CN102586142B - 一种用于防治黄瓜霜霉病的枯草芽孢杆菌及其微生物菌剂 - Google Patents
一种用于防治黄瓜霜霉病的枯草芽孢杆菌及其微生物菌剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于防治黄瓜霜霉病的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198，已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5613。本发明还公开了利用该菌株生产的微生物菌剂及其制备方法。本发明枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜霜霉病特异性强，防效高，平均防效在85％以上；其次，利用本发明防治黄瓜霜霉病不易产生抗药性；还有本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染问题；本发明制备方法简单、成本低、使用简单。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种用于防治黄瓜霜霉病的枯草芽孢杆菌和含有该枯草芽孢杆菌的微生物菌剂，以及它们在防治黄瓜霜霉病上的应用。
背景技术
黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis Rostow)引起的侵染性气传病害，给黄瓜生产带来巨大威胁。防治黄瓜霜霉病的方法主要有抗病育种、化学防治和生态防治(如高温闷棚等)等。由于黄瓜霜霉病为多基因控制的数量性状遗传，抗病育种难以进行且抗性容易丧失；化学防治存在容易产生抗药性和对人、环境污染的问题；而生态防治的高温闷棚需要黄瓜苗龄、长势和天气情况都合适的条件下才能进行，应用受条件限制。近年来，由于生物防治方法对人、畜安全，对环境没有污染，且对防治对象的针对性强，效果好，因此，生物防治已成为防治黄瓜霜霉病的重要途径。
生物防治黄瓜霜霉病的方法主要包括利用植物提取物、植物的抗病性诱导和生防菌防治。已报道的用于防治黄瓜霜霉病的植物提取物近10余种，但是植物提取物的提取过程繁琐、生产成本高，人工合成单一物质使用后病原菌容易产生抗药性等缺点，使该方法难以应用。利用生防菌防治已报道有枯草芽孢杆菌ZH-8液体制剂(张淑梅等.生物技术.2004(4))和非致病性镰刀菌FO47和FO47B10(杨猛等.西北农林科技大学学报(自然科学版)；2005年05期)等。
芽孢杆菌(Bacillus)具有分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽孢、贮藏期长和使用方便等特点，是一种理想的生防微生物，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，剂型加工，在环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于防治黄瓜霜霉病的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、广谱杀菌活性优点。
本发明第二目的在于提供一种微生物菌剂。
本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
本发明第四目的在于提供上述枯草芽孢杆菌菌株在防治黄瓜霜霉病上的用途。
本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治黄瓜霜霉病上的用途。
本发明通过以下技术方案实现：
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB19198，已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5613。
利用上述枯草芽孢杆菌HMB19198生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌HMB19198菌体和它的胞外代谢产物。
上述微生物菌剂可以为液体制剂。
上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：菌种活化，种子液制备和发酵培养。
上述微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)菌种活化：将低温保存的HMB19198菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上30℃培养24～36小时，得活化的菌株；
(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mLLB液体培养基中，在26～34℃、摇床转速为170～210rpm的条件下培养22～25小时，得种子液；
(3)发酵培养：按照体积比为0.5％～3.0％的比例将步骤(2)的种子液接入到蔗糖豆饼粉培养基(pH值为5.8～6.2)中，在温度为28～34℃、摇床转速为170～210rpm的条件下发酵培养36～54h，得发酵液；所述的蔗糖豆饼粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：蔗糖2.0～3.0％，豆饼粉1.6～2.4％，NaCl 0.1～0.2％，CaCO3 0.1～0.3％，KH2PO4 0.01～0.03％和MgSO4·7H2O 0.01～0.03％，其余为水；
(4)检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为HMB19198菌株的液体制剂。
上述制备方法步骤(2)或(3)中所述的温度优选为30～32℃；所述的摇床转速优选为210rpm；所述的培养时间优选为48h。
所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。
所述的蔗糖豆饼培养基的制备方法，按照重量百分比将蔗糖、豆饼粉、NaCl、CaCO3、KH2PO4和MgSO4·7H2O混合，再加水，搅拌均匀即可。
上述微生物菌剂，其枯草芽孢杆菌HMB19198的活菌数大于7.9×108cfu/mL。
所述的枯草芽孢杆菌HMB19198在防治黄瓜霜霉病上的应用。
上述微生物菌剂在防治黄瓜霜霉病上的应用。
上述微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为107cfu/mL，于黄瓜霜霉病发病前进行叶面喷雾，即可达到控制黄瓜霜霉病的目的。
HMB19198菌株的筛选分离过程
HMB19198菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从江苏省兴化市的棉花根际土壤中分离得到。2009年河北省农林科学院植物保护研究所从江苏省兴化市棉田中五点采集棉株，取根际土壤，混匀后称取5g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液1mL加无菌水9mL，即成10mL 10-2倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释液，取各浓度微生物悬液200μL涂于LB和KB培养基平板上，每个浓度重复3次，在28℃恒温培养1d-3d，进行细菌的分离和纯化。并以黄瓜霜霉病为靶标，利用叶盘法进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对黄瓜霜霉病具有明显防治效果的菌株，定名为HMB19198。
HMB19198菌株的分类鉴定：
(1)形态特征鉴定
在LB培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB19198属于芽孢杆菌。
(2)利用16S rDNA序列鉴定分类
以HMB19198的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16S rDNA进行PCR扩增，所述的引物序列为：
F27： 5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG3’；(SEQ ID No：2)
R1492：5’GGCTACCTTGTTACGACTT3’；(SEQ ID No：3)
16S rDNA的扩增反应体系为50μL：10×PCR Buffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL，F27(10μmol/L)1μL，R1492(10μmol/L)1μL；HMB19198的基因组DNA 50ng；ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得到HMB19198的16S rDNA序列(见SEQ ID No：1)。将所得HMB19198的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB19198与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到99％(见图2)；构建系统发育树(见图1)，HMB19198与芽孢杆菌属聚合到一起，说明HMB19198属于芽孢杆菌属(Bacillus)。
(3)利用gyrB基因序列鉴定分类
以HMB19198基因组DNA为模板，利用芽孢杆菌gyrB基因兼并引物gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列为：
gyrB-F：5’TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3’；(SEQ ID No：5)
gyrB-R：5’TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3’；(SEQ ID No：6)
gyrB的PCR扩增反应体系为50μL：10×PCR Buffer(Mg2+)5μL；dNTP Mixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)1μL，gyrB-R(10μmol/L)1μL；HMB19198基因组DNA 50ng；ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB19198菌株的gyrB基因序列(见SEQ IDNo：4)。将获得的HMB19198菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树。结果发现HMB19198与枯草芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高(见图4)，达到99％；构建系统发育树(见图3)，HMB19198菌株与枯草芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB19198为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且是一个新菌株。
(4)利用生理生化特征鉴定分类
利用Biolog微生物自动鉴定系统可以测试菌株对95种碳源的利用情况从而进一步确定其种属特征，对菌株进行鉴定分类。先将待测菌株的纯培养菌落接入无菌水中，振荡器震荡制成细胞悬液，然后用多道移液枪接种于96孔GNIII鉴定板上培养，再用Biolog Microstation软件读取数据，确定碳源利用情况。通过与BIOLOG系统数据库MicroLog software(Release Version 4.20.04)比对，可知待测菌株的分类。将HMB19198菌株送交中国农业大学，利用Biolog微生物自动鉴定系统进行鉴定分类，结果表明菌株HMB19198属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
综合以上形态特征、16S rDNA和gyr B基因序列同源性对比分析，以及生理生化特征鉴定的结果，可知HMB19198属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且和现有的芽孢杆菌菌株不同，是一个新的枯草芽孢杆菌菌株。
本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明为防治黄瓜霜霉病提供了一个高效的微生物，开辟了一个有效防治途径；(2)本发明枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜霜霉病的药效高，平均防效在85％以上，且针对性强；(3)本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；(4)利用本发明方法防治黄瓜霜霉病不易产生抗药性；(5)本发明制备方法简单、成本低、使用简单。
附图说明
图1.为HMB19198菌株根据16S rDNA序列获得的系统发育树图。
图2.为本发明HMB19198菌株与枯草芽孢杆菌168菌株(B.subtilis 168)的16SrDNA基因序列同源性比较图谱；其中枯草芽孢杆菌168菌株序列中“-”表示与HMB19198对应的碱基相同，“g、a、c、t”表示枯草芽孢杆菌168菌株序列中与HMB19198对应位点的碱基为g、a、c、t。
图3.为HMB19198菌株根据gyrB基因序列获得的系统发育树图。
图4.为本发明HMB19198菌株与枯草芽孢杆菌168菌株(B.subtilis 168)的gyrB基因序列同源性对比图谱；其中枯草芽孢杆菌168序列中“-”表示与HMB19198对应的碱基相同，而“g、a、c、t”表示枯草芽孢杆菌168序列中与HMB19198对应位点的碱基为g、a、c、t。
具体实施方式
下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。
实施例1
HMB19198微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行：
(1)菌种活化：将保存于-40℃的菌株HMB19198(枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株HMB19198已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5613)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂粉15g，水1000mL)上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培养24～36小时，得活化的菌株；
(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，水1000mL)，在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(1)中一接种环上述活化好的菌株，在30℃、摇床转速190rpm的条件下进行振荡培养24h小时，得种子液；
(3)蔗糖豆饼培养基的制备：按照重量百分比将蔗糖3.0％，豆饼粉2％，NaCl0.1％，CaCO3 0.3％，KH2PO4 0.02％和MgSO4·7H2O 0.03％加入水中，搅拌混合均匀，即得蔗糖豆饼培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃对蔗糖豆饼培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；
(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶蔗糖豆饼培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃、摇床转速190rpm条件下进行发酵培养36h，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率(芽孢率(％)＝成熟芽孢数/(成熟芽孢数+菌体数)×100)；芽孢率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养约45～50h，得枯草芽孢杆菌HMB19198的液体制剂。
实施例2 枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜霜霉病防治效果的对比试验
(一)试验药剂：
(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB19198液体制剂；用水稀释50倍。
(2)化学药剂：嘧菌酯悬浮剂(250克/升)(英国先正达有限公司)；用水稀释1000倍。
(3)空白对照：清水
(二)试验方法：本试验在河北省农林科学院植物保护研究所的实验室内进行。本试验所用的黄瓜霜霉病菌2010年来自河北省农林科学院植物保护研究所农药应用技术实验室，配制成孢子囊(1×105-1.5×105个/mL)的悬浮液，用于本试验接种。
取无病完整的黄瓜叶片，分别将其浸在：(1)微生物菌剂：实施例1中制备的HMB19198液体制剂50倍稀释液中，(2)化学药剂：嘧菌酯悬浮剂(250克/升)1000倍水稀释液中，(3)空白对照：清水中，1h后取出放入培养皿；在30℃光照培养箱中定殖一天，用打孔器打取直径15mm的叶盘，放置在培养皿中，每皿10个叶盘作为一次重复，每处理重复4次。在每个叶盘中部滴加黄瓜霜霉病菌孢子囊悬浮液10ul；在18℃光照培养箱中培养7天，调查病级并且计算防效。黄瓜霜霉病级别划分标准和防效计算方法参照《中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则》(一)：杀菌剂防治黄瓜霜霉病GB/T 17980.26-2000(以下同)。
(三)结果(见表1)枯草芽孢杆菌HMB19198液体制剂处理后黄瓜霜霉病病指(14.17)显著低于空白对照病指(94.17)和化学药剂对照病指(78.33)，防治效果达到85.87％，说明本发明枯草芽孢杆菌HMB19198及其微生物菌剂对黄瓜霜霉病具有很好的防治效果。
表1 枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜霜霉病防效的对比试验结果
| 处理 | 病情指数 | 防效(％) |
| HMB19198液体制剂 | 14.17c | 85.87 |
| 化学药剂 | 78.33b | 16.99 |
| 空白对照 | 94.17a | 0.00 |
实施例3 枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜霜霉病防治效果的对比试验
(一)、试验药剂：
(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB19198液体制剂，用水稀释50倍；
(2)化学药剂：687.5克/升银法利悬浮剂(德国拜耳作物科学公司)，水稀释800倍；
(3)空白对照：清水。
(二)、试验时间和地点：2010年12月在河北省农林科学院植物保护研究所人工气候室内进行。
(三)试验方法：筛选饱满的黄瓜种子，催芽至露白时播种于口径为20cm的塑料花盆中，每个处理15盆(每盆2株)，重复3次。采用随机分组排列方法放置。取长至3-4片真叶、生长势一致的黄瓜幼苗，将枯草芽孢杆菌HMB19198液体制剂分3次均匀喷洒在供试植株真叶的正反面上，化学药剂和空白对照清水处理方法相同。24小时后，喷雾接种黄瓜霜霉病菌(将实施例2中的黄瓜霜霉病菌接种于黄瓜新鲜叶片上繁殖而得)，接种浓度为5000-10000个孢子囊/mL；然后在20℃～22℃培养室中保湿培养4-6天，待空白对照充分发病时调查发病情况，并计算病情指数和防效。
(四)结果(见表2)枯草芽孢杆菌HMB19198液体制剂处理后黄瓜霜霉病病指(10.56)显著低于空白对照处理后的病指(97.78)，而与化学药剂处理后的病指(5.56)差异不显著，HMB19198对黄瓜霜霉病的防治效果达到87.97％，说明枯草芽孢杆菌HMB19198及其微生物菌剂对黄瓜霜霉病防治效果好。
表2 枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜霜霉病防效的对比试验结果
| 处理 | 病情指数 | 防效(％) |
| HMB19198液体制剂 | 10.56b | 87.97 |
| 化学药剂 | 5.56bc | 93.67 |
| 空白对照 | 87.78a | 0.00 |
实施例4 枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜霜霉病防效的对比试验
(一)、试验药剂：
(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB19198液体制剂，用水稀释50倍；
(2)化学药剂：687.5克/升银法利悬浮剂(德国拜耳作物科学公司)，用水稀释800倍；
(3)空白对照：清水。
(二)、试验时间和地点：2011年2月在河北省农林科学院植物保护研究所人工气候室内进行。
(三)试验方法：筛选饱满的黄瓜种子，催芽至露白时播种于口径为20cm的塑料花盆中，每个处理15盆(每盆2株)，重复3次。采用随机分组排列方法放置。取长至3-4片真叶、生长势一致的黄瓜幼苗，将实施例1制备的HMB19198液体制剂50倍稀释液分3次均匀喷洒在供试植株真叶的正反面上，化学药剂和空白对照清水处理方法相同。24小时后，喷雾接种黄瓜霜霉病菌(将实施例2中的黄瓜霜霉病菌接种于黄瓜新鲜叶片上繁殖而得)，接种浓度为5000-10000个孢子囊/毫升；接种后在20℃-22℃培养室中保湿培养4-6天，待空白对照充分发病时调查发病情况，并计算病情指数和防效。
(四)结果(见表3)枯草芽孢杆菌HMB19198液体制剂处理后黄瓜霜霉病病指(2.96)显著低于空白对照病指(76.59)，与化学药剂处理后的病指(0.00)差异不显著，HMB19198对黄瓜霜霉病的防治效果达到96.13％，说明枯草芽孢杆菌HMB19198及其微生物菌剂对黄瓜霜霉病具有很好的防治效果。
表3 HMB19198对黄瓜霜霉病防效的对比试验结果
| 处理 | 病情指数 | 防效(％) |
| HMB19198液体制剂 | 2.96b | 96.13 |
| 化学药剂 | 0.00b | 100.00 |
| 空白对照 | 76.59a | 0.00 |
实施例5 枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜霜霉病的防效对比试验
(一)、试验药剂：
(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB19198液体制剂，用水稀释50倍；
(2)化学药剂：687.5克/升银法利悬浮剂(德国拜耳作物科学公司)，用水稀释800倍；
(3)空白对照：清水。
(二)、试验时间和地点：2011年4月在河北省农林科学院植物保护研究所大棚内开展本试验。
(三)试验方法：筛选饱满的黄瓜种子，催芽至露白时播种于直径为10cm的纸播中，培养至2片真叶时移栽到大棚中。正常栽培管理，当黄瓜长至10片真叶时将实施例1中制备的HMB19198液体制剂50倍稀释液用背负式电动喷雾器均匀喷洒在黄瓜叶片的正反面上；化学药剂和空白对照清水处理方法与前者相同。每处理10棵黄瓜，重复4次，随机排列。24小时后，喷雾接种黄瓜霜霉病菌(将实施例2中的黄瓜霜霉病菌接种于黄瓜新鲜叶片上繁殖而得)，接种浓度为5000-10000个孢子囊/毫升；接种后控制大棚温度在20℃-22℃，湿度80％-90％；待清水空白对照充分发病时调查发病情况，并计算病情指数和防效。
(四)大棚试验结果(见表4)枯草芽孢杆菌HMB19198液体制剂处理后黄瓜霜霉病的病指(5.74)显著低于空白对照的病指(92.78)，而与化学药剂处理后的病指(0.00)差异不显著；HMB19198液体制剂对黄瓜霜霉病的防治效果达到93.81％，说明本发明枯草芽孢杆菌HMB19198及其微生物菌剂对黄瓜霜霉病具有很好的防治效果。
表4 枯草芽孢杆菌HMB19198对黄瓜霜霉病防效的对比试验结果
| 处理 | 病情指数 | 防效(％) |
| HMB19198液体制剂 | 5.74b | 93.81 |
| 化学药剂 | 0.00b | 100.00 |
| 空白对照 | 92.78a | 0.00 |
Claims (2)
1.一种枯草芽孢杆菌（Baci11us subtilis）菌株HMB19198，己于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No. 5613。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB19198在防治黄瓜霜霉病上的应用。
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Date of cancellation: 20220408 Granted publication date: 20130619 Pledgee: Zijin Branch of Nanjing Bank Co.,Ltd. Pledgor: Nanjing Kelufeng Technology Co.,Ltd. Registration number: Y2021980002862 |
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Denomination of invention: Bacillus subtilis for controlling cucumber downy mildew and its microbial agent Effective date of registration: 20220412 Granted publication date: 20130619 Pledgee: Zijin Branch of Nanjing Bank Co.,Ltd. Pledgor: Nanjing Kelufeng Technology Co.,Ltd. Registration number: Y2022980004095 |
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Date of cancellation: 20230406 Granted publication date: 20130619 Pledgee: Zijin Branch of Nanjing Bank Co.,Ltd. Pledgor: Nanjing Kelufeng Technology Co.,Ltd. Registration number: Y2022980004095 |
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Denomination of invention: Bacillus subtilis and its microbial agent for controlling cucumber Downy mildew Effective date of registration: 20230410 Granted publication date: 20130619 Pledgee: Zijin Branch of Nanjing Bank Co.,Ltd. Pledgor: Nanjing Kelufeng Technology Co.,Ltd. Registration number: Y2023980037622 |