下一种或多种：
A1)本发明第一方面所述的金色毛壳菌JSNL-B47；
A2)本发明第一方面所述的金色毛壳菌JSNL-B47的菌丝、孢子或次生代谢物中的一种或多种；
A3)本发明第二方面任一所述的工程菌。
进一步地，所述金色毛壳菌JSNL-B47的菌丝由金色毛壳菌JSNL-B47接种于PDA或OA培养基培养制得。
进一步地，所述生防菌剂包括生防化肥或生防农药。
第四方面，本发明还提供了第三方面所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备无菌基质；
S2、向S1所述基质中加入金色毛壳菌JSNL-B47的菌丝、孢子或次生代谢物；
S3、将S2得到的基质密封培养数天即得生防菌剂。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
A1：将基质装入带有透气孔的无菌三角瓶(250mL)中，每瓶放入200mL基质，在121℃环境下高温灭菌20min，
A2：金色毛壳菌JSNL-B47接种于直径9cm的含有15mL的PDA培养基中，于25℃、避光培养3-5d。
A3：将生长3d的金色毛壳菌JSNL-B47菌落边缘切取3mm×3mm的菌丝块，无菌条件下转移到液体基质中，封口后置于25℃培养7d，制得金色毛壳菌JSNL-B47的液体发酵菌剂。
第五方面，本发明还提供了上述的生防菌、上述的工程菌或上述的生防菌剂在防治草莓炭疽病菌(C.siamense)引起的草莓炭疽病害中的应用。
第六方面，本发明还提供了一种草莓炭疽病的防治方法，所述方法包括向植物生长环境中施用本发明所提供的生防菌、工程菌或生防菌剂。
进一步地，所述植物生长环境为植物苗根部或叶部。
与现有技术相比，本发明提供的生防菌金色毛壳菌JSNL-B47能够显著降低草莓炭疽病的病害严重度，当JSNL-B47胞外代谢物浓度为30mL/100mL时，对C.siamense抑制率达到了47.42％，当JSNL-B47胞外代谢物浓度为60mL/100mL时，对C.siamense抑制率均达到了67.74％。同时，可以诱导草莓叶片产生对C.siamense的抗性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中金色毛壳菌JSNL-B47在平板上抑制C.siamense菌丝生长的效果图；
图2为实施例1中金色毛壳菌JSNL-B47对C.siamense的抑制活性；
图3为实施例2中金色毛壳菌JSNL-B47分泌的胞外代谢物对C.siamense的影响；
图4为实施例3中金色毛壳菌JSNL-B47抑制C.siamense侵染草莓叶片的结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
如本发明中所述，术语“生防菌”指有益微生物，可以防治植物病害，主要有细菌、真菌和放线菌。
如本发明中所述，术语“工程菌”指采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点。
如本发明中所述，术语“草莓炭疽病菌(C.siamense)”分类地位：真菌门(Eumycota)、半知菌亚门(Deuteromyeotina)、腔孢纲(Coelomycetes)黑盘孢目(Melanconiales)、黑盘孢科(Melanconiaceae)、炭疽属(Colletotrichum)。主要分布在美国、加拿大、澳大利亚、日本、英国、中国、比利时、德国、印度、越南、韩国、巴西、巴拿马、墨西哥、俄国、以色列等国家。
实施例1菌金色毛壳菌JSNL-B47的筛选
1、分离潜在的生防菌
1.1、获取试验材料：从田间(江苏农博园)选取长势良好的健康草莓植株，取其根部组织。
1.2、草莓根部内生真菌的分离及培养：剪取草莓根部组织，混匀，称取2g，进行表面消毒。为确保清除所有附生微生物，加入100mL无菌水和2滴吐温20，在25℃下220rpm震荡20min，无菌水处理20s，70％(v/v)乙醇处理30s，2.5％(v/v)次氯酸钠溶液处理2min，最后用无菌水冲洗3-4遍，用无菌吸水纸吸干表面水分。在无菌条件下将根段进一步切成较短的小块(0.25cm)，每个样品随机选取5块放置在含有氨苄(50mg/L)和利福平(50mg/L)的PDA平板培养基上，设三个重复。将培养皿密封，在25℃、黑暗条件下培养1-2d。当菌丝体从根块组织中出现时，将生长在培养基边缘的小块培养基连同菌丝体一起小心地转移到一个新的PDA平板上。
2、平板对峙法筛选拮抗菌
采用PDA平板对峙法，在直径9cm的含有15mL的PDA培养基平板距离边缘2cm处对称接种培养3-5d的C.siamense菌株菌饼(直径5mm)和供试内生真菌菌饼，以只接种C.siamense菌株菌饼的平板作为对照。平板置于25℃、黑暗条件下培养。5d后测量C.siamense菌落半径并计算抑制率。
最终筛选得到1株在平板上对C.siamense有很好拮抗活性的菌株，具体表现为强烈的抑制病原菌菌丝生长，编号为JSNL-B47。
如图1所示，左图为对照组PDA培养基与C.siamense菌株对峙，右图为实验组菌株JSNL-B47与C.siamense菌株对峙。与对照相比，实验组C.siamense菌株的菌落明显更小，抑制率达到了63.64％，说明C.siamense菌株的菌丝生长受到了抑制。
如图2所示，光学显微观察结果显示：正常C.siamense菌丝外形规则，内含物在菌丝细胞壁内分布均一、较透明(左图)。与JSNL-B47对峙7天后，C.siamense菌丝内部物质瓦解、凝聚，较混乱分布，菌丝粗细不均(右图)，不能正常生长。
3、筛选所得菌株的分子生物学鉴定
3.1、采用TIANGEN公司的试剂盒(DP320-03)提取菌株JSNL-B47的基因组DNA。
3.2、分别扩增基因组DNA的ITS和BenA基因。DNA扩增采用30μL的反应体积，包含15μL 2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)，引物F/R各1μL(10μM)，2μL模板DNA和11μL ddH2O，PCR扩增程序条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
3.3、扩增所得PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，将有目标条带的PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果为：步骤2筛选得到的菌株JSNL-B47的ITS基因序列为SEQ ID NO.1，BenA基因序列为SEQ ID NO.2。
3.4、在NCBI数据库网站上比对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两条序列。比对结果如表1所示。根据表1结果可以推定本发明的生防菌JSNL-B47为金色毛壳菌(Arcopilusaureus)，命名为金色毛壳菌JSNL-B47。
表1SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两条序列比对结果
实施例2金色毛壳菌JSNL-B47胞外代谢物对C.siamense的影响
1、将C.siamense和金色毛壳菌JSNL-B47分别接种于直径9cm的含有15mL PDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养5d。待C.siamense菌株长满培养皿，用打孔器(直径5mm)在菌落边缘打孔，制备菌碟。
2、菌株JSNL-B47分泌的胞外代谢物的获取
在生长5d的JSNL-B47菌落边缘切取3mm×3mm的菌丝块，无菌条件下将30块菌丝块转移到200ml PDB液体培养基中，25℃、黑暗、160rpm条件下培养7d，先用两层无菌纱布过滤掉培养液中的菌丝块，常温下，10000rpm离心30min后取上清；用0.45μm的细菌过滤器过滤一遍上清液后再用0.22μm细菌过滤器过滤一遍，以完全去除JSNL-B47菌体；得到的无菌滤液。
2、分别量取上述无菌滤液30mL和60mL，各倒入100mL PDA培养基(冷却至50℃左右)中，迅速混匀，制得浓度为20mL/100mL和40mL/100mL的含JSNL-B47无菌滤液的平板，对照以无菌水代替无菌滤液，分别制得相应浓度的无菌水平板。
3、在超净工作台中用接种针挑取C.siamense菌碟接种于上述制得的平板中，注意菌丝面朝下，每种浓度(无菌滤液和无菌水)各设3个重复。
4、将接种后的培养皿放入25℃培养箱，避光培养3-5d，测量菌落直径。抑制率按照公式计算：抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％。
结果如图3和表2所示
表2菌株JSNL-B47分泌的胞外代谢物对C.siamense抑制率
其中，表中菌落直径的数值表达方式为：平均值±标准误差。
从图3和表2数据可知，菌株JSNL-B47分泌的胞外代谢物对C.siamense抑制效果，且随着胞外代谢物浓度的增加，抑制效果有增加的趋势。当JSNL-B47胞外代谢物浓度为30mL/100mL时，对C.siamense抑制率达到了47.42％，当JSNL-B47胞外代谢物浓度为60mL/100mL时，对C.siamense抑制率均达到了67.74％。
实施例3金色毛壳菌JSNL-B47对草莓自身生长的影响
1、将菌株JSNL-B47接种于直径9cm的培养皿中(内含15ml PDA培养基)，25℃、避光培养7d。
2、选择直径为12cm的盆钵，将培养7d的金色毛壳菌JSNL-B47的培养基切成0.5cm×0.5cm的平板块。试验设置2组，对照组为：每个盆钵加入2个0.5cm×0.5cm的PDA平板块；实验组为：每个盆钵加入2个0.5cm×0.5cm的金色毛壳菌JSNL-B47的平板块。用无菌水和灭菌的蛭石将各种平板块混合均匀，加入盆钵到1/3处，向每个盆钵中移栽3株长势一致的健康草莓苗(品种为红玉)，再覆盖一层薄的菌丝块与蛭石的混合物。每个处理设置3个重复。
3、用无菌水浇灌各组草莓，14d后统计草莓的根长、株高和鲜重。
结果如表3所示。
表3草莓根长、株高及鲜重统计结果
其中，表中根长、株高和鲜重的数值表达方式为：平均值±标准误差。
从表3数据可知，实验组的根长、株高和鲜重与对照相比，差异不显著。以上结果表明金色毛壳菌JSNL-B47对草莓植株不存在促生作用。
实施例3金色毛壳菌JSNL-B47诱导草莓产生抗性
1、将C.siamense和金色毛壳菌JSNL-B47分别接种于直径9cm的含有15mL PDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养5d。用打孔器(直径5mm)在C.siamense和JSNL-B47菌落边缘打孔，制备菌碟。
2、选取健康草莓叶片，用自来水洗净，再用70％(v/v)乙醇表面消毒2次，最后用无菌水冲洗叶片表面3次，用灭菌的接种针在叶背左右两侧各轻刺3-5下，将上述JSNL-B47的菌碟贴放在叶片右侧伤口上，菌丝面朝下，左侧用PDA空白培养基打菌碟(直径5mm)作为对照，同时在叶片左右两侧均放置PDA空白培养基作为空白对照，用无菌湿脱脂棉保湿。接种过的叶片放在消过毒的托盘中，托盘内铺两层无菌纱布并用无菌水淋湿，用保鲜膜覆盖密封托盘保湿。25℃、黑暗条件下放置24h。
将叶片两侧的JSNL-B47和PDA空白培养基菌碟去掉，换上C.siamense菌碟，菌丝面朝下，换上新的无菌湿脱脂棉，保鲜膜覆盖密封托盘保湿。25℃、黑暗条件下放置4d。
查看草莓叶片发病情况，用十字交叉法记录病斑直径，计算平均值。
结果如图4和表4所示。
表4C.siamense接种叶片病斑直径统计结果
其中，表中菌落直径的数值表达方式为：平均值±标准误差。
如图4所示，叶片正面左侧为接种菌株JSNL-B4724 h后又接种C.siamense菌株，右侧为接种空白PDA24 h后又接种C.siamense菌株，可见实验组的病斑明显小于对照组，说明实验组的草莓叶片产生了对C.siamense的抗性。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

Claims (6)

1.一种草莓炭疽病生防菌，其特征在于，所述生防菌为金色毛壳菌（Arcopilusaureus） JSNL-B47，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.40437。
2.一种能够防治C.siamense引起的草莓炭疽病的生防菌剂，其特征在于，其活性成分为如下一种或多种：
A1)权利要求1所述的金色毛壳菌Arcopilus aureus JSNL-B47；
A2)权利要求1所述的金色毛壳菌Arcopilus aureus JSNL-B47的菌丝或孢子中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述金色毛壳菌Arcopilus aureusJSNL-B47的菌丝由金色毛壳菌Arcopilus aureusJSNL-B47接种于PDA和OA培养基培养制得。
4.权利要求2-3任一所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备无菌基质；
S2、向S1所述基质中加入金色毛壳菌Arcopilus aureus JSNL-B47的菌丝或孢子；
S3、将S2得到的基质密封培养数天即得生防菌剂。
5.权利要求1所述的生防菌、权利要求2-3任一所述的生防菌剂在防治C.siamense引起的草莓炭疽病中的应用。
6.一种草莓炭疽病的防治方法，其特征在于，所述方法包括向植物生长环境中施用权利要求1所述的生防菌、权利要求2-3任一所述的生防菌剂。
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