CN105925498B

CN105925498B - 一株假单胞菌属菌株st4及其在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用

Info

Publication number: CN105925498B
Application number: CN201610256363.0A
Authority: CN
Inventors: 张炼辉; 刘诗胤; 周佳暖; 陈少华; 贺飞
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2016-04-21
Filing date: 2016-04-21
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2036-04-21
Also published as: CN105925498A

Abstract

本发明属于生物防治技术领域，具体公开了一株假单胞菌属菌株（Pseudomonas guariconensis）ST4及其在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。所述菌株于2015年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（ＣＣＴＣＣ），菌种保藏号为CCTCC NO.M 2015526。本发明发现菌株ST4对甘蔗鞭黑粉菌的有性配合具有较好的抑制或推迟效果，阻断双核菌丝体的形成，导致鞭黑粉菌不能正常地侵染甘蔗，这为微生物代替化学合成杀菌剂提供了新的开发资源，可以作为生物农药进行开发利用。

Description

一株假单胞菌属菌株ST4及其在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，具体地，涉及一株假单胞菌属菌株ST4及其在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。

背景技术

甘蔗是世界性重要的糖料作物，也是我国的主要糖料作物，主要分布于广东、广西、云南、福建、海南和台湾等地区，此外，甘蔗还是潜在的可再生能源作物。中国是种植甘蔗较为古老的国家之一，早在公元前4世纪在我国秦岭至海南岛均有分布，是保障我国糖业安全的重要来源。然而，甘蔗鞭黑穗病的发生、发展正逐步威胁着我国，乃至世界各国植蔗区，严重制约甘蔗糖业的发展，对糖业安全造成严重影响。

甘蔗鞭黑穗病最早于1877年南非纳塔尔首次发现，之后陆续在其他植蔗国或地区发现。目前，该病已成为甘蔗的主要病害，严重威胁我国和世界甘蔗产业的可持续、健康安全发展。该病由担子菌门甘蔗鞭黑粉菌引起，每年引起甘蔗产量损失达30％，甚至发病严重地区可达到50-70％。研究发现，甘蔗鞭黑粉菌厚垣孢子近圆形，棕色或黑色，单孢具乳突，大小5-6μm。厚垣孢子在潮湿的环境下，萌发形成长出长短不一的担子，其上着生4个透明、椭圆形的担孢子，其中2个为“+”交配型，2个为“-”交配型，“+”和“-”交配型的担孢子相结合(俗称有性配合)形成具有侵染力的双核菌丝体，该菌丝属活体营养，只有在寄主植物组织内才能不断生长；单独的“+”或“-”担孢子不能形成菌丝，也不具有侵染力，但可以不断芽殖。

甘蔗鞭黑穗病是世界范围内的重要甘蔗病害，然而，对于该病的防治前景并不乐观，因此，该病也被称之为甘蔗“癌症”。目前，甘蔗鞭黑穗病主要防治措施为：一、培育和推广抗性品种，这一方法能够较好的防治黑穗病的发生，然而，新品种的培养往往需要投入大量的人力物力，耗时较长，效果却并不乐观。且黑粉菌的生理小种变化快，容易使抗性品种变为感病品种。二、农业综合防治，农业综合防治是预防所有作物病虫害的基本方法，但投入成本高。三、化学防治，化学防治是目前病虫害防治的主流方法，也是最为行之有效的方法，然而，由于甘蔗的特有性质，其化学防治研究报道非常少，目前市场上也没有某种专门用于防治甘蔗鞭黑穗病的有效化学药物。同时，随着人们对化学农药的深入认识，其污染环境，影响水源，危害人畜安全等问题越发敏感。因此，寻找更为有效且安全的防治植物病虫害方法便成为了广大研究者关注的热点。四、生物防治，生物防治是利用生物的方法来达到防治植物病虫害的目的，近年来，有部分关于甘蔗鞭黑穗病生物防治的报道，但主要都在于筛选能够抑制黑粉菌冬孢子萌发，抑制菌体生长等阶段，并未发现有生物防治甘蔗鞭黑穗病的应用案例。尽管如此，寻求生物方法仍将是防治甘蔗鞭黑穗病的发展方向和有效措施。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一株假单胞菌属菌株(Pseudomonasguariconensis)ST4，所述菌株ST4对甘蔗鞭黑粉菌的有性配合具有较好的抑制或推迟效果，阻断双核菌丝体的形成，导致鞭黑粉菌不能正常的侵染甘蔗，这为微生物代替化学合成杀菌剂提供了新的开发资源，可以作为生物农药进行开发利用。

本发明的另一目的在于提供上述假单胞菌属菌株ST4在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种防治甘蔗鞭黑穗病的生物农药。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一株假单胞菌属菌株(Pseudomonas guariconensis)ST4，所述菌株于2015年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2015526，保藏地址为中国武汉武汉大学，分类命名为Pseudomonas guariconensis ST4。

经研究发现，所述菌株ST4能够在不杀死甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”担孢子的情况下有效抑制黑粉菌双倍体菌丝的形成，即抑制或推迟了甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”担孢子之间的交配发生，导致鞭黑粉菌不能正常的侵染甘蔗。该菌株的发现，既可以解决抗生素滥用问题，又给植物病害防治带来了新思维、新途径和新方法。

优选地，所述菌株ST4为革兰氏阴性，杆状细菌，具有2根极生鞭毛；在营养培养基上菌落呈现米黄色，圆形，中间稍凹，表面光滑半透明，边缘整齐；液体培养基中呈扩散性混浊，PDA平板上产黄绿色色素。

优选地，所述菌株ST4对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、羧苄青霉素的抗性均达到200μg·mL^-1以上，对庆大霉素和卡那霉素的抗性小于10μg·mL^-1。

本发明还提供上述的假单胞菌属菌株(Pseudomonas guariconensis)ST4在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。

优选地，同时添加1～100mg·mL^-1的葡萄糖。更优选的，葡萄糖浓度为20mg·mL^-1。

优选地，所述菌株ST4浓度为OD₆₀₀ 1.0～1.5。

本发明还提供一种防治甘蔗鞭黑穗病的生物制剂，包含上述菌株ST4，菌株浓度为OD₆₀₀ 1.0～1.5。

优选地，所述生物制剂中还含有1～100mg·mL^-1的葡萄糖溶液，

优选地，使用时将所述生物农药按每株100～200μL的OD₆₀₀＝1.0～1.5菌液的接种量接种或者喷施于甘蔗。

优选地，所述接种采用注射接种法。

优选地，接种后的甘蔗采用温室盆栽种植培养。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：经形态、生理生化及分子生物学分析，初步鉴定所述菌株ST4为假单胞菌属P.guariconensis。通过本发明研究表明，菌株ST4在PDA平板上能有效的抑制或推迟甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”担孢子的交配，从而达到对甘蔗鞭黑穗病的防治效果。该细菌能够在不杀死甘蔗鞭黑粉菌的基础上通过抑制或推迟甘蔗鞭黑粉菌的有性配合，从而达到防治甘蔗鞭黑穗病的目的；而且该菌株分离于蔬菜根围土壤，说明菌株ST4对环境能够较好的适应，且对环境友好。本发明发现ST4菌株只有在含有一定浓度葡萄糖的环境下才能有效的抑制甘蔗鞭黑粉菌的有性配合，因此，这对我们进一步研究该菌的生防机制提供了理论基础。

附图说明

图1为菌株ST4对甘蔗鞭黑粉菌有性配合的抑制作用；A为ST4分别对甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子和“+”“-”混合后的抑制效果；B为去除ST4后，甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子生长情况和“+”“-”恢复配合产生双核菌丝体；C为ST4代谢产物对甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子和“+”“-”混合后的抑制效果。

图2为菌株ST4的生长性状；A为ST4在不同糖原下菌落形态及其对甘蔗鞭黑粉菌有性配合的影响(1.为含2％果糖的马铃薯汁培养基，2.为含2％麦芽糖的马铃薯汁培养基，3.为含2％可溶性淀粉的马铃薯汁培养基，4.为含2％蔗糖的马铃薯汁培养基，5.为含2％葡萄糖的马铃薯汁培养基(PDA培养基)，6.为不含外源糖原的马铃薯汁培养基，7.为LB培养基，8.为MM培养基)，B为ST4菌株电镜图(图片大小为200nm)；C为ST4对不同抗生素的抗性评价(CARB为羧苄青霉素，CM为氯霉素，AMP为氨苄青霉素，RIF为利福平，KAN为卡那霉素，GEN为庆大霉素，TET为四环素，STR为链霉素)。

图3为菌株ST4基于16S rDNA基因序列的聚类图。

图4为菌株ST4基于部分rpoD,rpoB和gyrB基因序列的聚类图。

图5为不同处理甘蔗鞭黑穗病的发病情况。

图6为图5中甘蔗鞭黑穗病发病位点放大情况。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1假单胞菌ST4的分离和筛选

土样采集：分离土样于2013年5月2日采至广东省汕头市郊区蔬菜根际周围，刨去表层土壤，收集5～10g深10cm左右蔬菜根际土样，装袋保存带回广州进行菌株分离。

菌株分离：采用稀释平板涂布法进行分离，称取1g分离土样，加9mL无菌水，28℃振荡过夜培养。取1mL培养液10倍梯度稀释，直到10^-8，分别吸取100μL10^-4，10^-6，10^-8稀释液涂布于准备好的LB平板，置于28℃培养至菌落长出后挑取单菌落于1.5mL离心管培养待用。

菌株筛选：利用平板对峙法筛选出具有抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合的潜在生防菌株。对峙平板准备，取20mL PDA倒板，待平板吹干后切成宽0.5cm长6cm长方形小块，每条块间隔0.2cm。将待测菌株1μL点于PDA条带两侧，中间均匀点上甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子，菌落吹干后置于28℃倒置培养1～2d，观察甘蔗鞭黑粉菌生长情况，形成白色绒毛状菌丝后，记录试验结果。试验发现靠近1株细菌编号为ST4菌株周围的甘蔗鞭黑粉菌不能形成绒毛状菌丝，酵母状菌落生长较为缓慢，将该黑粉菌印记转至新的PDA平板上，黑粉菌“+”或“-”担孢子能继续生长，“+”、“-”混合担孢子也能恢复产生绒毛状菌丝(如图1所示)。该结果表明，所发现的细菌能够在不杀死甘蔗鞭黑粉菌担孢子的情况下抑制黑粉菌双倍体菌丝的形成，即抑制或推迟了甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子之间的交配发生。图1C表明该细菌能够产生某种或某类不杀死甘蔗鞭黑粉菌担孢子，而能够阻断或干扰甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子交配的物质。我们知道甘蔗鞭黑粉菌“+”或“-”担孢子均不能侵染甘蔗，只有当“+”、“-”担孢子交配形成双核菌丝体后才能对甘蔗进行侵染，从而引发病害的发生。因此，通过阻断或干扰甘蔗鞭黑粉菌交配的发生便能很好的防治甘蔗鞭黑穗病的发生和发展。本发明获得1株产生非抗生素类生防菌ST4，既可以解决抗生素滥用问题，又给植物病害防治带来了新思维、新途径和新方法。

实施例2生防菌ST4的生物学特性分析

为了能够更好地研究实施例1获得菌株ST4的生防潜力，我们对该菌的一些生物学特性进行了深入的研究。具体操作如下：

用接种环挑取ST4单菌落分别划线和接种于营养培养基和PDA培养基，28℃培养24h，观察菌落生长情况。该细菌在营养培养基上菌落呈现米黄色，圆形，中间稍凹，表面光滑半透明，边缘整齐，液体培养基中呈扩散性混浊，PDA平板上产生大量的黄绿色色素。通过扫描电镜观察发现，如图2B所示，该细菌具有两根极生鞭毛，说明该菌能在自然环境下较好的运动，更好的适应不同环境需要，将大大增加该菌的利用价值。

为了解菌株ST4的生物学特性，研究该菌在不同条件下的抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合的作用效果，本发明通过模拟富营养条件(LB培养基，每升培养基包含胰蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂15g)，成分明确且较为匮乏营养条件(MM培养基，每升培养基包含配方)和适合真菌生长条件(PDA培养基)作为培养对象分别测试菌株ST4对甘蔗鞭黑粉菌有性配合的抑制效果。结果如图2A所示，LB和MM培养条件下，整条甘蔗鞭黑粉菌均长出绒毛状白色菌丝，靠近PDA的甘蔗鞭黑粉菌仅有酵母状菌落，无绒毛状白色菌丝产生，说明ST4在LB和MM培养条件下“+”、“-”混合担孢子能正常交配，并产生具有侵染能力的双核菌丝体，PDA培养条件下能够抑制甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子有性配合的发生。分析PDA发现，该培养基主要包含三部分物质，煮沸的马铃薯汁、葡萄糖和琼脂粉(由于所有培养基均含有琼脂，因此可不做分析)。为了探究影响ST4抑制甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子有性配合的有效物质，我们做了以煮沸的马铃薯汁为基质，改变糖的种类试验。试验结果表明(图2A1-6)，ST4只有在含有葡萄糖和麦芽糖的培养条件下对甘蔗鞭黑粉菌有性配合具有抑制作用，分析发现，麦芽糖在生物体内容易水解成2分子的葡萄糖。因此，研究认为葡萄糖在ST4抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合的过程中起着重要的作用，这对今后ST4菌株的开发和产业化发展提供了基础。

实验还分析了ST4对抗生素的敏感性研究，具体如图2C，该细菌对氨苄青霉素(amp)、四环素(tet)、氯霉素(cm)、羧苄青霉素(carb)有较强的抗性，可达到200μg·mL^-1或200μg·mL^-1以上，对庆大霉素(gen)、卡那霉素(kan)等较为敏感，抗性范围小于10μg·mL^-1。这一结果利于后续研究中选取合适的抗生素作为参考。

实施例3生防菌ST4的鉴定及进化分析

实验对实施例1获得菌株ST4进行形态观察，生理生化分析，电镜分析，Biolog系统分析和主要基因进化分析。形态观察结果表明，该细菌为革兰氏阴性，细胞呈杆状，大小1.9～3.1×0.8～0.9μm，具2根极生鞭毛，在营养培养基上菌落呈现米黄色，圆形，中间稍凹，表面光滑半透明，边缘整齐，液体培养基中呈扩散性混浊，PDA平板上产黄绿色色素。生理生化分析该菌为好氧，运动性，非发酵型细菌，过氧化氢，氧化酶呈阳性，产生可扩散的荧光色素，不能还原硝酸盐，不利用甘油，可在44℃高温，5％NaCl条件下生长。Biolog细菌鉴定委托广东省微生物分析检测中心完成，结果并未在数据库中找到对应的物种，仅与假单胞菌P.fulva相近。

16S rDNA序列分析是细菌鉴定的分子生物学鉴定手段，本发明通过分析16S rDNA序列，结合保守看家基因rpoD和rpoB序列，综合分析了ST4的进化关系，研究表明，ST4的16SrDNA序列与假单胞菌菌P.guariconensis PCAVU11同源性达到最高的99.79％，进化系数与P.guariconensis PCAVU11最为相近的99(图3)，通过分析rpoB,rpoD和gyrB基因序列发现，ST4与P.guariconensis PCAVU11和P.guariconensis LMG 27394最为接近，相似度为100(图4)，因此，结合形态分析，生理生化分析，电镜分析，Biolog分析和进化分析，将该生防菌鉴定为假单胞菌属的P.guariconensis，命名为Pseudomonas guariconensis ST4。并将所述菌株于2015年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为CCTCCNO：M 2015526，保藏地址为中国武汉武汉大学。

实施例4生防菌ST4对甘蔗鞭黑穗病的温室盆栽试验

甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子悬浮液的制备：将在PDA培养基上分别培养2天的“+”、“-”担孢子接种于100mL含30mL液体PD培养基的培养液中，28℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀≈2.0，接种时将“+”、“-”担孢子等比例混匀。生防菌准备：取保存的菌株ST4划线于LB培养基活化，挑取单菌落于液体LB 28℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀≈2.0。

盆栽试验在玻璃温室进行。每个塑料盆钵30*20(直径*高)装2/3混合营养土(普通黄土、塘泥和基质土)，种3个较为均匀的甘蔗种牙，当甘蔗长出3～4片真叶时(基部茎秆直径大概5-8mm，株高30-40cm)，即可用于甘蔗鞭黑粉菌接种试验。接种：样品准备，接种样品分为“+”、“-”孢子混合液(阳性对照)，“+”、“-”孢子和终浓度OD₆₀₀为1.0的ST4混合液，“+”、“-”孢子和终浓度OD₆₀₀为1.0的ST4菌液、葡萄糖终浓度2％的混合液，仅含培养基的空白对照(阴性对照)。接种方法：注射接种，分别吸取上述各组处理液100μL注射接种至甘蔗的茎基部，确保处理液完全进入甘蔗茎秆内，每处理接种30株甘蔗，重复3次。接种后于温室继续生长，定期浇水以免缺水干枯。甘蔗鞭黑穗病发病周期大概为3～4个月，待阳性对照组大部分甘蔗发病后记录病害情况。

实验结果见表1、图4～5所示：

表1生防菌ST4对甘蔗鞭黑穗病的盆栽防治效果

实验结果表明：直接使用ST4与甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子接种，不能减轻甘蔗鞭黑穗病的发生，只有在含葡萄糖的作用下的菌株ST4才能对甘蔗鞭黑穗病起到防治的效果，这与前期不同培养基对ST4抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合的抑制试验相吻合，这对今后ST4利用与田间或推广过程中起着重要的作用，也为我们进一步分析ST4对甘蔗鞭黑粉菌有性配合抑制的作用机制提供参考。

Claims

1.一株假单胞菌属菌株（Pseudomonas guariconensis）ST4，其特征在于，所述菌株于2015年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种保藏号为CCTCC NO. M2015526。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株ST4为革兰氏阴性，杆状细菌，具有2根极生鞭毛；在营养培养基上菌落呈现米黄色，圆形，中间稍凹，表面光滑半透明，边缘整齐；液体培养基中呈扩散性混浊，PDA平板上产黄绿色色素。

3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株ST4对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、羧苄青霉素的抗性均达到200 μg·mL^-1以上，对庆大霉素和卡那霉素的抗性小于10 μg·mL^-1。

4.权利要求1所述的假单胞菌属菌株（Pseudomonas guariconensis）ST4在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用，其特征在于，同时添加1～100 mg·mL^-1的葡萄糖。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌株ST4浓度为OD₆₀₀ 1.0～1.5。

6.一种防治甘蔗鞭黑穗病的生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述菌株ST4，菌株浓度为OD₆₀₀ 1.0～1.5；所述生物制剂中还含有1～100 mg·mL^-1的葡萄糖溶液，

7. 根据权利要求6所述的生物制剂，其特征在于，使用时将所述生物制剂按每株100～200 μL 的OD₆₀₀= 1.0～1.5菌液的接种量接种或者喷施于甘蔗。