CN109055281A

CN109055281A - 贝莱斯芽胞杆菌zf2及其在植物病害防治中的应用

Info

Publication number: CN109055281A
Application number: CN201811120249.0A
Authority: CN
Inventors: 李进; 李进一; 魏芸
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2038-09-19
Also published as: CN109055281B

Abstract

本发明公开了贝莱斯芽胞杆菌ZF2及其在植物病害防治中的应用。本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2，其保藏号为CGMCC NO.16013。上述的芽孢杆菌或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在抑菌中的应用也是本发明保护的范围。本研究菌株ZF2在发酵过程中，培养条件简单，产生大量活性物质并分泌到胞外，对6种病原真菌和7种病原细菌均具有显著的拮抗效果，且在温室盆栽试验中，菌株ZF2对黄瓜棒孢叶斑病的防效高达92.24％，说明其有较好的应用前景，也为菌剂的开发应用提供一定的理论基础和技术支持。

Description

贝莱斯芽胞杆菌ZF2及其在植物病害防治中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种贝莱斯芽胞杆菌ZF2及其在植物病害防治中的应用。

背景技术

黄瓜棒孢叶斑病是大棚栽培黄瓜的重要病害之一，其主要由多主棒孢菌Corynespora cassiicola侵染引发。多主棒孢菌主要侵染寄主植物的叶片，形成典型的病斑，同时也可侵染根、茎、花和果实，严重时会造成落叶、落果等现象。目前由于缺乏抗病品种，生产上对化学防治的依赖性越来越大，使得病原菌在一定程度上对一些常用杀菌剂的敏感性降低，防效下降同时造成果实的农药污染。目前生物防治以其不产生抗药性、无污染、对人畜无毒害等特点被认为是最具发展潜力的重要防治方法。芽胞杆菌具有内生芽胞、繁殖速度快、营养要求简单、抗逆性强、易在植物根围定殖、杀菌效果好、安全性评价好、易于制剂化且成本较低、能诱导抗病性及促生增产等优点，在植物病害生物防治中被广泛研究和使用。近年来，利用贝莱斯芽胞杆菌防治植物病害的应用愈加增多。Lim等筛选到的Bacillus velezensis G341菌株对稻瘟病、水稻纹枯病、辣椒炭疽病、番茄灰霉病、小麦根腐病、大豆白粉病等植物病害均有很强的抑制作用。Fernandez等发现Bacillusvelezensis AH2菌株对葡萄孢菌、腐霉菌、疫霉菌、丝核菌、核盘菌、青霉菌、链格孢菌等均有很强的抑制作用。贝莱斯芽胞杆菌菌株DL-59的菌剂对白菜黑斑病的防效达79.07％，可有效抑制链格孢的生长。

发明内容

本发明的一个目的是提供贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2，其保藏号为CGMCCNO.16013。

上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在抑菌中的应用也是本发明保护的范围。

上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在制备植物生防制剂中的应用也是本发明保护的范围。

上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在防治植物病害中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述病害为病原菌引发的病；

所述病原菌或所述抑菌的菌为真菌或细菌；

和/或，所述真菌为黄瓜棒孢病菌、辣椒炭疽病菌、番茄早疫病菌、辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌和黄瓜棒孢病菌中至少一种。

和/或，所述细菌为黄瓜茎软腐病菌、花椰菜黑腐病菌、番茄溃疡病菌、黄瓜角斑病菌、葡萄根癌病菌、番茄斑点病菌和番茄青枯病菌中至少一种。

上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在制备蛋白酶和/或纤维素酶中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种防治植物病害的方法。

本发明提供的方法，为将上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2或其培养液或其菌悬液或其发酵产物作用植物，实现防治植物黄瓜棒孢叶斑病。

上述方法中，所述病害为病原菌引发的病；

所述病原菌为真菌或细菌；

本发明第3个目的是提供一种制备蛋白酶和/或纤维素酶的方法。

本发明提供的方法，为培养或发酵上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF2，得到蛋白酶和/或纤维素酶。

本发明第4个目的是提供一种抑菌的方法。

本发明提供的方法，为将培养或发酵上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF2，收集产物，过滤所述产物得到滤液，再将所述滤液作用病菌培养体系，实现抑制病菌。

所述病菌为黄瓜棒孢菌。

所述发酵的时间为48h；

所述滤液作用病菌培养体系是按照体积比为10％的比例添加到病菌培养体系。

所述发酵液通过0.22μm的滤芯过滤，收集滤液。在20ml PDA培养基中混入滤液，使其浓度分别为1％、5％和10％。

本研究从黄瓜植株中分离到一株对多主棒孢菌具有明显拮抗作用的内生菌株ZF2。根据菌体形态特征、生理生化指标及16S rDNA序列分析，初步鉴定菌株ZF2为贝莱斯芽胞杆菌。试验结果表明，菌株ZF2能够产生蛋白酶、纤维素酶等抑菌活性物质，引起病原真菌菌丝畸形，因此表现出对多种病害的广谱抗性。本研究通过酶活试验，定性测定了菌株ZF2代谢产物中含有蛋白酶和纤维素酶。植物病害生物防治从实验室到田间还有很大差距，其生防效果往往受多种环境因素的影响。菌株ZF2在发酵过程中，培养条件简单，产生大量活性物质并分泌到胞外，对6种病原真菌和7种病原细菌均具有显著的拮抗效果，且在温室盆栽试验中，菌株ZF2对黄瓜棒孢叶斑病的防效高达92.24％，说明其有较好的应用前景，也为菌剂的开发应用提供一定的理论基础和技术支持。

保藏说明

菌种名称：贝莱斯芽胞杆菌

拉丁名：Bacillus velezensis

分类命名：贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis

菌株编号：ZF2

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年6月28日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.16013

附图说明

图1为ZF2菌株对多主棒孢菌的抑制作用。

图2为ZF2菌株基于16S rDNA序列的系统进化树。

图3为ZF2菌株酶活性测定。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用供试菌株如下：

拮抗细菌：菌株ZF1-ZF10分离自中国农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综防组大棚内的黄瓜植株。

下列病原菌均为单一的菌种，具体出处如下：

病原真菌：多主棒孢菌Corynespora cassiicola、辣椒炭疽病菌Colletotrichumspp.、辣椒疫病菌Phytophthora capsici、番茄灰霉病菌Botrytiscinerea、番茄枯萎病菌Fusarium oxysporum、娃娃菜茎基腐病菌Rhizoctonia solani、番茄早疫病菌Alternaria solani。

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)已在文献“高苇、李宝聚、石延霞、谢学文.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化.园艺学报2011,38(3)：465-470.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

辣椒炭疽病菌(Colletotrichum spp.)已在文献“王莹莹、张自心、谢学文、郭现坤、晋知文、韩之琪、李宝聚.辣椒炭疽病的诊断与防治.中国蔬菜2014，(11)：74-76.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)已在文献“江厚春、李宝聚、石延霞、谢学文、吕国华.辣椒疫病土壤和种子带菌的初步研究.华北农学报2011,26(增刊)：233-237.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)已在文献“李凤云、李宝聚、许淑艳.番茄灰霉病病原菌的生物学特性.辽宁农业科学1992,4:34-36.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)和娃娃菜茎基腐病菌(Rhizoctoniasolani)已在文献“高苇、李宝聚、孙军德、石延霞、金丹.绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用.中国蔬菜2008，(6)：9-12.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

番茄早疫病菌(Alternaria solani)已在文献“柴阿丽、石延霞、谢学文、帕提古丽、李宝聚.加工番茄早疫病病原菌鉴定.华北农学报2015，30(增刊)：316-320.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

病原细菌：黄瓜细菌性茎软腐病菌Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense、黄瓜细菌性角斑病菌Pseudomonas syringae pv.lachrymans、番茄细菌性叶斑病菌Pseudomonas syringae pv.tomato、葡萄根癌病菌Agrobacterium vitis、番茄青枯病菌Ralstonia solanacearum、花椰菜黑腐病菌Xanthomonas campestrispv.campestris、番茄溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis。

黄瓜细菌性茎软腐病菌(Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense)已在文献“冯志琴.胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense)引起的黄瓜细菌性软腐病在中国发生.中国植保导刊2017,37(7)：58-62.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)已在文献“石延霞、张楠、李宝聚.细菌性角斑病病菌诱导黄瓜产生系统抗病性机理的研究.园艺学报2008，35(2)：221-226.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)已在文献“李宝聚、朱辉、石延霞.番茄细菌性斑点病的识别与防治.长江蔬菜2008,9:23-24.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

葡萄根癌病菌(Agrobacterium vitis)已在文献“李金云、王慧敏、王建辉.根癌病生防菌E26菌株产生细菌素的初步研究.中国农业科学2004，37(12)：1860-1865.”中公开，公众可从中国农业大学资源与环境学院获得。

番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)已在文献“李焕玲、钏锦霞、李宝聚.茄果类蔬菜细菌性病害种类.中国蔬菜2013，15:23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

花椰菜黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)已在文献“张扬、李金萍、周慧敏、李宝聚.十字花科蔬菜细菌性黑腐病的发生规律及防治.中国蔬菜2011，17:23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)已在文献“李焕玲、石延霞、谢学文、李宝聚.番茄溃疡病的发生规律与防治技术.中国蔬菜2011，23:24-27.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

以上菌株均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综防组保存；也可由申请人获得。

下述实施例中供试培养基如下：

胰蛋白胨液体培养基(LB)：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml。胰蛋白胨固体培养基(LB)：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。水琼脂培养基(WA)：琼脂5g，蒸馏水1000ml。分装5ml试管。蛋白胨牛肉粉液体培养基(NB)：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。蛋白胨牛肉粉培养基(NA)：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7.0。纤维素酶培养基(CMC)：MgSO₄ 0.1g，(NH₄)₂SO₄ 1g，酵母粉5g，甘油2ml，羧甲基纤维素1g，Bacto Agar 8g，10×Phosphate Buffer100ml，蒸馏水900ml。蛋白酶培养基(NA+Skin Milk)：NA培养基900ml，脱脂牛奶100ml。牛肉膏蛋白胨酵母粉培养基(BPY)：牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml。黄豆粉3培养基：黄豆饼粉25g，淀粉10g，葡萄糖10g，KH₂PO₄ 1g，K₂HPO₄ 1g，FeSO₄·7H₂O0.02g，CaCO₃ 1g，蒸馏水1000ml。黄豆粉8培养基：黄豆饼粉30g，蛋白胨2g，KH₂PO₄ 0.2g，CaCO₃ 1g，葡萄糖5g，酵母粉3g，蒸馏水1000ml。玉米培养基：玉米粒500g，蒸馏水1000ml。黄豆粉+玉米粉培养基：玉米粉30g，黄豆饼粉30g，(NH₄)₂SO₄ 0.3g，MgSO₄ 0.3g，KH₂PO₄ 2g，CaCO₃ 1g，蒸馏水1000ml。生理生化特性测定所用培养基参见《常见细菌系统鉴定手册》。

实施例1、生防芽胞杆菌ZF2的分离、纯化和鉴定

1、生防芽胞杆菌的分离

将黄瓜植株用水冲洗干净，用1％的次氯酸钠水溶液表面消毒1min，再用无菌水漂洗黄瓜植株3次。将表面消毒的黄瓜植株约2g放入已灭菌的研钵中，加少量灭菌的石英砂和10ml无菌水进行充分研磨，取研磨汁液1ml，加入含9ml无菌水的试管中，混合均匀后，梯度稀释至10^-6浓度，将10^-4、10^-5、10^-6浓度的菌液在80℃的水浴中保持30min以杀死绝大部分非芽胞杆菌，取100μl涂LB固体平板，每浓度涂3个平板，28℃下培养。培养1天后，挑取不同的单菌落，保存于-80℃冻存管中，共得到32株芽胞杆菌。

2、拮抗菌的筛选及病原真菌菌丝形态观察

活化多主棒孢菌作为靶标菌，用平板对峙法确定分离得到的细菌的拮抗能力。在90mm PDA平板中心接种5mm多主棒孢菌菌片，28℃下培养2d。将上述1得到的芽胞杆菌单菌接种在液体LB培养基中，28℃下震荡培养16h，得到菌悬液。在距离培养皿边缘10mm处相对的4点用10μl枪头打孔，在其中点入5μl菌悬液，设置只接入LB液体培养基的空白对照，28℃下培养。待空白对照菌丝即将长至LB液体培养基接种点时，测量靶标菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种细菌后的生长半径)，用抑菌率表示。抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100％。在对峙平板上多主棒孢菌落边界处挑取菌丝，置于光学显微镜下观察。

结果通过对多主棒孢抑制效果的初步筛选，得到10株对多主棒孢具有较强抑制作用的芽胞杆菌，对其编号为ZF1-ZF10(表1所示)。

为得到对多主棒孢菌具有最好抑制作用的细菌，利用平板对峙法对10株菌进行复筛。试验结果表明：十株细菌均对黄瓜多主棒孢菌有较好的抑制作用，菌丝生长被抑制。其中，在菌株ZF2处理下，多主棒孢菌落呈现正方形，有明显的直线边界，边界处培养基变黑，抑制率最大，达60.10％(图1，A：菌株ZF2对多主棒孢菌抑制效果Inhibition effect ofstrain ZF2on Corynespora cassiiacola；B：对照Control；C：多主棒孢菌丝形态变化Changes of Corynespora cassiiacola mycelium；D：对照Control)。

挑取菌株ZF2平板对峙实验中多主棒孢边界处菌丝，制作乳酚油玻片。在光学显微镜下的观察结果表明正常的多主棒孢菌丝较细，壁光滑。菌株ZF2能够大面积引起黄瓜棒孢菌菌丝的畸变。经过菌株ZF2处理过的菌丝变粗，分支增多，呈念珠状球型或椭球型连续膨胀，形成空泡，空泡内有浑浊的物质，原生质体外溢。与对照菌丝相比颜色暗，发黑，与平板对峙实验中，交界处培养基和菌丝变黑的现象相一致。推测菌株ZF2的代谢产物可能会破坏多主棒孢的细胞壁，造成菌丝畸形。

表1十株细菌对多主棒孢的抑制率

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。

3、菌株ZF2的鉴定

将上述筛选的菌株ZF2进行如下鉴定：

1)菌株ZF2表型观察

菌株ZF2在LB培养基上单菌落较大，淡黄色，表面较干，有山脊状的突出褶皱。

2)生理生化特性分析

参考东秀珠等的方法，对菌株ZF2分别进行生长温度试验、耐盐性试验、游动性试验、接触酶试验、V-P试验、M-R试验、淀粉水解试验、柠檬酸盐的利用试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验等生理生化试验。

生理生化测定结果如表2所示，菌株ZF2为革兰氏阳性菌，28℃-37℃之间，NaCl含量2％-10％之间均可以生长，有游动性。接触酶、V-P、M-R、淀粉水解反应为阳性，柠檬酸盐利用、明胶液化、硝酸盐还原反应为阴性。初步鉴定菌株ZF2属于芽孢杆菌属。

表2菌株ZF2生理生化特征

2)16S rDNA基因扩增及序列分析

用普通细菌基因组提取试剂盒小量提取菌株ZF2的基因组DNA后，利用通用引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环，72℃补充延伸10min。由博迈德生物公司进行序列测定。将得到的序列与其他细菌来源的16SrDNA序列进行比对，用MEGA6.0构建系统发育树，分析其亲缘关系。

结果菌株ZF2经16S rDNA PCR扩增后，得到一条1381bp的DNA片段(序列1)，16SrDNA测序所得到的序列BLAST比对结果发现：菌株ZF2与贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis strain JTYP2的16S rDNA的序列同源性高达100％。分析菌株ZF2的16SrDNA的系统发育树(图2)，确定菌株ZF2为贝莱斯芽胞杆菌。

将菌种ZF2于2018年6月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16013，分类命名为贝莱斯芽胞杆菌。

实施例2、菌株ZF2的功能研究

1、菌株ZF2在抑菌中的应用

1)真菌抑菌谱测定

方法参照实施例1的拮抗菌的筛选。

2)细菌抑菌谱测定

对病原细菌的抑菌谱试验采取双层培养的方法。将菌株ZF2接种在液体LB培养基中，28℃下震荡培养16h，得到ZF2菌悬液。在90mm玻璃PDA平板中心，用10μl枪头打孔，在其中点入5μlZF2菌悬液，28℃下培养24h。将培养皿倒置，在通风橱中在每个培养皿里加入3ml氯仿，通风12h。将病原细菌在28℃下NB培养基中震荡培养48h，在5ml 5％(m/v)WA培养基中加入100μl菌悬液，倒入PDA平板，作为上层。培养箱中培养48h，观察抑菌圈。

结果如表3所示，菌株ZF2可以有效抑制黄瓜棒孢病菌、辣椒炭疽病菌、番茄早疫病菌、辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌和番茄灰霉病菌的菌丝生长，而对娃娃菜茎基腐病菌没有抑制作用。对辣椒炭疽病菌和黄瓜棒孢病菌的抑制率在60％以上，对其他病原真菌的抑制率可达到37％以上。

菌株ZF2对病原细菌也有很好的抑制效果，对黄瓜茎软腐病菌、花椰菜黑腐病菌、番茄溃疡病菌、黄瓜角斑病菌的抑菌直径均在5.0cm以上，还可抑制葡萄根癌病菌、番茄斑点病菌和番茄青枯病菌的生长。

表3 ZF2菌株对病原菌的抑菌效果

注：+++表示细菌抑菌直径大于等于5.0cm或真菌抑菌率大于等于60％；++表示细菌抑菌直径大于等于4.0cm小于5.0cm或真菌抑菌率大于等于40％小于60％；+表示细菌抑菌直径小于4.0cm或真菌抑菌率小于40％；-表示无抑制作用。

2、菌株ZF2酶活性检测

1)蛋白酶的检测

在脱脂牛奶培养基中心位置接种ZF2菌悬液的5μl，28℃培养24h后观察消解圈。

2)纤维素酶的检测

在CMC培养基中心位置接种ZF2菌悬液5μl，28℃培养24h后，加入3ml刚果红染料，染色30min，倒掉染料，再加入5ml 1mol/L NaCl水溶液，脱色15min，观察消解圈。

结果如图3所示，A：蛋白酶Protease；B：纤维素酶Celluase；菌株ZF2在脱脂牛奶培养基中有非常明显的透明圈产生，在CMC培养基中经过染色、脱色，形成黄色的半透明圈。因此，推测代谢产物中有蛋白酶和纤维素酶，破坏多主棒孢菌丝细胞壁，使菌丝畸形，从而抑制菌丝生长。

3、菌株ZF2不同发酵时间和不同培养基中发酵液对黄瓜棒孢菌生长的抑制效果

1)不同发酵时间发酵液对黄瓜棒孢菌生长的抑制效果

以NB培养基为基质，用灭过菌的牙签挑取芽胞杆菌ZF2至NB培养基中，以200r/min的转速放置于28℃恒温震荡培养箱中震荡培养24h。向250ml的三角瓶中加入NB液体培养基100ml，将已振荡培养24h的菌种按照5:100的比例量接入三角瓶，以200r/min的转速放置于28℃恒温震荡培养箱中震荡培养不同的时间(黑暗条件下)，震荡培养时间设为48、96、120h。当震荡时间到达时，将发酵液以10,000转的转速离心15min，弃掉沉淀，留取上清液。将发酵液通过0.22μm的滤芯过滤，收集滤液。在20ml PDA培养基中混入滤液，使其浓度分别为1％、5％和10％，设置3个重复，并以不加发酵液的PDA平板接菌作为对照。在平板中央接入黄瓜棒孢叶斑病病原菌的菌碟，28℃培养3d，计量其菌落生长直径和菌落形态。

结果如表4所示，与对照平板相比，添加过发酵液的平板上黄瓜棒孢菌碟的生长受抑制。在添加了48、96和120h发酵液的平板中，随着添加的比例越大，菌丝受抑制的程度也越大。发酵时间为48h的发酵液，三种添加比例处理下的抑制率差异不显著；发酵时间越长，三种添加比例处理下的抑制率差异显著。单独对比同一添加浓度时，可以发现发酵液的发酵时间越长，对黄瓜棒孢菌的抑制越差。推测菌株ZF2产生的抑菌物质可能会随着时间而分解。发酵时间为48h的发酵液以10％(体积百分含量)的比例添加到PDA培养基中时，抑制率最大，达到62.90％。

表4不同培养时间的ZF2菌株滤液对多主棒孢菌菌落生长的抑制作用

2)不同培养基中发酵液对黄瓜棒孢菌生长的抑制效果

将菌株ZF2接入相应的液体培养基(LB、NB、BPY、黄豆粉3、黄豆粉8、玉米粉、黄豆粉+玉米粉)中，发酵培养时间为168h。

结果如表5所示，七种类型培养基中，BPY培养基发酵滤液以三种不同比例添加后的抑制率差异不显著，而玉米培养基和黄豆粉+玉米粉培养基的发酵滤液在三种不同处理下的抑制率差异显著。当添加比例为1％时，七种培养基对黄瓜棒孢的抑制率较低，均在50％以下。当添加比例为10％时，七种培养基的发酵滤液对黄瓜棒孢的抑制率均在55％以上。对黄瓜棒孢菌抑制率最大的处理为以10％比例添加玉米培养基发酵液，抑制率为63.98％。

表5 ZF2菌株在不同培养基中的发酵液对多主棒孢菌的抑制效果

4、菌株ZF2活体防效试验

将OD₆₀₀值为0.8的ZF2悬液喷洒在黄瓜幼苗上，保湿24h。再用毛刷把多主棒孢的孢子刷入无菌水中，配置成孢子浓度为10⁵个/ml的悬液，等量均匀喷洒在黄瓜幼苗上，设置只接种棒孢孢子悬液的对照组和接种百菌清(青岛海纳生物科技有限公司，产品类型：杀菌剂，农药登记证：PD20141671，产品标准证：GB18171-2000)500倍稀释液的阳性对照，保湿培养7-10d。观察统计每片叶子的发病指数，计算发病率。按照阚琳娜等的分级标准调查黄瓜的发病情况，计算病情指数与防治效果。病情指数＝100×∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)。防治效果(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。

结果如表6所示，从黄瓜中分离出来的拮抗菌ZF2在温室条件下对多主棒孢菌引发的黄瓜棒孢叶斑病有良好的防治效果。接种菌株ZF2的黄瓜植株病情指数为2.68，相比只接种多主棒孢菌的对照试验组，病情指数下降31.89。从防治效果来看，菌株ZF2对黄瓜棒孢叶斑病的防效为92.24％，接近化学药剂百菌清的防治效果。

表6 ZF2菌株对黄瓜棒孢叶斑病的盆栽防效

序列表

<110>北京化工大学

<120> 贝莱斯芽胞杆菌ZF2及其在植物病害防治中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1165

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa 60

gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt 120

cagacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt 180

tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc 240

acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc 300

aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa 360

gctctgttgt tagggaagaa caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta 420

accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 480

tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc 540

ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag 600

tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg 660

cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag 720

ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct 780

tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac 840

tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 900

gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt 960

cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1020

taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta 1080

aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1140

tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg 1200

ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg 1260

aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1320

gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt 1380

t 1381

Claims

1.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2，其保藏号为CGMCC NO.16013。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在抑菌中的应用。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在制备植物生防制剂中的应用。

4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在防治植物病害中的应用。

5.根据权利要求2-4中任一所述的应用，其特征在于：

所述病害为病原菌引发的病；

所述病原菌或所述抑菌的菌为真菌或细菌；

6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在制备蛋白酶和/或纤维素酶中的应用。

7.一种防治植物病害的方法，为将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF2或其培养液或其菌悬液或其发酵产物作用植物，实现防治植物黄瓜棒孢叶斑病。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述病害为病原菌引发的病；

所述病原菌为真菌或细菌；

9.一种制备蛋白酶和/或纤维素酶的方法，为培养或发酵权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF2，得到蛋白酶和/或纤维素酶。

10.一种抑菌的方法，为将培养或发酵权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF2，收集产物，过滤所述产物得到滤液，再将所述滤液作用病菌培养体系，实现抑制病菌。