CN113717901A

CN113717901A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治多种蔬菜病害中的应用

Info

Publication number: CN113717901A
Application number: CN202111179837.3A
Authority: CN
Inventors: 李磊; 李宝聚; 黄艺烁; 赵昱榕; 谢学文; 石延霞; 柴阿丽
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN113717901B

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治多种蔬菜病害中的应用。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株号为ZF438，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.22291。实验证明，贝莱斯芽孢杆菌ZF438对多种病原真菌和细菌有抑制效果，对病原真菌立枯丝核菌、辣椒炭疽菌、番茄匍柄霉菌的抑制效果相对较好；通过对辣椒果实炭疽病离体和盆栽防效测定，贝莱斯芽孢杆菌ZF438对辣椒炭疽病的防治效果显著高于对照；同时其对黄瓜软腐防效和番茄青枯的盆栽防效测定也均高于对照。在实际生产中，贝莱斯芽孢杆菌ZF438可广泛应用于防治多种蔬菜病害。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治多种蔬菜病害中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治多种蔬菜病害中的应用。

背景技术

植物病害通常使用化学药剂控制，但是化学药剂的大面积使用易造成环境污染、生态失衡、药物残留、食品安全等问题，因此采用低成本、高效率、环境友好和无药物的生物学方法来防控植物病害逐渐成为国内外热点。近年来，各国加强了对环境保护的监管力度，对农业的可持续发展提出了更高的要求，生物防治以其独特的优势成为植物病害防治的研究热门(周通、徐永平、王丽丽、陈岩、张楠、王佳宁、贾藏藏、曲芳京、李晓宇.地衣芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用.生物资源2017,39(02):85-92.)。

芽孢杆菌属(Bacillus spp.)绝大多数是有益微生物，它是一种革兰氏阳性菌。近年来的研究中，芽孢杆菌属在应用微生物中的作用日益显著，不仅具有广谱的抑菌活性，而且还能产生多种重要的酶类，因此被广泛应用于生产表面活性剂、抗菌素、杀虫剂、生物制剂等(周伟、郑维、陶思美、权春善、范圣第.芽胞杆菌产生的环脂肽类物质的研究进展.微生物学杂志2015,35(04):80-86.)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何防治或同时防治多种蔬菜病害和/或多种蔬菜病害病原菌。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了贝莱斯芽孢杆菌。所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其菌株号为ZF438，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.22291。下文简称贝莱斯芽孢杆菌ZF438。

上文所述贝莱斯芽孢杆菌ZF438的16S rDNA核苷酸序列可含有序列表中序列1所示的DNA分子。上文所述贝莱斯芽孢杆菌ZF438的gyrB基因的核苷酸序列可为序列表中序列2所示。上文所述贝莱斯芽孢杆菌ZF438的atpD基因的核苷酸序列可为序列表中序列3所示。上文所述贝莱斯芽孢杆菌ZF438的rho基因的核苷酸序列可为序列表中序列4所示。上文所述贝莱斯芽孢杆菌ZF438的rpoB基因的核苷酸序列可为序列表中序列5所示。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌的培养物。所述培养物可为将上文所述的贝莱斯芽孢杆菌ZF438在微生物培养基中培养得到的物质(如含有贝莱斯芽孢杆菌ZF438和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有贝莱斯芽孢杆菌ZF438和分泌到固体培养基内的物质)。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了菌剂。所述菌剂可含有贝莱斯芽孢杆菌ZF438或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF438的代谢物或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF438的培养物。

上述菌剂的活性成分可为贝莱斯芽孢杆菌ZF438或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF438的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。

所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，贝莱斯芽孢杆菌ZF438或/和贝莱斯芽孢杆菌ZF438的代谢物可以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

上文中，所述贝莱斯芽孢杆菌ZF438的代谢物可为贝莱斯芽孢杆菌ZF438的发酵液。贝莱斯芽孢杆菌ZF438可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养贝莱斯芽孢杆菌ZF438，收集发酵液(含有贝莱斯芽孢杆菌ZF438和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为贝莱斯芽孢杆菌ZF438的代谢物。

上文所述菌剂可具有下述至少一种特性：

A1)抑制植物病害病原菌；

A2)抑制辣椒炭疽病；

A3)抑制黄瓜软腐病；

A4)抑制番茄青枯病。

上文所述辣椒炭疽病的致病病原菌可为辣椒炭疽菌。所述黄瓜软腐病的致病病原菌可为胡萝卜软腐果胶杆菌。所述番茄青枯病的致病病原菌可为茄科雷尔氏菌。

上文所述植物病害病原菌可为细菌或真菌。所述细菌可为密执安棒杆菌密执安亚种丁香假单胞番茄致病变种、胡萝卜软腐果胶杆菌和茄科雷尔氏菌中的任一种。所述真菌可为茄病镰刀菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉、辣椒炭疽菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢菌、西瓜壳二孢和番茄匍柄霉菌中的任一种。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌ZF438的下述至少一种应用：

B1)抑制植物病害病原菌；

B2)抑制辣椒炭疽病；

B3)抑制黄瓜软腐病；

B4)抑制番茄青枯病。

上文所述菌剂的下述至少一种应用也属于本发明的保护范围：

B1)抑制植物病害病原菌；

B2)抑制辣椒炭疽病；

B3)抑制黄瓜软腐病；

B4)抑制番茄青枯病。

上文所述植物病害病原菌可为细菌或真菌。所述细菌可为密执安棒杆菌密执安亚种和/或丁香假单胞番茄致病变种和/或胡萝卜软腐果胶杆菌。所述真菌可为茄病镰刀菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉、辣椒炭疽菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢菌、西瓜壳二孢和番茄匍柄霉菌中的任一种。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备上文所述的菌剂的方法。所述方法包括将上文所述的贝莱斯芽孢杆菌ZF438在微生物培养基中培养的步骤。

本发明从辣椒根际土壤中筛选得到贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF438，实验证明，贝莱斯芽孢杆菌ZF438对多种病原真菌和细菌有抑制效果，对病原真菌立枯丝核菌、辣椒炭疽菌、番茄匍柄霉菌的抑制效果相对较好，分别为73.41％、71.41％和71.41％；对病原细菌密执安棒杆菌密执安亚种的抑菌直径为6.58cm，对丁香假单胞番茄致病变种的抑菌直径为6.48cm。通过对辣椒果实炭疽病离体防效，贝莱斯芽孢杆菌ZF438防效达到68.26％；通过盆栽防效测定，贝莱斯芽孢杆菌ZF438对辣椒炭疽病的防治效果达47.93％，显著高于对照；贝莱斯芽孢杆菌ZF438对黄瓜软腐的防治效果达94.55％；对番茄青枯的盆栽防效测定显示，贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液的防效为92.72％。在实际生产中，贝莱斯芽孢杆菌ZF438可广泛应用于防治多种蔬菜病害和/或多种蔬菜病害病原菌。

保藏说明

菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus velezensis

菌株编号：ZF438

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021年05月08日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22291

附图说明

图1为菌株ZF438对辣椒炭疽平板抑制效果。左图为接种菌株ZF438的辣椒炭疽平板，右图为不接种抑制菌液的辣椒炭疽平板对照。

图2为菌株ZF438电镜观察。A:菌株ZF438 LB培养基平板形态；B:透射电镜观察；C、D：扫描电镜观察。

图3为基于16S rDNA、gyrB、atpD、rho和rpoB构建ZF438多基因系统发育树。

图4为菌株ZF438对抑菌谱测定。A:白菜黑腐病的致病菌为野油菜黄单胞野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)；B:番茄细菌性斑点致病菌为丁香假单胞细菌流泪致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)；C:番茄溃疡致病菌为野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)；D:番茄青枯病的致病菌为茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)；E:黄瓜角斑病致病菌为丁香假单胞菌黄瓜角斑病致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)；F:黄瓜软腐病致病菌为胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)；G:马铃薯环腐致病菌为密执安棒形杆菌环腐亚种(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)；H:葡萄根癌致病菌为葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)；I:甜瓜果斑致病菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidororaxavenae subsp.citrulli)；J:甜瓜根腐病致病菌茄病镰刀菌(Fusarinm solani)；K:黄瓜棒孢叶斑病的致病菌为多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)；L:辣椒疫病致病菌为辣椒疫霉(Phytophthora capsici)；M:辣椒炭疽致病菌为辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici(Syd.)E.J.Butler&Bisby.)；N:白菜茎基腐的致病菌为立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)；O:番茄灰霉病的致病菌为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)；P:黄瓜蔓枯病致病菌为西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)；Q:番茄灰叶斑病致病菌为番茄匍柄霉菌(Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto)。a-q为对应大写字母的未添加菌株ZF438的病原菌对照。

图5为菌株ZF438生长曲线及PH测定，左侧为OD_600nm吸光度值随时间变化情况，右侧为该菌株菌悬液PH值随时间变化情况。

图6为辣椒炭疽离体果实防效测定。A/a:ZF438；B/b:药剂处理；C/c:清水处理。

图7为辣椒炭疽活体盆栽防效测定。A:ZF438；B:药剂处理；C:清水处理。

图8为黄瓜软腐活体盆栽防效测定。A:ZF438；B:药剂处理；C:清水处理。

图9为ZF438对番茄青枯防治效果。A:ZF438菌悬液；B:3％噻霉酮微乳剂1000倍液；C:3％噻霉酮微乳剂2000倍液；D:3％中生菌素可湿性粉剂1500倍液；E:3％中生菌素可湿性粉剂3000倍液；F:45％代森铵水剂1500倍液；G:45％代森铵水剂2000倍液；H:20％噻唑锌微乳剂500倍液；I:20％噻唑锌微乳剂800倍液；J:电解水；K:4％春雷霉素可湿性粉剂1500倍液；L:4％春雷霉素可湿性粉剂3000倍液；M:清水对照；N:健康对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的培养基，如无特殊说明均为自然pH。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的供试辣椒品种“中椒107”，番茄品种为“中杂201”，黄瓜品种为“新泰密刺”。

下述实施例中的培养基如下：

LB固体培养基(用于芽孢杆菌的分离纯化)的组成为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

LB液体培养基(用于芽孢杆菌的摇培扩繁)的组成为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL。

NB液体培养基(用于细菌的摇培扩繁)的组成为：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

NA液体培养基(用于细菌的活化保存)的组成为：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl5g，蒸馏水1000mL。

WA培养基(用于细菌抑菌谱的测定)的组成为：琼脂5g、蒸馏水1000mL，分装于5mL试管。

PDA培养基(用于真菌拮抗作用试验)的组成为：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。

实施例1、菌株ZF438的分离、筛选、鉴定和保藏

一、菌株ZF438的分离与纯化

从山东寿光露地辣椒根际采集土壤样品，每份土样称取10g，加入到90mL灭菌水中，置于28℃恒温摇床振荡培养30min后，水浴锅80℃处理30min。按照10^-1-10^-7进行梯度稀释，取稀释梯度10^-5、10^-6、10^-7的土样进行涂板，置于28℃恒温培养箱培养24h。待所涂平板长出单菌落后，用灭菌牙签挑选不同形态的单菌落在LB固体平板上划线，进行纯化，置于28℃恒温培养箱培养至长出形态一致的单菌落，4℃冰箱保存备用。最终从山东寿光露地辣椒根际土壤中共分离获得382株细菌。

二、菌株ZF438的筛选

采用平板对峙法测定上述步骤一种分离纯化的细菌(作为拮抗菌)对辣椒炭疽抑制率。具体步骤如下：在PDA平板中间接种直径为5mm的辣椒炭疽菌饼，采用十字交叉法在距离中心位置2.5cm处滴加5μL OD_600nm＝0.8的待测菌悬液，以不接拮抗菌株为对照，28℃培养，待未接拮抗菌株平板生长至平板边缘进行调查。每个处理重复3次。测量靶标菌的对照菌落直径和处理菌落直径，用抑菌率表示。抑菌率(％)＝[(对照菌落直径–处理菌落直径)/对照菌落直径]×100。结果如图1所示，利用平板对峙法获得1株对辣椒炭疽具有抑制效果的拮抗细菌，对其编号为ZF438，测定其抑菌率为71.41％。

三、菌株ZF438的鉴定

3.1、形态鉴定

对菌株ZF438进行形态学特征观察，菌株ZF438在LB平板上菌落隆起呈圆形或近圆形，边缘啮蚀状，表面湿润；培养后期，菌落表面干燥有皱褶，乳白色，无光泽不透明，有黏性，革兰氏染色为阳性，短杆状，能够产生芽胞，芽胞为杆状，电镜观察下，该菌株大小为2.19-2.23μm×0.48-0.65μm。

3.2、生理生化鉴定

参考《常见细菌系统鉴定书册》(东秀珠，蔡妙英.2001.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社.)和《伯杰氏细菌鉴定手册》(布坎南R E.1984.伯杰氏细菌鉴定手册.北京：科学出版社.)中的方法，对菌株ZF438进行如下生理生化试验：革兰氏试验、生长温度试验、耐盐性试验、游动性试验、接触酶试验、V-P试验、淀粉水解试验、葡糖糖氧化发酵试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验等。

结果如表1、生理生化特征鉴定结果所示，结果表明：菌株ZF438为革兰氏阳性菌，可在28-37℃生长，明胶液化反应呈阴性，V-P反应、淀粉水解、硝酸盐反应呈阳性等。

表1生理生化特征鉴定结果

注：“+”表示阳性或能生长；“-”表示阴性或不能生长。

3.3、Biolog检测

挑取菌株ZF438单菌落接种至KB培养基试管斜面上，28℃恒温培养24h，由中国农业微生物菌种保藏中心使用BIOLOG GENⅢ试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对其进行唯一碳源利用的测定。菌株ZF438对BIOLOG GENIII试剂条上的唯一碳源利用情况如表2所示。

表2利用BIOLOG GENIII试剂条测定菌株ZF438的唯一碳源利用

注：+，阳性；-，阴性；w，弱阳性

3.4、分子鉴定

利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒小量提取菌株ZF438基因组DNA后，选择16S rDNA、gyrB、atpD、rho和rpoB基因进行扩增与测序(表3)。PCR扩增体系为25μL，包括上游引物和下游引物各0.5μL，模板DNA 1μL；T-Taq Mix 12.5μL；ddH₂O 10.5μL。PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共34个循环；72℃延伸10min。所得PCR产物由博迈德生物公司进行测序。测序结果表明：菌株ZF438的16S rDNA、gyrB、atpD、rho和rpoB基因序列分别如序列表中的序列1-序列5所示。NCBI网站下载其余序列，用MEGA 7.0、Sequence Matrix、Seaview4按顺序连接、比对不同菌株的16S rDNA、gyrB、atpD、rho和rpoB基因序列，采用最大似然法构建系统进化树，分析其分类地位。

表3 ZF438常见保守基因引物序列信息表

基因名称	上游引物序列(5’-3’)	下游引物序列(5’-3’)	片段大小
				16S rDNA	GGAGCTTGCTCCCTGATGTT	CCCAACTGAATGCTGGCAAC	1075bp
gyrB	CGCCAAACCTATAAACGCGG	CTGCGCAATGTACACGTAGC	1173bp
				atpD	GCCACGTGGAAGTTCTGAGA	GTCCGTACAATCGCAATGGC	1076bp
rho	GCTCTTTAGGCACAAGCAGC	GCCATTCTGAAAGCGAATGCA	1002bp
				rpoB	CGACAAAGCGTTGCTGGAAA	CGGCACCAGAGTCTTTTCCT	1331bp

基于菌株ZF438 16S rDNA、gyrB、atpD、rho和rpoB基因序列，构建ZF438多基因系统进化树，结果如图3所示，结果表明：菌株ZF438与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株Bacillusvelezensis FZB42聚在一个分支。结合形态、生理生化特征、Biolog检测和分子鉴定结果，鉴定菌株ZF438属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

四、菌株ZF438的保藏

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF438已于2021年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.22291(以下简称贝莱斯芽孢杆菌ZF438)。

实施例2、贝莱斯芽孢杆菌ZF438抑菌谱测定

选择常见的8种蔬菜病原真菌和9种病原细菌测定贝莱斯芽孢杆菌ZF438抑菌谱。

8种蔬菜病原真菌具体出处如下：

辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici(Syd.)E.J.Butler&Bisby)已在文献“杜公福、戚志强、李宝聚、郭英兰、杨衍.海南冬季蔬菜无性型真菌多样性研究.菌物研究2016,14(03):142-148.”中公开，公众可从申请人中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)已在文献“石延霞、唐明、晋知文、谢学文、柴阿丽、李宝聚.蔬菜作物灰葡萄孢菌对不同类型杀菌剂抗性评价.中国蔬菜2016,3:60-65.”中公开，公众可从申请人中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)已在文献“高苇、李宝聚、石延霞、谢学文.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化.园艺学报2011,38(3):465-470.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)已在文献“朱辉、王满意、李宝聚、石延霞.辣椒根腐型疫病病原鉴定及防治药剂筛选.植物保护学报2007,(4):373-378.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)已在文献“高苇、李宝聚、孙军德、石延霞、金丹.绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用.中国蔬菜2008,(6):9-12.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

茄病镰刀菌(Fusarium solani)已在文献“贲海燕、石延霞、谢学文、柴阿丽、李宝聚.氰氨化钙土壤消毒对黄瓜根腐病及土壤病原菌的控制效果.园艺学报2016,43(11):2173-2181.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

番茄匍柄霉菌(Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto)已在文献“李宝聚、周艳芳、李金萍、谢学文.番茄匍柄霉叶斑病(灰叶斑病)的诊断与防治.中国蔬菜2010,(23):24-26.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)已在文献“SHI Yanxia,MENG Shanshan,XIEXuewen,CHAI Ali,LI Baoju.Dry heat treatment reduces the occurrence ofCladosporium cucumerinum,Ascochyta citrullina,and Colletotrichum orbiculareon the surface and interior of cucumber seeds.Horticultural Plant Journal2016,2(01):35-40.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

9种蔬菜病原细菌具体出处如下：

密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)已在文献“李焕玲、石延霞、谢学文、李宝聚.番茄溃疡病的发生规律与防治技术.中国蔬菜2011,23:24-27.”中公开，公众可从申请人中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)已在文献“赵昱榕、李磊、谢学文、石延霞、柴阿丽、孙广玉、李宝聚.贝莱斯芽孢杆菌ZF2对多主棒孢病菌防治效果.中国生物防治学报2019,35(02):217-225.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)已在文献“柴阿丽、帕提古丽、郭威涛、石延霞、谢学文、席先梅、李宝聚.番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用.园艺学报2019,46(01):182-192.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

密执安棒形杆菌环腐亚种(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)已在文献“马海艳、张家森、王丽、高中强、余宏军、蒋卫杰.蒋卫杰博士:聚焦生产一线(十四)滕州市早春拱棚马铃薯高效栽培技术.中国蔬菜2015,(08):70-73.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

野油菜黄单胞野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)已在文献“张扬、李金萍、周慧敏、李宝聚.十字花科蔬菜细菌性黑腐病的发生规律及防治.中国蔬菜2011,17:23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)已在文献“康华军、柴阿丽、石延霞、谢学文、袁军海、李宝聚.番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法.园艺学报2018,45(11):2254-2264.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidororax avenae subsp.citrulli)“范晓溪、金伟、周慧敏、李宝聚.李宝聚博士诊病手记(四十一)瓜类细菌性果斑病的发生规律及防治.中国蔬菜2011,(21):26-29.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

丁香假单胞菌黄瓜角斑病致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)“彭月、顾兴芳、张圣平、李宝聚、谢学文、薄凯亮、董邵云、苗晗.黄瓜细菌性角斑病研究进展.中国蔬菜2021(03):28-35.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)“李磊、赵昱榕、郑斐、石延霞、柴阿丽、谢学文、李宝聚.芹菜软腐病拮抗芽孢杆菌筛选及防治效果.中国生物防治学报2020,36(03):388-395.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本发明，不可作为其它用途使用。

分别采用双层培养法(细菌)和平板对峙法(真菌)测定贝莱斯芽孢杆菌ZF438对病原菌的抑制效果。测定方法参考文献“Stonier T..Agrobacterium tumefaciensConn.II.production of an antibiotic substance.Journal of Bacteriology 1960,79(6):889.”中的方法。

双层培养法(细菌)测定贝莱斯芽孢杆菌ZF438对病原菌的抑制效果的具体步骤如下：从-80℃冰箱中取贝莱斯芽孢杆菌ZF438甘油管，吸取1mL加入到装液量为100mL LB培养基的250mL锥形瓶中，28℃、180r/min振荡摇培24h后，测定OD_600nm值并使用空白LB液体培养基调整OD_600nm＝0.8，得到贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液，取5μL上述菌悬液接种在LB平板中心，28℃培养24h后用氯仿熏蒸灭活，作为下层产素层(实验处理)。以不接贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液的处理为对照。使用5mL含有100μL OD_600nm＝0.8的病原细菌的WA培养基作为上层。28℃培养48h后测量抑菌圈直径，计算抑菌率，每个处理重复3次。抑菌率(％)＝处理抑菌圈直径/对照平板直径×100。

平板对峙法(真菌)测定贝莱斯芽孢杆菌ZF438对病原菌的抑制效果的具体步骤如下：在PDA平板中间接种直径为5mm的病原真菌菌饼，采用十字交叉法在距离中心位置2.5cm处滴加5μL上述OD_600nm＝0.8的贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液(实验处理)，以不接贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液的处理为对照，28℃培养，待对照平板生长至平板边缘进行调查。每个处理重复3次。测量病原菌的对照菌落直径和处理菌落直径，用抑菌率表示。抑菌率(％)＝[(对照菌落直径–处理菌落直径)/对照菌落直径]×100。

结果如表4和图4所示，结果表明：贝莱斯芽孢杆菌ZF438可以有效抑制茄病镰刀菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉、辣椒炭疽菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢菌、西瓜壳二孢和番茄匍柄霉菌8种真菌，抑制率均大于45％，对立枯丝核菌、辣椒炭疽菌、番茄匍柄霉菌的抑制效果相对较好，分别为73.41％、71.41％和71.41％。菌株ZF438对病原细菌也有较好的抑制效果，对密执安棒杆菌密执安亚种的抑菌直径为6.58cm，对丁香假单胞番茄致病变种的抑菌直径为6.48cm。

表4菌株ZF438对病原菌的抑菌效果

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。“-”无抑制效果。

实施例3、贝莱斯芽孢杆菌ZF438生长及pH变化曲线测定

挑取贝莱斯芽孢杆菌ZF438单菌落于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养16h后，用空白LB液体培养基调节菌悬液浓度至OD_600nm为0.6，以2％接种量接种于LB液体培养基(100mL/250mL)中。28℃、180r/min振荡培养48h，每4h测定一次OD_600nm值和pH值。

结果如图5所示，结果表明：贝莱斯芽孢杆菌ZF438在LB液体培养基中生长速度较快，种子液接种后直接进入对数生长期，20h后进入稳定期，OD_600nm值稳定在1.83左右。pH随着菌株ZF438的生长不断升高，48h后为8.07。

实施例4、贝莱斯芽孢杆菌ZF438抑菌活性物质的性质研究

挑取贝莱斯芽孢杆菌ZF438单菌落接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养16h。调节贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液浓度至OD_600nm为0.6，以2％接种量接种于LB液体培养基中，于28℃，180r/min振荡培养24h。将发酵液于12000r/min离心5min，取上清液过0.22μm细菌滤器，备用。

温度稳定性：将上清液分别于4℃冰箱、20℃(室温，对照)和40、60、80、100℃温度条件下水浴处理30min，恢复至室温后，0.22μm细菌滤器去除菌体。

pH稳定性：将上清液分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节pH至2.0、4.0、6.0、7.0(自然，对照)、8.0、10.0、12.0，于室温下放置2h后调回至自然pH，使用0.22μm细菌滤器去除菌体。

蛋白酶稳定性：将上清液调节至对应所用蛋白酶的最适pH值后，分别向其中添加浓度为1mg/mL的木瓜蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司，货号：G8430，pH＝7.0)、胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司，货号：T8150，pH＝8.0)和胃蛋白酶(上海麦克林生化科技有限公司，货号：P816235，pH＝2.0)，上清液与蛋白酶液混合体积比为1:1，37℃水浴2h后调回至自然pH，0.22μm细菌滤器去除菌体，以同等浓度的蛋白酶作为对照。

超声稳定性：将上清液在功率360W超声条件下分别超声0(对照)、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5h，0.22μm细菌滤器去除菌体。

紫外稳定性：将上清液放在20W紫外灯下0(对照)、15、30、45、60、75、90、105、120、135、150min，0.22μm细菌滤器去除菌体。

将各项处理完成后的上清液添加到55℃的PDA培养基中，使上清液体积终浓度为10％(实验处理)。平板中央接种辣椒炭疽菌菌饼，待对照(不添加贝莱斯芽孢杆菌ZF438发酵上清液的接种辣椒炭疽菌菌饼的PDA培养基)长满整个平板时，计算抑菌率，抑菌率(％)＝100％×(对照生长量-实验处理生长量)/对照生长量。

结果如表5-9所示：经测定，贝莱斯芽孢杆菌ZF438上清液对4-40℃的温度、pH2.0-10.0的酸碱度、紫外线处理、超声波处理和木瓜蛋白酶不敏感，整体上表现较高的稳定性。

表5贝莱斯芽孢杆菌ZF438上清液对温度的稳定性

温度(℃)	菌落直径(cm)	抑菌率(％)
			4	5.30±0.15c	37.65±1.78a
20	5.30±0.11c	37.65±1.34a
			40	5.30±0.07c	37.65±0.83a
60	5.50±0.09b	35.29±1.12b
			80	5.66±0.20b	33.43±2.37b
100	5.63±0.22b	33.73±2.57b
			CK	8.50±0.00a	-

表6贝莱斯芽孢杆菌ZF438上清液对紫外线的稳定性

紫外线处理时间(min)	菌落直径(cm)	抑菌率(％)
			0	5.61±0.10bc	34.02±1.14ab
15	5.67±0.07bc	33.33±0.80ab
			30	5.60±0.14bc	33.73±1.65ab
45	5.53±0.08c	35.00±0.89a
			60	5.69±0.09b	33.04±1.01b
75	5.77±0.15b	32.16±1.81b
			90	5.63±0.08bc	33.82±0.89ab
105	5.63±0.25bc	33.73±2.99ab
			120	5.70±0.10b	32.94±1.23b
135	5.70±0.10b	32.94±1.23b
			150	5.65±0.08bc	33.53±0.98ab
CK	8.50±0.00a	-

表7贝莱斯芽孢杆菌ZF438上清液对超声波的稳定性

超声波处理时间(min)	菌落直径(cm)	抑菌率(％)
			0	5.58±0.15cd	34.31±1.73a
15	5.58±0.09cd	34.41±1.10a
			30	5.57±0.12d	34.51±1.42a
45	5.62±0.12cd	33.92±1.38ab
			60	5.67±0.06bcd	33.33±0.71ab
75	5.68±0.15bcd	33.14±1.73ab
			90	5.71±0.14bcd	32.84±1.68ab
105	5.77±0.10b	32.16±1.16b
			120	5.69±0.07bcd	33.04±0.87ab
135	5.72±0.09bc	32.75±1.03ab
			150	5.70±0.10bcd	32.94±1.23ab
CK	8.50±0.00a	-

表8贝莱斯芽孢杆菌ZF438上清液对pH的稳定性

pH	菌落直径(cm)	抑菌率(％)
			2	6.25±0.20c	26.47±2.38a
4	6.03±0.44c	29.12±5.12a
			6	6.28±0.72c	26.18±8.42a
8	6.38±0.28c	24.90±3.28a
			10	6.38±0.22c	24.90±2.60a
12	7.14±0.45b	15.98±5.25b
			CK	8.50±0.00a	-

表9贝莱斯芽孢杆菌ZF438上清液对蛋白酶的稳定性

蛋白酶	菌落直径(cm)	抑菌率(％)
			胃蛋白酶	8.08±0.35c	4.44±4.18c
木瓜蛋白酶	6.30±0.03d	24.37±0.38a
			胰蛋白酶	6.87±0.61c	17.86±7.31b
未经蛋白酶处理	6.84±0.46c	19.51±5.37ab
			胃蛋白酶CK	8.45±0.06ab	-
木瓜蛋白酶CK	8.33±0.08ab	-
			胰蛋白酶CK	8.36±0.07ab	-
未经蛋白酶处理CK	8.50±0.00a	-

实施例5、贝莱斯芽孢杆菌ZF438对辣椒炭疽病的离体果实防效测定

从-80℃冰箱中取出贝莱斯芽孢杆菌ZF438甘油管，以1％接种量的比例加入到装液量为100mL LB培养基的250mL锥形瓶中，28℃、180r/min振荡摇培16h后，收集发酵液，测定发酵液的OD_600nm值并使用空白LB液体培养基调整其OD_600nm＝0.8(以LB液体培养基为空白对照)，得到贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液。选取大小一致的中椒107辣椒果实放于保鲜盒中，使用灭菌牙签在接种部位进行针刺处理后放置培养14d的5mm辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici(Syd.)E.J.Butler&Bisby)(实验室保存，相关文献：杜公福、戚志强、李宝聚、郭英兰、杨衍.海南冬季蔬菜无性型真菌多样性研究.菌物研究2016,14(03):142-148)菌饼，并均匀喷洒贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液(ZF438处理)，设置不喷贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液的对照组(表10中清水处理，用清水替代贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液进行喷施)和40％咪鲜胺水乳剂1600倍液(山东泰诺药业有限公司，农药登记证号：PD20130914)药剂对照(表10中对照药剂)，每个处理3根辣椒，重复三次。用保鲜膜封好，28℃下培养7d，用游标卡尺十字交叉垂直测量直径各一次，取平均值，单位为毫米(mm)。防治效果(％)＝(空白对照病斑直径-药剂或生防菌处理病斑直径)/空白对照病斑直径×100。

表10辣椒炭疽离体果实防效测定

结果如图6和表10所示。结果表明：上述采用贴菌片法测定贝莱斯芽孢杆菌ZF438对辣椒果实炭疽病离体防效，贝莱斯芽孢杆菌ZF438防效达到68.26％，对照药剂咪鲜胺防效防效达到41.01％。

实施例6、贝莱斯芽孢杆菌ZF438对辣椒炭疽的盆栽防效测定

将辣椒炭疽菌在PDA上培养14d后，菌饼接种到PD培养基中，28℃、180r/min振荡培养7d。调节病原菌孢子液浓度至10⁷CFU/mL，喷雾接种于辣椒幼苗上。

挑取贝莱斯芽孢杆菌ZF438单菌落接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养16h得到ZF438菌悬液，收集发酵液，测定发酵液的OD_600nm值并使用空白LB液体培养基调整其OD_600nm＝0.8，得到贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液。将贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液喷施接种病原菌24h后喷雾接种于中椒107辣椒幼苗上(ZF438处理)。每处理5株，3次重复。设置清水对照组(表11中CK处理，用清水替代贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液进行喷施)和40％咪鲜胺水乳剂1600倍液(山东泰诺药业有限公司，农药登记证号：PD20130914)药剂对照(表11中咪鲜胺处理)，待清水对照完全发病后，调查病情指数和防效。病级分类标准，0级：无症状；1级：病斑直径0-1.0mm，有1-2片真叶发病；2级：病斑直径1.1-2.0mm，有2片真叶发病，或有少数大病斑；3级：病斑直径2.1-3.0mm，或有2片以上叶片发病，出现落叶，株形不正常；4级：有许多大病斑，大量落叶，将近枯死或枯死。病情指数＝100×∑(各级病株数×相对级数的代表值)/(总株数×最高级数的代表值)。防效(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。

表11辣椒炭疽活体盆栽防效测定

结果如图7和表11所示。结果表明：菌株ZF438对辣椒炭疽病(致病菌为辣椒炭疽菌)的防治效果达47.93％，显著高于对照药剂咪鲜胺26.16％。经过菌株ZF438处理过的辣椒植株叶片只有少量病斑，没有落叶或枯萎的现象。

实施例7、贝莱斯芽孢杆菌ZF438对黄瓜软腐(致病菌为胡萝卜软腐果胶杆菌)的盆栽防效测定

挑取贝莱斯芽孢杆菌ZF438单菌落接种于LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养16h，收集发酵液，测定发酵液的OD_600nm值并使用空白LB液体培养基调整其OD_600nm＝0.8(以LB液体培养基为空白对照)，得到贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液。将贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液喷雾接种于两叶一心时期的黄瓜幼苗上。挑取黄瓜软腐病病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)(李磊、赵昱榕、郑斐、石延霞、柴阿丽、谢学文、李宝聚.芹菜软腐病拮抗芽孢杆菌筛选及防治效果.中国生物防治学报2020,36(03):388-395)单菌落接种于NB培养基中，28℃、180r/min振荡培养16h。调节病原菌菌悬液浓度至OD_600nm为0.8，喷雾接种于黄瓜幼苗上。在接种病原菌前和后24h分别接种菌株ZF438菌液。每处理15株，3次重复。以4％春雷霉素可湿性粉剂(山东省乳山韩威生物科技有限公司，登记证号：PD20100329)1000倍液为对照药剂(表12中春雷霉素处理)，待空白对照(不接种ZF438菌悬液接种病原菌的黄瓜幼苗，表12中CK处理，用清水替代贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液进行喷施)完全发病后，调查病情指数和防效。病级分类标准，0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；2级：病斑面积占整个叶面积的6％～25％；3级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；4级：病斑面积占整个叶面积的51％～75％；5级：病斑面积占整个叶面积的75％以上。病情指数＝100×∑(各级病叶数×相对级数的代表值)/(总叶数×最高级数的代表值)。防效(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数(李磊.基于全基因组测序的黄瓜细菌性流胶病病原菌致病力和比较基因组分析.中国农业科学院2018.)。

表12黄瓜软腐活体盆栽防效测定

结果如图8和表12所示。结果表明：菌株ZF438对黄瓜软腐(病原菌：胡萝卜软腐果胶杆菌)的防治效果达94.55％，防效略高于化学药剂春雷霉素89.34％。经过菌株ZF438处理过的黄瓜植株生长旺盛，无明显的软腐发病症状。

实施例8、贝莱斯芽孢杆菌ZF438对番茄青枯(致病菌茄科雷尔氏菌)的盆栽防效测定

本试验使用5～6叶期番茄幼苗(中杂201)，测定贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液和化学药剂防治番茄青枯的效果，番茄青枯病原菌茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)(康华军、柴阿丽、石延霞、谢学文、袁军海、李宝聚.番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法.园艺学报2018,45(11):2254-2264)浸根处理：除不加菌的健康对照外,其余所有处理的番茄苗浸根处理45min,病原菌浓度为1×10⁶CFU/mL，后移栽至15cm×15cm圆底花盆。菌株ZF438菌悬液灌根处理：用10⁸CFU/mL的待测生防菌液稀释10倍，每个花盆加入100mL。

清水对照处理：用清水替代贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液进行灌根处理，每个花盆加入100mL清水。

将ZF438菌悬液分别替换为如下化学药剂进行处理：1.6％噻霉酮微乳剂(陕西西大华特科技实业有限公司，登记证号：PD20120375)1000/2000倍液(表13中3％噻霉酮微乳剂1000倍液和3％噻霉酮微乳剂2000倍液处理)，3％中生菌素可湿性粉剂(福建凯立生物制品有限公司，登记证号：PD20110113)1500/3000倍液(表13中3％中生菌素可湿性粉剂1500倍液和3％中生菌素可湿性粉剂3000倍液处理)，45％代森铵水剂(丹东明珠科技有限公司，登记证号：PD84119-8)1500/2000倍液(表13中45％代森铵水剂1500倍液和45％代森铵水剂2000倍液处理)，20％噻唑锌悬浮剂(浙江新农化工股份有限公司，登记证号：PD20096932)500/800倍液(表13中20％噻唑锌微乳剂500倍液和20％噻唑锌微乳剂800倍液处理)，4％春雷霉素可湿性粉剂(山东省乳山韩威生物科技有限公司，登记证号：PD20100329)1500/3000倍液(表13中4％春雷霉素可湿性粉剂1500倍液和4％春雷霉素可湿性粉剂1500倍液处理)，电解水(广东新康科技有限公司，型号：XK-3000)(表13中电解水处理)。

处理后24h灌根接种菌株ZF438或药剂100mL，于26-28℃下保湿，每个处理3个重复，每个重复10棵苗。待清水对照处理根部形成褐色的水浸状病斑，随病情发展茎部出现水浸状条形斑，褐色，上下延伸，植株叶片逐渐发白并枯萎，且植株中午枯萎，晚上和早上回复正常时开始调查。按植株及叶片萎蔫情况进行分级：0级，植株健康，未出现萎蔫症状；1级，1/4叶片出现萎蔫；2级，1/2叶片出现萎蔫；3级，2/3叶片出现萎蔫；4级，整株植株枯萎、死亡。统计番茄青枯病发病率、病情指数及对番茄青枯病的防治效果。发病率(％)＝(发病株数/总株数)×100；病情指数＝∑(病级株数×病级数)/(调查总株数×最高病级数)×100；防治效果(％)＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100。

结果如图9和表13所示，结果表明：菌株ZF438菌悬液对番茄青枯(病原菌茄科雷尔氏菌)的防效为92.72％，其防治效果优于对照药剂3％噻霉酮微乳剂、3％中生菌素、45％代森铵、20％噻唑锌微乳剂、4％春雷霉素可湿性粉剂、电解水等。

表13 ZF438对番茄青枯防治效果

综上，贝莱斯芽孢杆菌ZF438对多种病原真菌和细菌有抑制效果，对病原真菌立枯丝核菌、辣椒炭疽菌、番茄匍柄霉菌的抑制效果相对较好，分别为73.41％、71.41％和71.41％；对病原细菌密执安棒杆菌密执安亚种的抑菌直径为6.58cm，对丁香假单胞番茄致病变种的抑菌直径为6.48cm。通过对辣椒果实炭疽病离体防效，贝莱斯芽孢杆菌ZF438防效达到68.26％；通过盆栽防效测定，贝莱斯芽孢杆菌ZF438对辣椒炭疽病的防治效果达47.93％，显著高于对照；贝莱斯芽孢杆菌ZF438对黄瓜软腐的防治效果达94.55％；对番茄青枯的盆栽防效测定显示，贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌悬液的防效为92.72％。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治多种蔬菜病害中的应用

<130> GNCSQ212077

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 946

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)

<400> 1

tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtctgaaccg catggttcag 60

acataaaagg tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg 120

tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca 180

ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 240

ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct 300

ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc 360

agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 420

ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc 480

cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg 540

aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga 600

ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata 660

ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag 720

tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca 780

aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 840

aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg 900

gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtg 946

<210> 2

<211> 1112

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 2

ggaaatgctc ggatctttag aagaacagtc cgccagtttg cccggcagat tggaaatctc 60

aagcgcactt ttgcggcggg tcaattcccg cgcttttttc gctgccatcc gcgctcttgc 120

ggccattaaa cctttttcaa cgattttgcg ggctgagtcc ggattttcaa gaaggaatgt 180

ttccagcgca gaagaaaaca gcgtatcagt gatcgttctc gcttcggagt tgccgagctt 240

ggttttcgtc tgcccttcga attgcggatc agggtgctta attgaaataa tggcagtcag 300

cccttctctc acatcatccc cgcttaaatt cggatcattt tctttgaaaa tcccttttct 360

tcttgcatag tcgtttatga cacgggtcag accggtttta aatccggctt cgtgcgtccc 420

gccttcgtat gtgttgatat tattcgtgaa agaataaata ttgcttgtat agctgtcgtt 480

gtattgcaat gcaacttcaa ccgttatgcc gtctttctcg ccttcgatat aaatcggctc 540

ttcatgaacg acttctttgg aacggtttaa gtactcaaca tagcttttga ttccgccttc 600

gtagtggtac tcgtttttcc gttcttgtcc ttcacgtttg tcttcaatcg tgatgtttac 660

gccttttgtc aggaaggcca attcccggac acggtttgaa agcagatcat agtcgtatac 720

gattgtttct ttgaagattt ccggatccgg aacgaagtgc gtaatcgttc cggtcttatc 780

agtatcaccg atcacttcaa gatcggccac aggtacaccg cgctcgtacg cctgatagtg 840

gatttttccg tcacgatgaa ccgtaacgtc aagagtggtc gacaaggcgt ttacgacaga 900

tgcccctaca ccgtgaagac cgccggatac tttatatccg cttccgtcaa atttaccgcc 960

ggcgtggaga acggtcatga tgacttcaac cgcagggcgg cccatcttct cctggatacc 1020

gaccggaatt ccgcgcccgt tgtccttaac ggtaatgctg ttatcttttt caatctcgat 1080

gttaatatct gtacaataac cggccagggc tc 1112

<210> 3

<211> 959

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 3

aagcttgtct tcttcaccta attcgtccat accgagaatc gcgataatat cctgaagttc 60

tttgtaacgc tgaagcgttg actggacttc acgcgccacc gcataatgct cttctccgac 120

aatttccgga gcaagcgcgc gggaagtgga agccagcgga tcaaccgcag ggtagatacc 180

catttcagtt aatttacgct caaggttagt cgtcgcatcc aagtgagcga acgttgtcgc 240

cggagccggg tcagtgtagt catcggcagg cacgtagatc gcctggatag atgtaactga 300

accaacgttt gtagacgtaa tacgctcttg aagctgaccc atttctgtcg caagcgtcgg 360

ctgataacca accgcagaag gcatacggcc gagaagcgcg gaaacctctg aacccgcttg 420

tgtgaaacgg aaaatgttat cgataaagaa cagtacgtcc tgtccttgtt tatcacggaa 480

atgctcagcc attgtaagac ccgtcagtgc tacacgcata cgtgcgcccg gcggctcgtt 540

catttgtccg aagaccatgg ctgttttctt gataacgcct gaatcgctca tttcgtagaa 600

aaggtcgttc ccttcacgag tacgctctcc tacaccggcg aatacggaaa taccgccgtg 660

ctcttgcgcg atgttgttga ttaattcctg gattaatacg gttttaccta cgccggcgcc 720

gccgaacaat ccgattttac cgcccttgat gtaaggagcg agcaggtcaa caaccttaat 780

tcccgtttca agaatttcaa cctcagttga aagctcatcg aatgaaggag ctgatctgtg 840

gatcgggtcc ttttgagcat ccgcaggcag cggttcattt aaatcaattt tatctcccag 900

tacgttaaat acgcgtccga gagtcacatc accgacagga acggaaatcg gcgcacctg 959

<210> 4

<211> 1215

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 4

cccctttgtt tccgtgacgt ccggccattt tatcaccttc agaaatctta cgtttctgaa 60

cgatatatac gcgtacaagc tggttcactc ccggaggaag ttcgtcgccg tcttcacggt 120

tgaagacttt tacgtcgtgg ataattccgc cgccgccgtg aggcacacgg agagaagtat 180

cacggacttc acgcgctttt tctccaaaga tcgcatgcag aaggcgttct tcagccgtaa 240

gctcagttac acctttaggc gttactttac ctacgagaag gtctccgtcg ttgacttccg 300

caccgatacg gataattccg cggtcatcaa gattgcgaag cgcgtcttcc cctacgtttg 360

gaatatcacg ggtgatctct tccggcccaa gctttgtatc acgtgcttct gattcatatt 420

cttcaatgtg aatagatgtg tatacatcat ctttcacaag gcgttcactc atgatgatgg 480

catcctcata gttgtaacca tcccatgtca tgaagccgac cattacgttg cggccgagag 540

caagttcacc aagctccatt gaaggtccgt cagcaaggat ttctcctttg actacttcat 600

cgccgacact gacgatcgga cgctggttgt agcacgtacc ttggttggag cggacaaatt 660

tcagcaagct gtacttatcc aggttgcctt ttactttttg gccgtcaatt tcttcatagc 720

ggcgcaccca tacgtttttc gcttccaccc gttcaacgat accagggtgt ttacaaataa 780

cggctgcacc ggagtcttta ccggatacgt attccatacc cgttccgacg atcggagctt 840

ccggctgcat caaaggcaca gcctgacgct gcatgttcgc tcccatgagg gcacggttcg 900

agtcatcgtt ttccaagaac ggaatacatg ctgtcgcagc agatacaacc tgtttaggag 960

atacgtccat gtaatccacg cggttgcggg ctacaacggt gttttcccct ctgaaacgcg 1020

ctacgatgct gtcatccaag aaagaaccgt catcgctcag cttagcattc gcttgggcta 1080

cgacatagtt atcctcttca tcagcagtca ggtagtcgat tctaggcgtt acttttcctg 1140

tttcaggatc aacgcggcgg tatggcgtct caatgaaacc aaagcggttt actttcgcaa 1200

atgatgacaa tgagt 1215

<210> 5

<211> 876

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 5

tccgtctttc cgcaagagaa cggtcaaggt gaagctccat gttgcccgtt cctttaaact 60

cttcatagat gacgtcatcc atccgggagc ccgtgtctac gagcgccgtc gccaaaatgg 120

tcagactgcc gccctcttca atgtttctcg cggcaccgaa aaagcgcttc ggacgatgga 180

acgcagccgg gtcaatcccg ccggaaagcg tacgtccgct tggcgggata acgaggttgt 240

aggcccgtgc caggcgggta atgctgtcca tcagaatgat aacgtctttt ttatgttcaa 300

cgagacgcat cgcccgttca agcacaagct ccgctacctt aatgtgattt tccggcactt 360

catcgaacgt cgagctgacg acatcgcccg ctacggaacg ttcaatatca gttacttctt 420

ccggtctttc atcaattaag agaacaatca attcagcgtc aggctgattt gtcgtaatgc 480

tgttagcgat ttctttcaac agcatggttt taccggcttt cggcggcgct acgatcagac 540

cgcgctggcc gaaaccgacg ggagccatca tatcgagaat tcttgttgag agataattcg 600

gtttcgtctc aagcaccatt tggcggtccg gataaagcgg agtcagcgca ggaaaatgga 660

cgcgctcttt cgcagattcc ggatcatctc catttaccgc ttcaacgtgc aaaagtccgt 720

aatagcgttc gttttctttc ggcggacgca ccttgccgga tactttgtca ccgtttctta 780

aatcaaagcg gcggatctgg gaagcagaaa tgtagatgtc ttctgagctt ggcgagtaat 840

taatcggtct gaggaagccg aatccttccg attgga 876

Claims

1.贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，其菌株号为ZF438，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.22291。

2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌的16SrDNA核苷酸序列含有序列表中序列1所示的DNA分子；所述贝莱斯芽孢杆菌的gyrB基因的核苷酸序列为序列表中序列2所示；所述贝莱斯芽孢杆菌的atpD基因的核苷酸序列为序列表中序列3所示；所述贝莱斯芽孢杆菌的rho基因的核苷酸序列为序列表中序列4所示；所述贝莱斯芽孢杆菌的rpoB基因的核苷酸序列为序列表中序列5所示。

3.权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌的培养物，是将权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在微生物培养基中培养得到的物质。

4.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌或/和权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌的代谢物或/和权利要求3中所述的培养物。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述至少一种特性：

A1)抑制植物病害病原菌；

A2)抑制辣椒炭疽病；

A3)抑制黄瓜软腐病；

A4)抑制番茄青枯病。

6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述植物病害病原菌为细菌或真菌；所述细菌为密执安棒杆菌密执安亚种丁香假单胞番茄致病变种、胡萝卜软腐果胶杆菌和茄科雷尔氏菌中的任一种；所述真菌为茄病镰刀菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉、辣椒炭疽菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢菌、西瓜壳二孢和番茄匍柄霉菌中的任一种。

7.权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌的下述至少一种应用：

B1)抑制植物病害病原菌；

B2)抑制辣椒炭疽病；

B3)抑制黄瓜软腐病；

B4)抑制番茄青枯病。

8.权利要求4或5所述菌剂的下述至少一种应用：

B1)抑制植物病害病原菌；

B2)抑制辣椒炭疽病；

B3)抑制黄瓜软腐病；

B4)抑制番茄青枯病。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述植物病害病原菌为细菌或真菌；所述细菌为密执安棒杆菌密执安亚种和/或丁香假单胞番茄致病变种和/或胡萝卜软腐果胶杆菌；所述真菌为茄病镰刀菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉、辣椒炭疽菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢菌、西瓜壳二孢和番茄匍柄霉菌中的任一种。

10.制备权利要求4或5或6所述的菌剂的方法，包括将权利要求1或2中所述的贝莱斯芽孢杆菌在微生物培养基中培养的步骤。