CN109468243A

CN109468243A - 一株暹罗芽孢杆菌及其应用

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Publication number: CN109468243A
Application number: CN201811347479.0A
Authority: CN
Inventors: 郭浩; 邢继红; 董金皋; 柳健虎; 张康; 曹宏哲
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2038-11-13
Also published as: CN109468243B

Abstract

本发明提供一种暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）GL‑02,其保藏号为CGMCC No.16068。所述菌株在牛肉膏蛋白胨（NB）培养基上繁殖生长形成的单菌落圆形、乳白色、中心稍隆起、表面湿润、透明；镜检呈杆状,具鞭毛,大小为0.7~0.8*1.6~2.2μM，G+，有芽孢;在含有2%‑5%NaCl的牛肉膏蛋白陈培养基上均能生长；所述的牛肉膏蛋白陈(NB)培养基的配方为牛肉膏3g,蛋白陈10g,琼脂12g,水1L,pH6.8‑7.0。暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)GL‑02对引起玉米茎腐病、小斑病、弯孢叶斑病的病原菌均具有显著拮抗作用。本发明还提供暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)GL‑02在防治植物真菌病害中的应用,或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。

Description

一株暹罗芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种暹罗芽孢杆菌及其防治玉米真菌病害的应用，属于微生物应用于农业植物保护领域。

背景技术

植物病害是影响农业生产的主要因素之一，一直以来化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用。但由于化学农药的大量使用，带来很多负面作用，如污染生态环境、危害人畜、产生抗药性，伤害非靶标生物，农药残留等问题，严重影响了人类健康和生态平衡等一系列问题，这促使人们探寻对人类和环境无害并具良好防治效果的新型植物病虫害防治策略。随着全球范围内研制开发高效低毒生防制剂的兴起，开发微生物制剂来控制有害生物，已经成为替代或减少化学农药使用的新型防治措施之一，受到世界各国学者、企业和消费者的重视。利用有益微生物防治植物病害始于 1921 年的 Hartely 利用真菌防治猝倒病（王晓宇，中国农业科学，2011）。到目前植物病害生防微生物已涉及真菌、放线菌、细菌乃至病毒(噬菌体)等种群，而利用拮抗微生物来防治植物病害成为生物防治的一个主策略，并已显示出良好的应用前景。

目前，应用较多的生防细菌是促进植物生长的根际细菌(plant growthpromoting rhizobacteria, PGPR)，其对植物的有益作用主要表现在防病和刺激生长两个方面。对病害的防治机制包括拮抗、寄生、竞争、捕食等多种方式, 产生的抗生素是拮抗作用的重要作用方式之一。植物促生细菌通过植于根系和优先占领根系或抑制根上有害细菌或真菌的生长从而达到防控作用。生物防治是植物病虫害综合治理的重要手段,对实现农业的可持续发展具有重大意义,而分离与筛选高效生防微生物则是实现生物防治的前提。芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一,分布广泛,其抑制病原菌的范围很广、抗性强、无毒副作用,在动植物的生物防治中,应用比较广泛。芽孢杆菌可产生肤类、脂肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类等抗菌物质,不同种类的抗菌物质有不同的生物学活性，因此，芽孢杆菌所分泌的胞外抗菌物质能抑制真菌、细菌、病毒等多种致病因子。目前芽孢杆菌用于植物土传病害的例子很多,例如在美国获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可的枯草芽孢杆菌的生防菌株中,、都可以用于植物病害的防治。

本发明为一种暹罗芽孢杆菌菌株（编号GL-02），及其微生物制剂的制备方法。此菌株对等玉米病害病原菌均有很强的拮抗效果，尤其是对引起玉米茎腐病的禾谷镰孢、玉米小斑病菌和玉米弯孢病菌。而且具有安全环保，对农作物无害等特点。

发明内容

本发明的暹罗芽孢杆菌编号GL-02，（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.16068）。此菌株由农田中玉米茎腐病发病严重的根际土壤中分离得到，经生理生化实验和16S rDNA序列比对鉴定为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis），其16S rDNA序列长度为1415bp，具体如SEQ ID No.1所示；

SEQ ID No.1如下：

GCAAGTCGAG CGGACAGATG GGAGCTTGCT CCCTGATGTT AGCGGCGGAC GGGTGAGTAACACGTGGGTA ACCTGCCTGT AAGACTGGGA TAACTCCGGG AAACCGGGGC TAATACCGGA TGGTTGTCTGAACCGCATGG TTCAGACATA AAAGGTGGCT TCGGCTACCA CTTACAGATG GACCCGCGGC GCATTAGCTAGTTGGTGAGG TAACGGCTCA CCAAGGCGAC GATGCGTAGC CGACCTGAGA GGGTGATCGG CCACACTGGGACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAG GGAATCTTCC GCAATGGACG AAAGTCTGACGGAGCAACGC CGCGTGAGTG ATGAAGGTTT TCGGATCGTA AAGCTCTGTT GTTAGGGAAG AACAAGTGCCGTTCAAATAG GGCGGCACCT TGACGGTACC TAACCAGAAA GCCACGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTA GGTGGCAAGC GTTGTCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGGGCT CGCAGGCGGT TTCTTAAGTCTGATGTGAAA GCCCCCGGCT CAACCGGGGA GGGTCATTGG AAACTGGGGA ACTTGAGTGC AGAAGAGGAGAGTGGAATTC CACGTGTAGC GGTGAAATGC GTAGAGATGT GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGACTCTCTGGTCTGTAA CTGACGCTGA GGAGCGAAAG CGTGGGGAGC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACGCCGTAAACGA TGAGTGCTAA GTGTTAGGGG GTTTCCGCCC CTTAGTGCTG CAGCTAACGC ATTAAGCACTCCGCCTGGGG AGTACGGTCG CAAGACTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGCATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG TCTTGACATC CTCTGACAAT CCTAGAGATAGGACGTCCCC TTCGGGGGCA GAGTGACAGG TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGGGTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTGA TCTTAGTTGC CAGCATTCAG TTGGGCACTC TAAGGTGACTGCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAAT CATCATGCCC CTTATGACCT GGGCTACACACGTGCTACAA TGGACAGAAC AAAGGGCAGC GAAACCGCGA GGTTAAGCCA ATCCCACAAA TCTGTTCTCAGTTCGGATCG CAGTCTGCAA CTCGACTGCG TGAAGCTGGA ATCGCTAGTA ATCGCGGATC AGCATGCCGCGGTGAATACG TTCCCGGGCC TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCACGAGAG TTTGTAACAC CCGAAGTCGGTGAGGTAACC TTTAGGAGCC AGCCG

此菌株在牛肉膏蛋白胨（NB）培养基上繁殖生长形成的单菌落圆形、乳白色、中心稍隆起、表面湿润、透明；镜检呈杆状,具鞭毛,大小为0.7~0.8*1.6~2.2μM，G+，有芽孢;能在25℃-45℃的温度下生长，最适温度为40℃；其生长pH范围为6.5-8.5，最适生长pH为8；需氧生长；革兰氏染色阴性，芽孢椭圆形；V.P.试验、淀粉水解试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐试验、动力试验、过氧化氢酶试验呈阳性；M.R.、亚硝酸盐还原还原试验、丙二酸盐试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、产氨试验、H₂S产生试验呈阴性。

本发明还涉及暹罗芽孢杆菌GL-02在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂的应用，所述植物优选为玉米，所述真菌优选为引起玉米茎腐病的禾谷镰孢(Fusarium graminearum)，引起玉米弯孢菌叶斑病的新月弯孢(Curvularialunata)，引起玉米小斑病的小斑病菌(Bipolaris maydis)中的一种或多种。

本发明还涉及一种微生物制剂，含有暹罗芽孢杆菌GL-02的全培养液培养物和暹罗芽孢杆菌GL-02的芽孢，其微生物制剂通过以下的制备方法得到：

1、种子液制备，培养基配方：葡萄糖30g，硫酸铵5g，硫酸镁3g，蒸馏水1000mL调pH至8；

将按上述配方配制好的培养基倒入250mL三角瓶，，每瓶100mL，121℃高压灭菌30min，冷却后在超净台内，无菌操作条件下，接种保存在-80℃甘油中的暹罗芽孢杆菌（GL-02）接种量5%，接种后放37℃，转速180 rpm的摇床中培养24h，即为种子液；

2、发酵罐发酵，发酵罐培养液配方：葡萄糖3%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.3%，pH8；

70L发酵罐按70%装上述培养基，装料后在 120℃，0.12MPa下灭菌30分钟。冷却至30℃左右后按5％的比例接种制备好的种子液；培养温度40℃，通气量1:1(v/v·min)，发酵至40小时完毕；

3、取发酵液于4℃、5000rpm条件下离心15min，去沉淀用0.85%的无菌生理盐水冲洗三次，调节至菌含量为10⁹cfu/mL，即得暹罗芽孢杆菌制剂。

本发明的效果

1.在平板对峙法中，本发明的暹罗芽孢杆菌对禾谷镰孢、玉米小斑病菌、玉米弯孢病菌三类植物病原菌具有良好的抑制效果，说明本发明菌株具有较广的抑菌谱；

2.本发明的暹罗芽孢杆菌转50代后对禾谷镰孢、玉米小斑病菌、玉米弯孢病菌的抑制效果未发生显著变化，说明本发明所述菌株具有很好的遗传稳定性。

附图说明

图1 本发明的暹罗芽孢杆菌菌株的16S rDNA的聚类分析。

图2 本发明的暹罗芽孢杆菌菌株对植物病原真菌的抑菌效果图。

具体实施方式

本发明公开了一种高抗真菌活性的暹罗芽孢杆菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，这些都被视为包括在被发明内。本发明所述的暹罗芽孢杆菌已经通过较规范的实施例进行了描述，相关人员明显能在不摆脱本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动和适当的变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1 微生物从土壤中的分离

从沈阳东陵玉米茎腐病发病严重的根际土壤中，称取10g土壤用90mL无菌水进行混匀，然后在从中取1mL样用 9mL无菌水进行稀释，以此进行6次，稀释成10^-6、10^-7、10^-8 3个梯度，移取后三个梯度的菌悬液 100 微升，涂布于LB固体培养基（培养基组成为：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 10g/L，琼脂，15g/L）平板上，以后一次的稀释液作为对照，于28℃下培养，并每24h观察一次。选择对照中无菌落，而此前的稀释液中长出菌落的菌株，根据菌落形态、颜色等特征跳取单菌落于液体LB培养基中培养，并纯化编号。

实施例2 拮抗菌株的筛选

防治植物真菌病害的拮抗细菌的筛选：在灭菌培养皿中均匀加入100μL浓度为1X10⁷cfu/mL禾谷镰孢菌悬液，倒入冷却至约 50℃的熔化LB培养基20 mL充分混匀。待培养基完全凝固后，用接种环点接种供试的拮抗菌，每皿点8-10个待测细菌菌株，28℃温箱中培养48h后，检测抑菌圈的有无及大小。经初次测试将有拮抗作用的菌株纯化后进行重复测试，基本方法同上，每平板点4个菌株，各3次重复。根据拮抗带(抑菌圈边缘与菌落边缘的间距)的宽度确定拮抗程度。拮抗带>1mm的菌株定为有拮抗作用的菌株；拮抗带>4mm的作为拮抗细菌，进行拮抗性复筛试验，选择一个抑制作用强的菌株，命名为GL-02，即本申请所涉及的上述暹罗芽孢杆菌。

实施例3 菌株的16S rDNA 的序列测定和分析及生理生化试验鉴定

暹罗芽孢杆菌DNA提取采用CTAB法，用细菌通用引物扩增16S rDNA序列，引物序列为27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)。PCR反应体系(50 μL)为：10 X PCR缓冲液5 μL、dNTP 4μL、引物各1 μL、DNA模板2.5 μL、Takara Taq酶0.25μL、超纯水36 μL。PCR扩增程序为94 ℃ 3min；94 ℃ 1min，52℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环; 72℃ 10 min。扩增产物送北京华大基因生物科技有限公司进行测序。将测得的16SrDNA序列输入NCBI，应用BLAST软件进行同源性搜索。选取不同菌株的16S rDNA序列并与NCBI中已知的16S rDNA进行同源性比较；将该PCR扩增产物在NCBI中进行BLAST比对结果表明，与GL-02菌株相似性最高的是Bacillus siamensis,同源性高于99%。根据MEGA7.0软件以UPGMA法构建系统发育树发现,GL-02与Bacillus siamensis同属一个遗传分枝, 亲缘关系十分接近,亲源性高于99%。结合形态学和生理生化性状的鉴定结果,可以确认本发明的菌株GL-02为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）。

表1 菌株的生理生化指标测定

实施例4 本发明所述暹罗芽孢杆菌对引起玉米茎腐病的禾谷镰孢(Fusarium graminearum)，引起玉米小斑病的小斑病菌(Bipolaris maydis)，引起玉米弯孢菌叶斑病的新月弯孢(Curvularia lunata)的生长抑制试验

采用平板对峙法，将直径为5 mm的供试的三种植物病原真菌与本发明的菌株GL-02对峙培养，每个处理重复 3 次，26℃恒温培养箱培养7 d，观察抑菌效果。图2示出抑菌效果，其中A为禾谷镰孢(Fusarium graminearum)，B为小斑病菌(Bipolaris maydis)，C为弯孢病菌(Curvularia lunata)抑菌圈直径均大于 3 cm。可见，本发明的菌株对以上三种植物病原真菌均有很好的抑制效果，表明本发明所示菌株具有较广的抑菌谱。

实施例 5 本发明所述暹罗芽孢杆菌微生物菌剂的制备

将保藏编号为CGMCC No.16068的暹罗芽孢杆菌在NB培养液（培养液组成为：葡萄糖3%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.3%，pH 8）中培养，培养液温度为 27 ℃，天数为 2 天，转速为180rpm，pH值为 8。发酵培养后，过滤并调节菌液细胞数为 10⁹个/mL，即制得本发明的暹罗芽孢杆菌微生物菌剂。

实施例 6 本发明所述微生物制剂田间试验

本发明所述微生物制剂施于河北农业大学植物分子病理学与真菌毒素实验室试验田进行，每小区两行，严格隔离，三次重复，随机区组排列。种植时将实施例 5 所得的暹罗芽孢杆菌微生物制剂浸泡玉米种子，以水浸泡为对照进行播种。在玉米大喇叭口期之前在玉米茎部穿刺接种禾谷镰孢孢子液，以接种无菌水作为对照，后期取茎秆纵向剖开观察发病情况。结果如表所示，用菌剂处理种子后，其抗病能力明显增强。

表2 本发明暹罗芽孢杆菌菌剂处理种子后对真菌抗病性的田间试验

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 一株暹罗芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1415

<212> DNA

<213> 暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)

<400> 1

gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60

cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120

tggttgtctg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180

gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240

cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360

atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag 420

ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540

ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720

cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780

gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960

cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080

cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200

aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260

cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380

ccgaagtcgg tgaggtaacc tttaggagcc agccg 1415

Claims

1.一种暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)GL-02,其特征在于,其保藏号CGMCCNo.16068。

2.如权力要求1所述的暹罗芽孢杆菌GL-02，其特征在于，

该菌株在牛肉膏蛋白胨(NB)培养基上繁殖生长形成的单菌落圆形、乳白色、中心稍隆起、表面湿润、透明；镜检呈杆状，具鞭毛，大小为0.7~0.8*1.6~2.2μM，G+，有芽孢，其能在25℃~40℃温度下生长，其最适生长温度为32℃；其生长pH范围为6.5~7.5，最适生长pH为6.8;需氧生长；

所述的牛肉膏蛋白胨(NB)培养基的配方为：牛肉膏3g,蛋白陈10g,,琼脂12g,水1L,pH6.8-7.0。

3.如权力要求1或者2所述的暹罗芽孢杆菌GL-02在防治植物真菌病害中的应用，或在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为玉米；

优选地，所述真菌为引起玉米茎腐病的禾谷镰孢(Fusarium graminearum)，引起玉米小斑病的小斑病菌(Bipolaris maydis)，引起玉米弯孢叶斑病的弯孢病菌（Curvularia lunata）中的一种或多种。

5.一种微生物制剂，其特征在于，含有暹罗芽孢杆菌GL-02的全培养液培养物和暹罗芽孢杆菌GL-02的芽孢。

6.如权力要求5所述的微生物制剂，其特征在于，其是通过以下制备得到的：

（1）种子液制备，培养基配方：葡萄糖30g，硫酸铵5g，硫酸镁3g，蒸馏水1000mL调pH至8；

（2）发酵罐发酵，发酵罐培养液配方：葡萄糖3%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.3%，pH8；

70L发酵罐按70%装上述培养基，装料后在 120℃，0.12MPa下灭菌30分钟；

冷却至30℃左右后按5％的比例接种制备好的种子液；培养温度40℃，通气量1:1(v/v·min)，发酵至40小时完毕；

（3）取发酵液于4℃、5000rpm条件下离心15min，去沉淀用0.85%的无菌生理盐水冲洗三次，调节至菌含量为10⁹cfu/ml，即得暹罗芽孢杆菌制剂。