CN105441366B - 甲基营养型芽孢杆菌zbl-1在防治棉花黄萎病中应用 - Google Patents
甲基营养型芽孢杆菌zbl-1在防治棉花黄萎病中应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种甲基营养型芽孢杆菌ZBL‑1在防治棉花黄萎病中应用，通过在石河子市重病棉田地区采集的土壤样品中分离、筛选、选育、驯化，获得一株对大丽轮枝菌有较高抑制效果的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL‑1 CGMCC No.11636，与常见的甲基营养型芽孢杆菌菌株存在明显不同，同时，利用筛选出的菌株ZBL‑1对在室内盆栽试验中对棉花黄萎病的防治效果为73.0%；在田间小区实验中其防治效果为43.1%，作为棉花黄萎病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景，具有现实的意义和作用。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物生防技术领域，具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌及其在防治棉花病害中应用的技术领域。
背景技术
棉花黄萎病是世界性的重要病害之一，自1935年由引进美国斯字棉种而传入中国，并逐年传播扩散。20世纪90年代后，该病已经蔓延到包括新疆在内的各个棉区，尤其是1993年该病在我国各棉区大面积流行，发病面积高达267万hm2，造成损失皮棉1亿kg(简桂良等，2003；徐理等，2012；朱荷琴等，2012)。目前黄萎病的危害已成为我国自枯萎病得到有效控制之后棉花生产上的第一大病害，严重影响棉花的产量，是棉花可持续生产的主要障碍之一。
我国主要棉区的棉花黄萎病菌以大丽轮枝菌为主(张绪振等，1981)。棉花黄萎病病原菌变异性较大，存在明显的生理分化现象。防治困难，目前防治该病主要依靠种植耐病品种，由于抗性种质资源缺乏导致抗病育种进展缓慢，生产上缺乏真正有效的抗病品种；化学防治措施无法控制该病，且带来严重污染。随着对环境安全的逐渐重视以及生物菌剂防治作用机制的深入研究，利用生物防治被认为是治理棉花黄萎病最具发展潜力的方法(马平等，2003)。
目前，国内外有关对于大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起棉花黄萎病菌从生物基因、发病机理等方面都有大量记载，比如大丽轮枝菌致病性相关蛋白VdpdaA1的用途(专利申请号为2015102972676)；鉴定大丽轮枝菌致病型的方法和试剂盒及含有的核酸和引物对(专利申请号为2013105871254)；棉花的内生真菌CEF-193及其应用(专利申请号为2014101791560)，从棉花的内生真菌入手，通过分离、筛选、鉴定、温室的生物测定，获得对棉花黄萎病具有显著诱导免疫作用的菌株CEF-93(Acremonium alternatum)，保藏编号为CGMCC No.8302，CEF-193能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，以利于工厂化生产和推广应用。尽管通过室内抑菌试验表明，对黄萎病控制效果好。但是，该专利公开提供的CEF-193为芳香顶孢霉真菌，本发明提供的为甲基营养型芽孢杆菌，可耐9％的NaCl；CEF-193的作用方式为诱导免疫，本发明提供的菌种作用方式为对病原菌的直接抑菌；同时CEF-193其仅测定了室内盆栽的防效。
对于甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)研究目前在国内外都有大量的记载和披露，主要体现在利用自主筛选的各种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)对于香蕉枯萎病、农作物的青枯病、炭疽病、白菜软瘤病、水稻白叶枯病、水稻条斑病、棉花角斑病、诱腐病、黑斑病、根瘤病、黄瓜灰霉病、苹果腐烂病、禾谷镰刀病、西瓜枯萎病生防方面都有记载，主要从对单一病原菌的防治效果的角度出发，对于解决棉花黄萎病的防治角度不适用；对于安徽农业大学公布的一种甲基营养型芽孢杆菌株及其应用(专利申请号为2015103366565，公开号为CN 105039204 A)，记载了一种甲基营养型芽孢杆菌株CGMCC No.10779在拮抗植物病原菌中的应用，尤其是在拮抗麦冬炭疽病病原菌中的应用，并且明确指出在棉花枯萎病防治中有效果。该发明有益效果体现在：一是甲基营养型芽孢杆菌株CGMCC No.10779对多种植物病原菌，如西瓜枯萎病、棉花枯萎病、玉米小斑病病原菌具有拮抗作用，尤其是对麦冬炭疽病病原菌具有非常高效的拮抗作用，是一种防治植物病害效果高、环境友好、生物防治大的拮抗菌株，具有良好的开发应用前景。二是提供的甲基营养型芽孢杆菌株CGMCC No.10779耐盐能力强，在氯化钠含量达9％的培养基上依然能够生长，抗逆能力强，可适用于环境较为恶劣的土地，潜在应用价值高。但是该筛选的生防菌是针对一种或几种病原菌进行抑菌能力测定，重视生防菌的广谱性，而未做生防菌对单一病原菌不同生理小种(型)之间拮抗能力差异性的研究。同时，安徽农业大学公布一种甲基营养型芽孢杆菌株，其保藏号为：CGMCCNo.10779。通过公开披露的结果显示，菌株N5与数据库中Bacillus ethylotrophicusCBMB205T(EU194897)相似性为100％，菌落形态特征、生理生化特征、同源性和系统发育分析，菌株N5被鉴定为甲基营养型芽孢杆菌株(Bacillus methylotrophicus)，实际上是一种与常见的甲基营养型芽孢杆菌株(Bacillusmethylotrophicus)属于同种同属，通过基因分子核实，属于同一种菌种。
生物防治不仅可降低对环境的影响，还不易产生抗药性。甲基营养型芽孢杆菌营养简单，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，具有开发为生物防控菌剂的潜力。
发明内容
针对现有技术中有关甲基营养型芽孢杆菌及其在防治不同地域棉花黄萎病中的应用的相关报道较少，且现有防治技术效果差存在诸多不足的技术现状，本发明旨在为棉花黄萎病提供具有相对高防治能力且性能稳定一种新的抗性菌株。本发明通过在土壤的菌悬液中分离筛选出一株对大丽轮枝菌有较高抑制效果的真菌菌株ZBL-1，与常见的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)不同的新菌种，通过利用分离出的新菌种对棉花黄萎病进行生物处理，并提供一种利用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636进行棉花黄萎病生物防治中应用技术方案，在室内盆栽试验中ZBL-1发酵液对棉花黄萎病的防治效果为73.0％；在田间小区实验中其防治效果为43.1％，作为棉花黄萎病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。
本发明采用的主要技术方案：
本发明土壤样品由新疆农业科学院植物保护研究所采自石河子市重病棉田地区，将采集的土壤样品经LB培养基筛选分离，大量筛选优选出一批生长良好的生防菌株，从中筛选出一株对防治棉花黄萎病显著的芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株ZBL-1。通过对所获菌株进行形态特征、生理生化特性及总DNA的提取、16SrDNA的PCR扩增和序列测定及系统发育分析，初步确定了是一株新菌，并依据其分类地位，通过优化选育驯化获得一种与常见的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)菌株存在明显不同特性的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株。同时，利用筛选出的菌株ZBL-1对在室内盆栽试验中对棉花黄萎病的防治效果为73.0％；在田间小区实验中其防治效果为43.1％，是一种典型性突出、专一性强的生防菌。
本发明具体提供一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636，通过在采集的土壤样品中分离筛选和培养，获得一批芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，从中筛选出一株对防治棉花黄萎病方面具有突出功效的甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1，经微生物学分类与鉴定，属于甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株。
具体的，本发明通过对石河子市棉花黄萎病重病棉田地区采集土壤样品，进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为ZBL-1的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。2015年11月9日，菌种保藏号为CGMCC No.11636。经微生物学鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)，从其分类学归类为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。该菌株最适生长条件为：温度30℃，培养基采用LB培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，蒸馏水1L，pH自然)。
ZBL-1菌株的菌体革兰氏染色阳性，形态特征为：在显微镜下菌体杆状，产芽孢，周生鞭毛；培养特性为菌落圆形，表面有皱褶，不透明，白色。根据以上形态特征，参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)对ZBL-1菌株进行形态学，生理生化鉴定，并结合分子生物学测序，初步鉴定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。分子测序结果表明，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636的16SrDNA序列为1452bp，与Bacillusmethylotrophicus(EU194897.1)同源性最高，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1与常见的甲基营养型芽孢杆菌有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为ZBL-1的菌种尽管与常见的甲基营养型芽孢杆菌相比，具有共性的一些属性，但是依据与常见的甲基营养型芽孢杆菌有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，表明ZBL-1菌株是一种典型的新菌种，从分类学将ZBL-1菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。
本发明进而提供甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636的分离和培养方法。
1.分离培养基采用：LB培养基，蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，蒸馏水1L，pH自然。
2.分离和筛选条件：采取梯度稀释法，称取10g采集的土壤样品于90ml无菌水中，振荡15min，后进行梯度稀释，选取原液、10-4、10-5、10-6稀释液分别涂布于分离培养基平板上，每个处理3个重复，置30℃培养。待长出细菌菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。
经培养筛选确定的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636在LB培养基上菌株菌落圆形，表面有皱褶，不透明，白色；LB培养基，蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，蒸馏水1L，pH自然。
进一步，本发明提供一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636在防治棉花黄萎病中应用。其发酵液在室内盆栽试验中对棉花黄萎病的防治效果为73.0％；在田间小区实验中其防治效果为43.1％，是一种典型性突出、专一性强的生防菌。
通过实施本发明具体技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636，具有耐盐、抑菌性强的特点。
(2)本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636在平板培养时可高效抑制大丽轮枝菌，培养15d时对大丽轮枝菌最高抑菌率为81.6％，对20株不同大丽轮枝菌菌株的平均抑制率为75.5％；在室内盆栽试验中ZBL-1发酵液对棉花黄萎病的防治效果为73.0％；在田间小区实验中其防治效果为43.1％，作为棉花黄萎病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。
附图说明
图1所示为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636的菌体照片。
图2所示为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636系统发育树状图。
图3所示为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636对大丽轮枝菌的平板拮抗图，其中A为对照组，B为ZBL-1试验组。
图4所示为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636产挥发性气体对大丽轮枝菌的平板拮抗图，其中A为对照组，B为ZBL-1试验组。
图5所示为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636对棉花黄萎病的盆栽效果图，其中A为ZBL-1试验组，B为对照组，C为ZBL-1+大丽轮枝菌试验组，D为大丽轮枝菌试验组。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
LB液体培养基：由溶剂和溶质组成，溶质为蛋白胨、酵母提取物和NaCl，溶剂为水；蛋白胨在LB液体培养基中的浓度为1％，酵母提取物在LB液体培养基中的浓度为0.5％，NaCl在LB液体培养基中的浓度为0.5％，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。
LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂(琼脂与液体培养基的比例为1.5g：100ml)，得到LB固体培养基。
PDA培养基：马铃薯200g，加入少量水煮20min，三层纱布过滤，取滤液用水定容至1L，加入20g葡萄糖，15g琼脂，121℃高压灭菌25min。
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)，为新疆农科院植保所自新疆棉花黄萎病田采集分离获得，均经过单孢纯化。在文献“刘海洋,王伟,张仁福,武刚,姚举.新疆棉花黄萎病发生调查及病原菌系统进化分析.新疆农业科学,2015,52(1)：65-71.”中公开过，公众可从新疆农业科学院植物保护研究所获得，由大丽轮枝菌引起的黄萎病是世界性的棉花重要病害之一是本领域普通技术人员所公知。
中棉35棉花品种在文献“姜伟,刘小平.中棉35在阿拉尔品比试验.塔里木农垦大学学报,2001,13(1):5-8.”中公开过，公众可从阿拉尔农业科学研究所获得。
实施例一：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636的分离、筛选及鉴定
1、菌种的分离和筛选
本发明所使用的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)由新疆农业科学院植物保护研究所从新疆石河子市重病棉田区中未发病棉花根系大量采集土壤中取样，在无菌蒸馏水中震荡后制备菌悬液，利用传统的平板培养法分离出土层中的细菌，平板划线法纯化菌株，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，经过优化筛选出一批生长良好的细菌菌株，从中优选出一株编号为ZBL-1的菌株。
分离步骤：
(1)分离培养基采用：LB培养基，蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，蒸馏水1L，pH自然。
(2)分离和筛选条件：采取梯度稀释法，称取10g采集土壤样品于90ml无菌水中，振荡15min，后进行梯度稀释，选取原液、10-4、10-5、10-6稀释液分别涂布于分离培养基平板上，每个处理3个重复，置30℃培养。待长出细菌菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。
2、菌株的培养条件
(1)编号为ZBL-1的菌株的生长培养基LB培养基，蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，蒸馏水1L，pH自然，经30℃、48h培养。
(2)编号为ZBL-1的菌株在15-38℃条件下均能生长，最适生长温度为30℃，培养时间为48h。
(3)编号为ZBL-1的菌株的生长pH自然。
具体的，本发明通过对棉田采集土壤样品在无菌水中震荡后制备菌悬液，进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为ZBL-1的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)菌株。本发明采用菌株编号为ZBL-1的细菌菌株，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。2015年11月9日，菌种保藏号为CGMCC No.11636。该菌株最适生长条件为：温度30℃，培养基采用LB培养基:蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，蒸馏水1L，pH自然，48h培养。培养时间48h；经48h培养后，在LB培养基上菌株菌落圆形，表面有皱褶，不透明，白色。将菌种ZBL-1通过插片和水压片的镜检观察，该菌株属革兰氏染色阳性，在显微镜下菌体杆状，产芽孢，周生鞭毛。根据以上形态特征，参照《常见细菌系统鉴定手册》对ZBL-1菌株进行生理生化鉴定，并结合分子生物学测序，初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，具体为芽孢杆菌(bacillus)杆菌科的一属细菌中具体的一种。分子测序结果表明，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636的16SrDNA基因序列为1453bp，与Bacillusmethylotrophicus strain(KT719869)同源性最高，但本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636与常见的细菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为ZBL-1的菌种在生理生化特性和分子水平方面与常见的甲基营养型芽孢杆菌菌种具有明显的差异，是一种典型的新菌种，有别于常见的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，与常见的真菌菌种相比，其对盐的耐受能力更强，对大丽轮枝菌的抑制效果更强，但是依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为ZBL-1的菌种为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。
3、菌株ZBL-1的生理生化鉴定
形态特征：革兰氏染色阳性，该菌种ZBL-1经LB培养基分离培养，在LB培养基上菌落呈圆形，表面有皱褶，不透明，白色。取疑似甲基营养型芽孢杆菌菌落进行插片和水压片的镜检观察，该菌株在显微镜下菌体杆状，产芽孢，周生鞭毛，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1菌落和菌体形态参见附图1。
生理生化特征：对该菌进行了糖发酵、碳源同化、氮源同化鉴定，该菌株ZBL-1在PDA培养基上生长良好，经鉴定板试验，结果表明菌株ZBL-1可以利用葡萄糖、柠檬酸盐、NaCl、淀粉、明胶，具体见表1。
表1：菌株ZBL-1的生理生化特性
通过上述对于菌种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636的菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定，即通过菌体形态观察、菌株培养特征观察、生长温度测定、耐性试验等试验，与常见的菌种相比，对大丽轮枝菌具有较高的抑制效果，参照《常见细菌系统鉴定手册》的方法进行，编号为ZBL-1的菌种尽管与常见的甲基营养型芽孢杆菌相比，具有共性的一些属性，但是依据与常见的甲基营养型芽孢杆菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，表明ZBL-1菌株是一种典型的新菌种，从菌种分类角度将菌种编号为ZBL-1的菌株综合鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。
实施例二：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636分子水平鉴定
利用细菌DNA基因组试剂盒提取目标菌系DNA。
细菌16SrDNA通用引物序列：
27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；
1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT。
本研究所用引物、Marker及反应体系均购自北京鼎国昌盛生物公司。
表2：提取基因组DNA采用的PCR反应体系
见表2，通过94℃预变性5min；进入循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，并通过测序。
以提取的ZBL-1总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.4kb的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序，测得的序列具有序列表中核苷酸序列。将测序得到的16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的16S rDNA序列，用BIOEDIT软件和MEGA6Neighbor-joining法构建系统进化树，参见附图2。菌株ZBL-1与Bacillius methylotrophicus EU194897.1之间的进化距离最短。结合ZBL-1的形态结构特征及生理生化特性，经序列比对表明，初步鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。
实施例三：：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636的生长因子
表3：温度、pH、盐、抗生素对菌株ZBL-1生长的影响
按照如上方式将甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636进行培养，菌种的培养条件为：培养基为LB固体培养基，培养条件：pH7.0，温度30℃条件下培养48h。
由表3得出,菌株ZBL-1最适合生长因子。
通过以上结果得出将甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCC No.11636作为种子的最佳培养时间为48h，最适生长pH为7.0，大量产芽孢时间为48h。
实施例四：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636对大丽轮枝菌的拮抗作用
采用对峙培养法测定甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1对不同大丽轮枝菌的拮抗。
(1)用直径为5mm的打孔器在培养好的大丽轮枝菌(Verticillium dahliaeKleb.)ZBL-1菌落边缘打取菌饼，用灭菌的接种针挑入PDA平板中心。
(2)在距PDA平板中心20mm处三点划线接种相同体积和浓度的ZBL-1，以仅接种大丽轮枝菌菌饼的PDA平板为对照组，28℃培养7d，测量抑菌带宽，抑菌带宽度是指病原菌边缘至拮抗菌株边缘的最短距离，计算抑制率。每处理三个重复。结果如表4、表5所示。
抑制率计算公式：
抑制率(％)＝(对照直径—处理处理)/对照直径×100％
表4ZBL-1对20株不同大丽轮枝菌的抑制率(培养15d)
表5ZBL-1对20株不同大丽轮枝菌的抑菌带宽(培养15d，单位：mm)
由表4可知，ZBL-1对20株不同大丽轮枝菌具有不同的抑制能力，对峙培养15d时平均抑制率为75.5％；其中ZBL-1对落叶型菌株D143-8的抑菌率最高，为81.6％；ZBL-1对菌株N51-8的抑菌能力最低，为71.0％；因此，ZBL-1对大丽轮枝菌有很强的抑制效果。
由表5可知，ZBL-1对20株不同轮枝菌的抑菌宽度平均为11mm，整体表现出很强的抑菌能力。
实施例五：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636挥发性气体对大丽轮枝菌的拮抗作用
取100μL的生防菌培养液涂布于LB平板上，将直径5㎜的大丽轮枝菌接种于PDA平板中心，将以上两个平板对扣后用封口膜封严密，只涂了培养基的平板与接种病原菌的PDA平板对扣作为对照组，25℃培养，由于大丽轮枝菌生长较慢，10d后检测各处理病原菌生长的菌落半径，每处理三个重复。
由测定结果可知，ZBL-1产生挥发性物质对大丽轮枝菌有明显的抑菌作用，参见附图4，培养10d后抑制率为69.3％。
实施例六：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636对棉花黄萎病的盆栽防效。
采用盆栽法测定甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1对大丽轮枝菌的拮抗，具体步骤如下：
(1)待棉苗生长至两叶一心时采用伤根接种法接种ZBL-1菌液(LB培养液稀释)和大丽轮枝菌孢子悬浮液(PDA培养液)，稀释配制。
(2)试验设6个处理：处理1接种浓度为109cfu/ml的ZBL-1菌液，每营养钵接种50ml。处理2先接种浓度为109cfu/ml的ZBL-1菌液，每营养钵50ml，3d后再接种浓度为107cfu/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液，每营养钵50ml；处理3接种浓度为107cfu/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液，每营养钵接种50ml；处理4空白对照；处理5同时接种浓度为109cfu/ml的ZBL-1菌液和107cfu/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液，每营养钵分别接种50ml；处理6先接种浓度为107cfu/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液，每营养钵50ml，3d后再接种浓度为109cfu/ml的ZBL-1菌液，每营养钵50ml。其中处理3是对照，其余为试验处理。
以上每个处理6个营养钵，每个营养钵10株棉苗，结果取平均值。
大丽轮枝菌接种20d后，观察棉苗的发病情况。
病情指数计算公式：
病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×4)
防治效果计算公式：
防治效果(％)＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100％
表6ZBL-1对棉花黄萎病的室内盆栽防治效果
由表6可知，室内盆栽试验中，筛选出的菌株ZBL-1对棉花黄萎病的防治效果为73.0％，盆栽效果参见附图5，可知甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1对棉花黄萎病具有较好的防治效果。
实施例七、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1CGMCCNo.11636对棉花黄萎病的田间防效
采用田间试验法测定甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1对大丽轮枝菌的拮抗，具体步骤如下：
(1)将ZBL-1在LB培养液中28℃振荡过夜培养2d，稀释至浓度为109cfu/ml，在棉花黄萎病发生初期6月1号、6月5日、6月10日连续开沟灌施三次，每株棉花每次灌施500ml培养液，作为试验组。
(2)以50％多菌灵1000倍作为药剂对照，设空白清水对照，每小区面积为10m2，每处理三个重复，病情指数计算公式参照实施例六，结果取平均值。
试验田为自然病圃，发病严重、均匀；记载施药前病情指数，三次药后7d、14d、调查病情指数，统计防治效果。在表7中对照组是清水对照，多菌灵组和ZBL-1组是处理组。
表7ZBL-1对棉花黄萎病的田间防治效果
| 处理 | 7d | 防效 | 14d | 防效 |
| 多菌灵 | 7.6 | 25.5％ | 11.8 | 34.8％ |
| ZBL-1 | 6.9 | 32.4％ | 10.3 | 43.1％ |
| 对照组 | 10.2 | - | 18.1 | - |
由表7可知，在田间小区实验中，甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1菌液对棉花黄萎病有一定的防治效果，药后7d的防治效果为32.4％，药后14d为43.1％，均高于多菌灵处理的防治效果，具有开发价值。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学；新疆农业科学院植物保护研究所
<120>甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1在防治棉花黄萎病中应用
<130> 2015
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213>甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)ZBL-1
<400> 1
GCATGCCGGC TGCTATAATG CAGTCGAGCG GACAGATGGG AGCTTGCTCC CTGATGTTAG 60
CGGCGGACGG GTGAGTAACA CGTGGGTAAC CTGCCTGTAA GACTGGGATA ACTCCGGGAA 120
ACCGGGGCTA ATACCGGATG GTTGTTTGAA CCGCATGGTT CAGACATAAA AGGTGGCTTC 180
GGCTACCACT TACAGATGGA CCCGCGGCGC ATTAGCTAGT TGGTGAGGTA ACGGCTCACC 240
AAGGCGACGA TGCGTAGCCG ACCTGAGAGG GTGATCGGCC ACACTGGGAC TGAGACACGG 300
CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTAGGG AATCTTCCGC AATGGACGAA AGTCTGACGG 360
AGCAACGCCG CGTGAGTGAT GAAGGTTTTC GGATCGTAAA GCTCTGTTGT TAGGGAAGAA 420
CAAGTGCCGT TCAAATAGGG CGGCACCTTG ACGGTACCTA ACCAGAAAGC CACGGCTAAC 480
TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG TGGCAAGCGT TGTCCGGAAT TATTGGGCGT 540
AAAGGGCTCG CAGGCGGTTT CTTAAGTCTG ATGTGAAAGC CCCCGGCTCA ACCGGGGAGG 600
GTCATTGGAA ACTGGGGAAC TTGAGTGCAG AAGAGGAGAG TGGAATTCCA CGTGTAGCGG 660
TGAAATGCGT AGAGATGTGG AGGAACACCA GTGGCGAAGG CGACTCTCTG GTCTGTAACT 720
GACGCTGAGG AGCGAAAGCG TGGGGAGCGA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC 780
GTAAACGATG AGTGCTAAGT GTTAGGGGGT TTCCGCCCCT TAGTGCTGCA GCTAACGCAT 840
TAAGCACTCC GCCTGGGGAG TACGGTCGCA AGACTGAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC 900
CCGCACAAGC GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT TCGAAGCAAC GCGAAGAACC TTACCAGGTC 960
TTGACATCCT CTGACAATCC TAGAGATAGG ACGTCCCCTT CGGGGGCAGA GTGACAGGTG 1020
GTGCATGGTT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC 1080
AACCCTTGAT CTTAGTTGCC AGCATTCAGT TGGGCACTCT AAGGTGACTG CCGGTGACAA 1140
ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC 1200
GTGCTACAAT GGACAGAACA AAGGGCAGCG AAACCGCGAG GTTAAGCCAA TCCCACAAAT 1260
CTGTTCTCAG TTCGGATCGC AGTCTGCAAC TCGACTGCGT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA 1320
TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA 1380
CCACGAGAGT TTGTAACACC CGAAGTCGGT GAGGTAACCT TTAGGAGCCA GCCGCCGAAG 1440
GTGATCAGAA TT
Claims (2)
1.一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) ZBL-1，其特征在于，所述的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) ZBL-1的CGMCC保藏号为No.11636。
2.如权利要求1 所述甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) ZBL-1在防治棉花黄萎病中应用。
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