CN114134051B - 橘青霉yw322及培养方法、菌剂及其应用 - Google Patents

橘青霉yw322及培养方法、菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病害防治领域，特别是涉及橘青霉YW322及培养方法、菌剂及其应用。本发明提供了一株橘青霉YW322，所述的橘青霉YW322的保藏编号为CGMCC No.23201。本发明所述橘青霉YW322能够有效防治尖孢镰刀菌引起的(人参属)植物病害，而且具有安全，无污染的优势。

Description

橘青霉YW322及培养方法、菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及病害防治领域，特别是涉及橘青霉YW322及培养方法、菌剂及其应用。
背景技术
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是半知菌亚门，从梗孢目，瘤座孢科，镰刀菌属的一种兼性寄生菌，可在土壤中生存也可以寄生于植物体中。尖孢镰刀菌侵染植物体，主要引起植物根腐病，该病原菌以菌丝体的形式在染病植株或者周围土壤中过冬，第二年以分生孢子的形式进入植株伤口达到侵染的目的。以人参根腐病为例，此病在发病初期，并无明显症状，但发病后期，叶片开始逐渐发黄，人参根部慢慢变黑直至腐烂，甚至会导致人参因腐烂而亡，严重降低人参品质及药用价值。
尖孢镰刀菌在土壤中分布广泛，且不容易被彻底防治，成为第三大土传病原真菌。目前对于尖孢镰刀菌引起的植物根腐病防治主要采用化学防治，由其带来的农药残留和环境污染问题严重威胁农作物产业的发展，迫切需要开发安全、环保的病害防治方法，以促进农作物产业的持续、稳定、健康的发展。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了橘青霉YW322及培养方法、菌剂及其应用。采用本发明橘青霉YW322能够有效防治尖孢镰刀菌，而且具有安全，无污染的优势。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一株橘青霉(Penicillium citrinum)YW322，所述的橘青霉YW322的保藏编号为CGMCC No.23201。
本发明提供了上述技术方案所述橘青霉YW322的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：将橘青霉YW322接种于培养基中，在恒温条件下进行培养，得到扩繁后的橘青霉YW322。
优选的，所述恒温的温度为28～32℃；所述培养的转速为150～180rmp；所述培养的时间为5～7d。
本发明提供了一种防治根腐病的生防菌剂，所述生防菌剂的有效成分包括上述技术方案所述橘青霉YW322的发酵液或上述技术方案所述培养方法培养所得橘青霉YW322的发酵液。
优选的，所述橘青霉YW322发酵液中橘青霉YW322的浓度为1.0×108～1.0×109个孢子/mL。
优选的，所述生防菌剂还包括填充料。
优选的，所述生防菌剂中橘青霉YW322发酵液和填充料的体积质量比为(0.5～1.5)mL：(0.5～2)g。
优选的，所述填料包括方解石、聚乙烯醇、玉米淀粉；所述方解石、聚乙烯醇、玉米淀粉的质量比为(1～2)：(1～2)：(1～3)。
本发明提供了上述技术方案所述的橘青霉YW322或上述技术方案所述生防菌剂在防治根腐病和/或促进植物生长中的应用。
优选的，所述植物包括药用植物。
有益效果：本发明提供了一株橘青霉(Penicillium citrinum)YW322，所述的橘青霉YW322的保藏编号为CGMCC No.23201。采用本发明橘青霉YW322能够有效防治尖孢镰刀菌，而且具有安全，无污染的优势，同时还能促进植物生长。本发明具体实施例通过平板对峙实验显示橘青霉对尖孢镰刀菌生长抑制率可达95.57％，而且橘青霉YW322发酵液抑菌活性稳定；通过促生特性实验验证橘青霉YW322产IAA(吲哚乙酸)能力较强，在96h时浓度可达到22.52mg/L，可见该菌株具有良好的促进植物生长的能力；通过盆栽试验可知，同时接种橘青霉YW322和致病菌的处理，相较于接种致病菌的处理的地上高度和地下长度具有提高。因此，该菌株具有防治孢镰刀菌和促进植物生长的作用。
生物保藏说明
橘青霉(Penicillium citrinum)YW322，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年8月5日，保藏编号为CGMCC No.23201。
附图说明
图1为橘青霉YW322的菌落形态图；
图2为橘青霉YW322的系统发育树；
图3为对峙实验图，其中左侧只接尖孢镰刀菌，右侧为橘青霉YW322与尖孢镰刀菌共培养，其中橘青霉为橘青霉YW322；
图4为尖孢镰刀菌对人参根盘致病性，ck为根盘表面接种无菌水，F.o为根盘表面接种尖孢镰刀菌孢子悬浮液；
图5为IAA标准曲线图。
图6为根腐病原菌感染后腐烂人参根部图；
图7为IAA颜色对比，其中CK为阳性对照，YW322为橘青霉YW322，第一根试管为CK，第二根试管为橘青霉YW322一次重复，第三根试管为橘青霉YW322二次重复，第四根试管为橘青霉YW322三次重复；
图8为盆栽实验各处理根部对比图，其中橘青霉为橘青霉YW322。
具体实施方式
本发明提供了一株橘青霉(Penicillium citrinum)YW322，所述的橘青霉YW322的保藏编号为CGMCC No.23201。本发明橘青霉YW322能够有效防治尖孢镰刀菌，而且具有安全，无污染的优势，同时还能促进植物生长。
在本发明中，所述橘青霉YW322的菌落形态为顶端以扫帚状的方式分支，分支为多极的分生孢子梗最后产生许多瓶梗，在瓶梗上着生分生孢子链，分生孢子为球形至卵形，呈绿色。
在本发明中，所述橘青霉YW322的ITS区序列优选为SQE ID No.1所示：CCAACCTCCCACCCGTGTTGCCCGAACCTATGTTGCCTCGGCGGGCCCCGCGCCCGCCGACGGCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGTTGCAGTCTGAGACCTATAACGAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCCCGCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTAGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCCCC。
本发明提供了上述橘青霉YW322的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：将橘青霉YW322接种于培养基中，在恒温条件下进行培养，得到扩繁后的橘青霉YW322。
在本发明中，所述培养基优选为PDA培养基；所述培养基的组分优选包括：每1000mL水中含有200g去皮马铃薯、20g葡萄糖和15～20g琼脂。在本发明中，所述恒温的温度优选为28～32℃，更优选为30℃；所述培养的转速优选为150～180rpm，更优选为180rmp；所述培养的的时间优选为5～7d，更优选为7d。在本发明特定的条件下培养菌株，使菌株生长过程中不易聚集成团，繁殖较快，且发酵液中分泌的代谢产物较多。。
本发明提供了一种防治根腐病的生防菌剂，所述生防菌剂的有效成分包括上述的橘青霉YW322的发酵液或上述培养方法培养所得橘青霉YW322的发酵液。在本发明中，所述植物优选包括药用植物，进一步优选为五加科植物，更优选为人参属植物，最优选为人参；所述根腐病优选由尖孢镰刀菌引起。在本发明中，所述橘青霉YW322发酵液中橘青霉YW322的浓度优选为1×108～1×109个孢子/mL，进一步优选为4×108～9×108个孢子/mL，更优选为6×108～8×108个孢子/mL。
在本发明中，所述生防菌剂有选还包括填充料。在本发明中，所述生防菌剂中橘青霉YW322发酵液和填充料的体积质量比优选为(0.5～1.5)mL：(0.5～2)g，更优选为1ml：1g；所述填料优选包括方解石、聚乙烯醇、玉米淀粉；所述方解石、聚乙烯醇、玉米淀粉质量比优选为(1～2)：(1～2)：(1～3)，更优选为1:1:2。在本发明中，聚乙烯醇为橘青霉YW322的分散剂，玉米淀粉为橘青霉YW322的载体，方解石为橘青霉YW322的紫外保护剂。通过上述组分的相互配合能够使橘青霉YW322发挥最大的作用，保证防治植物真菌病害的效果，还能促进植物生长。
利用本发明橘青霉YW322能够有效防治尖孢镰刀菌引起的植物病害，而且具有安全，无污染的优势，同时还能促进植物生长。因此，该菌株和含有该菌株的生防菌剂能够用于防治植物真菌和促进植物生长。
本发明提供了上述的橘青霉YW322或上述生防菌剂在防治根腐病和/或促进植物生长中的应用。在本发明中，所述植物优选包括药用植物，进一步优选为五加科，更优选为人参属，最优选为人参；所述根腐病优选由尖孢镰刀菌引起。本发明通过平板对峙实验显示橘青霉对尖孢镰刀菌生长抑制率可达95.57％，而且橘青霉YW322发酵液抑菌活性稳定；通过促生特性实验验证橘青霉YW322产IAA(吲哚乙酸)能力较强，在96h时浓度可达到22.52mg/L，可见该菌株具有良好的促进植物生长的能力；通过盆栽试验可知，同时接种橘青霉YW322和致病菌的处理，相较于接种致病菌的处理的地上高度和地下长度具有提高。由此可见，本发明所述橘青霉YW322能够有效的防治尖孢镰刀菌，还能促进植物地上部分和地下部分的生长。
本发明优选提供了一种植物生长的方法，包括以下步骤：将上述菌剂施入植物根际。
在本发明中，所述植物优选包括药用植物，进一步优选为五加科植物，更优选为人参属植物，最优选为人参。在本发明中，所述施入的方式优选为灌根或拌土；以菌剂的质量计，所述拌土的用量优选为2～50kg/亩，更优选为2～48kg/亩，最优选为4～45kg/亩；以菌剂中橘青霉YW322发酵液的体积计，灌根的用量为2～20L/亩，更优选为2.1～18L/亩，最优选为2.3～12L/亩。
在本发明具体实施例中，采用盆栽的方式进行的验证，实验过程中优选将菌剂与水混合后，得稀释菌剂；将稀释菌剂第一次施入植物根际，第一次施入后2周植物根际后第二次将所述稀释菌剂施入植物根际；所述菌剂与水的比例优选为1：100，即将菌剂稀释100倍使用。在本发明中，采用的花盆规格优选为上口直径19cm，高16cm，底直径为14cm；所述花盆的面积优选为0.028m2，每盆优选装入1.5kg的土壤；所述施入的方式优选为灌根，在第一次施入植物根际和第二次施入植物根际过程中，所述施入的方式优选为灌根；所述灌根的用量以菌剂中橘青霉YW322发酵液的体积计，每盆的灌根的用量优选为0.1～0.5mL/盆，更优选为0.2mL/盆。
在本发明具体实施例中，采用田间试验的方式验证时，实验过程中优选将菌剂施入植物根际；所述施入的方式优选为拌土；所述拌土的用量20～200g/3m2，进一步优选为50～180g/3m2，更优选为90～150g/3m2。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的橘青霉YW322及培养方法、菌剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
PDA培养基制备：土豆削皮，用清水冲洗干净，切为大小1cm3左右的小块，称取200g土豆于800mL水中煮沸大约30min，边煮边搅拌直至土豆软烂。6层纱布过滤，加入20g葡萄糖，蒸馏水定容至1000mL，每升培养基加入15～20g琼脂，pH自然。
实施例1橘青霉YW322分离鉴定
以1、2、3、4年生的人参根际土壤为实验材料，分别制备10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6土壤稀释液；将上述10-1～10-6土壤稀释液均匀涂布于PDA平板上，28℃培养5d，通过平板划线法纯化菌种，具体步骤为：土壤稀释液涂布后，根据菌落形态等对菌株进行分类，用接种环分别挑取不同的菌丝，在新的PDA平板上用三线法划线接种，28℃培养7d，可重复上述操作直至得到纯菌种，得到6株橘青霉，分别编号为YW15、YW322、YW461、YW462、YW7和YW10。
分别对上述菌株进行抑制尖孢镰刀菌实验：
以根腐病病原菌尖孢镰刀菌为靶标菌，用无菌接种环在已保存的尖孢镰刀菌斜面上挑取少量菌体，在新的PDA平板上划线接种，接种量为一环，28℃培养7d使之活化。
用5mm打孔器取7个尖孢镰刀菌菌块，分别接种于新的PDA平板一侧距边缘1cm处，在另一侧同等距离分别接种直径5mm大小的橘青霉菌块，橘青霉活化方法与尖孢镰刀菌一致。只接种尖孢镰刀菌为对照，28℃静置培养7d，观察抑菌效果，观察结果如表1所示。
表1 6株橘青霉对尖孢镰刀菌抑制率
编号 最大相似性菌株 相似性 抑制率(％)
YW15 Penicillium citrinum 99.83 76.89
YW322 Penicillium citrinum 100 95.57
YW461 Penicillium citrinum 100 80.12
YW462 Penicillium citrinum 100 81.56
YW7 Penicillium citrinum 98.87 75.79
YW10 Penicillium citrinum 99.49 79.86
由表1记载的可知，6株橘青霉中，其中1株从3年生人参根际土壤中分离所得，抑制病原菌菌丝体生长达95％以上，编号为YW322，记为菌株Ⅰ。
采用光学显微镜对上述菌株Ⅰ进行生物学鉴定，该菌种菌落形态见图1：顶端以扫帚状的方式分支，分支为多极的分生孢子梗最后产生许多瓶梗，在瓶梗上着生分生孢子链，分生孢子为球形至卵形，呈绿色。
通过氯化苄法(Zhu H,Qu F,and Zhu LH.1993.Isolation of genomic DNAsfrom plant,fungi and bacteria using benzyl chloride.Nucl Acids Res.21:5278-5280)对已获得纯培养的菌株提取基因组DNA，以5′-CCGTAGGTG AACCTGCGG-3′(ITS1，SQEID No.2)和5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(ITS4，SQE ID No.3)为引物进行PCR扩增后测序，扩增程序如下所示，反应体系表1所示，测得的序列为SEQ ID No.1所示；将该序列放在NCBI数据库比对鉴定，以明确土壤根际真菌的分类归属，与Penicillium citrinum菌株的相似率为100％，同时制作系统发育树，结果如图2所示，属于Penicillium citrinum分支。因此，将该菌株命名为橘青霉YW322。
反应体系：设置阴性对照，即在反应体系里不加DNA模板，加1μL无菌水。50μL体系如表2所示：
表2反应体系
Figure BDA0003424614930000071
加入顺序：ddH2O、PCRBuffer、dNTP、MgCl2、Taq、引物。
扩增程序为：
Figure BDA0003424614930000072
实施例2橘青霉YW322对峙实验
用无菌接种环在斜面上挑取少量尖孢镰刀菌(登录号为LC656545，https://www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html)的菌体，在新的PDA平板上划线接种，接种量为一环，28℃培养7d，用5mm打孔器取菌块，得尖孢镰刀菌菌块。
在PDA平板一侧距边缘1cm处接种直径5mm大小的上述尖孢镰刀菌菌块，在另一侧同等距离接种直径5mm大小的橘青霉YW322菌块(实施例1得到的)，28℃静置培养7d。
通过平板对峙培养来鉴定抑菌效果，抑制率(IE)的计算公式为：IE(％)＝(1-Rc/Rs)×100％，式中Rc表示共培养中病原菌的径向生长半径，Rs表示对照中病原菌的径向生长半径。通过光学显微镜观察共培养区域尖孢镰刀菌菌落边缘的菌丝形态，以单种培养的尖孢镰刀菌为对照，可分析拮抗真菌对病原菌菌丝的抑制效果，抑制效果见图3。
对峙实验显示：Rc＝0.226cm，Rs＝5.314cm，经计算可得橘青霉对尖孢镰刀菌抑制率可达95.75％，且现有技术中，尚未发现有达到相同抑菌水平的橘青霉菌株；可见本发明所述橘青霉YW322能够显著抑制尖孢镰刀菌；同时通过图3看出橘青霉YW322能够显著抑制尖孢镰刀菌的生长。
实施例3橘青霉YW322发酵滤液抑菌活性测定
用无菌接种环挑取试管PDA斜面4℃保存的橘青霉YW322，在PDA平板上划线接种，接种量为一环，28℃培养直至产孢。在菌落表面加无菌水，轻轻刮取孢子，用无菌脱脂棉过滤得到孢子悬浮液。镜检计算孢子浓度，配制1×108孢子/mL的橘青霉YW322孢子悬浮液。
将含有1×108个孢子/mL的1ml橘青霉YW322孢子悬浮液接种到100mL PDB培养基(马铃薯液体培养基，马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL)中，25℃，180rpm摇床培养5d，得发酵液；发酵液经孔径为0.22μm的无菌过滤器过滤后，得发酵滤液，将按体积比1：10加入PDA培养基中，即培养滤液与PDA培养基的体积比为1:10，记为实验组(CF)，以加无菌蒸馏水为对照，记为对照组(CK)。
将一个PDA平板生长7d的尖孢镰刀菌菌块(直径5mm)接种于上述所得含有橘青霉YW322发酵滤液的PDA平板中央，进行滤液处理和对照处理，28℃培养7d，三个重复。
本发明所用尖孢镰刀菌对人参具有强致病性，致病性验证验证过程为：用相同厚度的人参根盘进行孢子悬浮液致病性检测实验，人参根盘进行表面消毒(无菌水清洗，体积百分含量为70％的乙醇浸泡3min，体积百分含量为2.5％次氯酸钠溶液浸泡5min，无菌水涮洗3遍，无菌吸水纸擦干)，放于加无菌滤纸片的培养皿中。根盘表面加一滴1×108孢子/mL的尖孢镰刀菌孢子悬浮液为实验组，对照组加一滴无菌水。静置培养7d，观察根盘组织患病程度。致病性效果见图4，该尖孢镰刀菌对人参具有较强的致病力。
抑制率(IR)根据IR(％)＝(1-CF/CK)×100计算，其中CF表示实验组中尖孢镰刀菌的菌落直径，CK表示对照处理中尖孢镰刀菌的菌落直径。
分别测试短期储存在不同温度(4℃或25℃)的不同日龄(1～7d)的发酵滤液抑菌活性，结果见表3和表4：
表3 4℃储存发酵滤液抑菌活性
Figure BDA0003424614930000091
表4 25℃储存发酵滤液抑菌活性
Figure BDA0003424614930000092
由表3和表4记载的可知，橘青霉YW322发酵滤液随着发酵日龄增加，抑菌活性逐渐增大并趋于稳定，且发酵滤液在4℃、25℃下保存短期内不会影响抑菌活性。
实施例4橘青霉YW322促生特性实验
用无菌接种环在斜面上挑取少量橘青霉YW322的菌体，在新的PDA平板上划线接种，接种量为一环，28℃培养7d，用5mm打孔器取菌块，得橘青霉YW322菌块。
橘青霉YW322发酵液的制备方法：用5个直径5mm大小的橘青霉YW322菌块接种于200mL PDB培养基中，28℃，180rpm，摇床培养7d，得到1.2×108孢子/mL的橘青霉YW322发酵液。
采用Salkowski比色法测定橘青霉YW322发酵液中的生长素IAA(吲哚乙酸)含量，对发酵48h、72h、96h的菌株发酵液测定其OD535值，根据生长素的标准曲线计算其合成生长素含量。
具体步骤为：
定性检测：将冻存的橘青霉YW322用接种环接种到PDA平板上，接种一环，28℃静置培养7d，然后取5个直径5mm大小的菌块接种于200mL PDB培养基中，28℃，180rpm，摇床培养7d，制成种子液。再将1mL的种子液接种于含3mM色氨酸的50mL PDB培养基中，28℃，180rpm，摇床培养7d，得发酵液。取2mL发酵液，6000rpm，4℃，离心10min，取1mL上清液于干净透明的玻璃试管中，同时加入1mL Salkowski比色剂(50mL 30％HClO4+1mL 0.5mol/L FeCl3)混匀。阳性对照只在比色剂中加入1mL 20mg/L的IAA。室温避光放置30min后观察，颜色变红表示菌株能够分泌IAA，以不加色氨酸底物的PDB培养基上生长的橘青霉YW322发酵液为CK，每个处理重复3次。由图7记载的可知，该菌株能够分泌IAA。
定量检测：将1mL的初筛呈阳性的菌株发酵液接种于含3mM色氨酸的50mL PDB培养基中，28℃，180rpm，摇床培养。在48h、72h、96h时，分别取2mL发酵液6000rpm，4℃，离心10min，上清液与Salkowski比色剂等体积混匀。对照是含3mM色氨酸的PDB培养基和比色剂等体积混匀。室温避光放置30min后，测定其OD535值。
采用分析纯的IAA的标准品绘制标准曲线，IAA浓度依次为0、5、10、20、40、60、80、100mg/L，测定其OD535值，IAA标准曲线见表5和图5，数据结果见表6标准曲线为：Y＝0.0141x+0.0284，R2为0.9935。
表5 IAA标准曲线OD535
Figure BDA0003424614930000101
橘青霉YW322发酵液产IAA的浓度和OD535值详见表5。
表6橘青霉YW322发酵液IAA产生浓度
Figure BDA0003424614930000102
Figure BDA0003424614930000111
由图5记载的可知，橘青霉发酵液产IAA能力较强，在96h时浓度能够达到22.52mg/L，可认为该菌株具有一定促进植物生长的能力。
实施例5橘青霉YW322人参根际接种实验
橘青霉YW322发酵液的制备方法：无菌接种环挑取试管斜面保存的橘青霉菌株于PDA平板上划线接种，28℃静置培养7d，然后取5个直径5mm大小的菌块接种于200mL PDB培养基中，28℃，180rpm，摇床培养7d，得到橘青霉YW322发酵液，最终实验所用浓度为1.2×108个孢子/mL。
尖孢镰刀菌菌液的制备方法：同上述橘青霉YW322发酵液的制备方法。
采用两年生人参苗进行盆栽试验，实验共设置4个处理，每个处理3个重复，分别如下：CK(不接菌)、P(橘青霉YW322发酵液，孢子浓度为1.2×108个孢子/mL)、FO(尖孢镰刀菌菌液，孢子浓度为1×108孢子/mL)、P+FO(橘青霉YW322发酵液+尖孢镰刀菌菌液，橘青霉YW322发酵液和尖孢镰刀菌菌液的体积比为1:1)，其中CK(不接菌)、P(橘青霉)、FO(尖孢镰刀菌)。
在三年生人参生长2周后灌根接种，将橘青霉YW322发酵液和尖孢镰刀菌菌液，分别经100倍稀释后(1mL的橘青霉YW322发酵液或尖孢镰刀菌菌液与99mL的水混合)灌根，每盆的灌根量为20mL，隔两周后再灌根一次，再灌根的灌根量与第一次相同；连续培养3个月，进行植株生物学性状解析，结果如表7、图6和图8。
表7各处理地上部分地下部分生物学性状和染病情况
处理 地上高度(cm) 地下长度(cm) 植株染病比率(％)
CK 43.3±2.9 15.8±0.8 -0
FO 40.0±1.1 5.1±0.7 100
P 50.5±8.5 18.4±5.8 0
P+FO 43.2±2.3 16.1±1.9 0
由表7、图6和图8记载的实验数据可知，接种接种尖孢镰刀菌的分组(FO)的处理植株更弱小，人参根部基本完全腐烂；单独接种橘青霉YW322(P)和YW322与尖孢镰刀菌的分组(P+FO)对人参根腐病的防治效果显著，且可促进植物生长，可作为有效的生防菌剂应用。
实施例6生物菌剂田间试验
一、菌剂制作
1.菌种活化：将实施例1得到的橘青霉YW322接种到活化培养基PDA培养基(活化培养基的制作方法：取削皮后的马铃薯20g煮沸20分钟取汁，将汁与2g葡萄糖、1.5g琼脂和水配成100ml，pH6.8～7.0，121℃灭菌15min)上，在28℃培养5d。
2.发酵液制备：将活化好的菌种按1×108个孢子/ml接种至灭菌的液体发酵培养基(1L体积液体发酵培养基中，含有25g玉米粉，15g酵母粉，2g的CaC03，0.2g的MgSO4，0.1gMnSO4)，28℃培养200rpm振荡培养7d，得到橘青霉YW322发酵液，内部孢子数量采用血球计数板确定，浓度为5×108个孢子/ml。
3.固体菌剂制作：将上述获得的发酵液与辅料(方解石、聚乙烯醇、玉米淀粉混合而成，其中方解石、聚乙烯醇、玉米淀粉的质量比为1：1：2)按1mL：1g的比例混合，混合后置于50℃烘箱中，烘8小时，使其含水量小于10％。利用平板计数法检测菌粉中活菌数量，每克生防菌剂中含有的橘青霉活菌数约为5×108个孢子，所得到的物料即为本实施例的生防菌剂。
二、生防菌剂大田试验的应用
1、供试菌液：本发明制备的生防菌剂。
2、供试作物与防治对象：三年生人参，防治对象:人参根腐病。
3、试验地点：黑龙江省牡丹江市人参种植区
4、大田试验：
试验设计及安排：
小区设置：宽1.5m，长2m，土壤为优质农田栽参土壤：曾爆发过根腐病的土壤＝7：3，其中对照组为无菌培养基+填充辅料(填充辅料为方解石、聚乙烯醇、玉米淀粉混合而成，其中方解石、聚乙烯醇、玉米淀粉的质量比为1：1：2)，3m2拌入量为20g，试验1组为生防菌剂，3m2拌入量为20g，试验2组为生防菌剂，3m2拌入量为200g；每个处理重复3次，共计9个小区，随机排列。
试验调查及计算方法：
由于根腐病发生于7～8月高温高湿季节，于8月中旬调查每组发病率。
每组分别统计人参总数、发病棵数，计算发病率、生防率，具体公式如下:
发病率＝发病棵数/总数×100％；
生防率＝(对照组发病率-试验组发病率)/对照组发病率×100％。
收获后的样品测量地上部、地下部长度及干重，调查结果见表8。
表8不同施用量的菌剂对人参根腐病的防治效果
处理组 人参株数 发病数(株) 发病率 生防率
试验1组 99 1 1.01％ 90.5％
试验2组 103 0 0.97％ 90.9％
对照组 102 11 10.7％ 0
注：因田间试验存在种植误差，因此人参总数会有差异。
由表8记载的可知，该生防菌剂对人参根腐病有很好的防治效果。从人参根腐病的发病率与生防率来看，生防率达到90％以上。且对于根部增长具有促进作用，随着施用量的增加，效果更为显著。
由上述实施例记载的可知，采用本发明橘青霉YW322能够有效防治尖孢镰刀菌，而且具有安全，无污染的优势，同时还能促进植物生长。本发明具体实施例通过平板对峙实验显示橘青霉对尖孢镰刀菌生长抑制率可达95.57％，而且橘青霉YW322发酵液抑菌活性稳定；通过促生特性实验验证橘青霉YW322产IAA(吲哚乙酸)能力较强，在96h时浓度可达到22.52mg/L，可见该菌株具有良好的促进植物生长的能力；通过盆栽试验可知，同时接种橘青霉YW322和致病菌的处理，相较于接种致病菌的处理的地上高度和地下长度具有提高。因此，该菌株具有防治孢镰刀菌和促进植物生长的作用。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 东北林业大学
<120> 橘青霉YW322及培养方法、菌剂及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 424
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaacctccc acccgtgttg cccgaaccta tgttgcctcg gcgggccccg cgcccgccga 60
cggcccccct gaacgctgtc tgaagttgca gtctgagacc tataacgaaa ttagttaaaa 120
ctttcaacaa cggatctctt ggttccggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataac 180
taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgagtctttg aacgcacatt gcgccctctg 240
gtattccgga gggcatgcct gtccgagcgt cattgctgcc ctcaagcccg gcttgtgtgt 300
tgggccccgt cccccccgcc ggggggacgg gcccgaaagg cagcggcggc accgcgtccg 360
gtcctcgagc gtatggggct tcgtcacccg ctctagtagg cccggccggc gccagccgac 420
cccc 424
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgtaggtga acctgcgg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (9)

1.一株橘青霉（Penicillium citrinum）YW322，其特征在于，所述的橘青霉YW322的保藏编号为CGMCC No.23201。
2.权利要求1所述橘青霉YW322的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：将橘青霉YW322接种于培养基中，在恒温条件下进行培养，得到扩繁后的橘青霉YW322。
3.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述恒温的温度为28~32℃；所述培养的转速为150~180rmp；所述培养的时间为5~7d。
4.一种防治根腐病的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的有效成分包括权利要求1所述橘青霉YW322的发酵液或权利要求2或3所述培养方法培养所得橘青霉YW322的发酵液；所述根腐病为由尖孢镰刀菌引起的根腐病。
5.根据权利要求4所述生防菌剂，其特征在于，所述橘青霉YW322发酵液中橘青霉YW322的浓度为1.0×108~1.0×109个孢子/mL。
6.根据权利要求4所述生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂还包括填充料。
7.根据权利要求6所述生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂中橘青霉YW322发酵液和填充料的体积质量比为（0.5~1.5）mL：（0.5~2）g。
8.根据权利要求6或7所述生防菌剂，其特征在于，所述填料包括方解石、聚乙烯醇、玉米淀粉；所述方解石、聚乙烯醇、玉米淀粉的质量比为（1~2）：（1~2）：（1~3）。
9.权利要求1所述的橘青霉YW322或权利要求4~8任一项所述生防菌剂在防治根腐病和/或促进植物生长中的应用，其特征在于，所述根腐病为由尖孢镰刀菌引起的根腐病；所述植物为人参。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105462854A (zh) * 2015-12-23 2016-04-06 广西大学 越南槐内生真菌sdte-p在防治三七炭疽病中的应用
CN105462850A (zh) * 2015-12-23 2016-04-06 广西大学 越南槐内生真菌sdte-p在防治三七根腐病中的应用
CN106431609A (zh) * 2016-08-29 2017-02-22 鞍山禾瑞生物科技有限公司 人参\山药\花生专用复合抗重茬生物菌剂及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105462854A (zh) * 2015-12-23 2016-04-06 广西大学 越南槐内生真菌sdte-p在防治三七炭疽病中的应用
CN105462850A (zh) * 2015-12-23 2016-04-06 广西大学 越南槐内生真菌sdte-p在防治三七根腐病中的应用
CN106431609A (zh) * 2016-08-29 2017-02-22 鞍山禾瑞生物科技有限公司 人参\山药\花生专用复合抗重茬生物菌剂及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
3种云南主产中药材上污染真菌在贮藏过程中的变化;宋美芳;张忠廉;李学兰;;时珍国医国药(第04期);全文 *
一株毛竹根部内生细菌SHEN20121的鉴定及其对植物病原真菌的抑制作用;周霄;申小叶;侯成林;;安徽农业大学学报(第05期);全文 *
植物还原法制备纳米银溶胶对3种人参病原真菌的高效抗菌作用;赵虹策;马贵龙;许永华;赵成爱;;农药(第06期);全文 *

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