CN112795496A - 一株多粘类芽孢杆菌及其在防治白菜茎基腐病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株多粘类芽孢杆菌及其在防治白菜茎基腐病中的应用。本发明首先公开了一株多粘类芽孢杆菌，其特征在于：所述多粘类芽孢杆菌为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.17632。本发明进一步公开了一种防治植物茎基腐病的方法。本发明多粘类芽孢杆菌ZF197对包括立枯丝核菌在内的多种植物病原真菌和病原细菌具有良好的广谱拮抗活性，在离体叶片和盆栽对白菜茎基腐病进行病情指数和防效测定，均能够显著降低病情指数且生防性状优良，在蔬菜病害生物防治中有一定的应用潜力。

Description

一株多粘类芽孢杆菌及其在防治白菜茎基腐病中的应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域。具体涉及一株多粘类芽孢杆菌及其在防治白菜茎基腐病中的应用。

背景技术

白菜茎基腐病主要由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染引发。立枯丝核菌是一种寄主范围极广，在自然界普遍存在的土壤习居真菌，可造成稻、麦、棉、蔬菜等植株组织腐烂、枯萎，是引起根腐和茎腐的重要病原菌。由于立枯丝核菌具有发病快、易传播、一旦侵染难以防治等特点，其被认为是最具破坏力的土传病原物之一。

目前立枯丝核菌防治以化学药剂防治为主，但未能有效地防控白菜茎基腐病的发生，并且存在药剂残留、食品安全等诸多的弊端。生物防治由于其不产生抗药性，不污染环境，对人畜无害、且作用效果较好，逐渐被人们所接受。芽孢杆菌作为主要的生防微生物，其具有繁殖速度快、抗逆性强、易在植物根围定殖、杀菌效果好、安全评价高、易于制剂化且成本较低、能诱导抗病性及促生增产等优点。多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)可分泌多种活性抗菌物质，主要有多肽抗生素类物质(Raza W，Shen YR.2008.Paenibacillus polymyxa：antibiotics，hydrolytic enzymes and hazardassessment.Journal of Plant Pathology，90(3)：419-430.)、酶类(Beatty Perrin H，Jensen Susan E.2002.Paenibacillus polymyxa produces fusaricidin-typeantifungal antibiotics active against Leptosphaeria maculans.the causativeagent of blackleg disease of canola.Canadian Journal of Microbiology，48(2).)、植物激素(Niu B，Vater J，Rueckert C，Blom J，Lehmann M，Ru JJ，Chen XH，Wang Q，Borriss R.2013.Polymyxin P is the active principle in suppressingphytopathogenic Erwinia spp.by the biocontrol rhizobacterium Paenibacilluspolymyxa M-1.BMC Microbiology，13(1)：137-137.)、絮凝剂(Preben Nielsen，Jan

1997.Multi-target and medium-independent fungal antagonism byhydrolytic enzymes in Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus strainsfrom barley rhizosphere.FEMS Microbiology Ecology，22(3)：183-192.)等物质，可抑制多种病原细菌和真菌的生长(郭芳芳，谢镇，卢鹏，郭岩彬，张立钦，王勇军.2014.一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定.中国生物防治学报(4)，489-496.)。多粘类芽孢杆菌HK18-8能显著抑制短尖刺盘孢的菌丝生长和分生孢子的萌发，有效防止辣椒炭疽病的发生(申顺善，张涛，王娟，刘东平，张珊珊，孙治强，朴凤植.2019.多粘类芽孢杆菌HK18-8对辣椒炭疽病菌的抑制作用及其定殖能力.园艺学报，46(03)：499-507.)。多粘类芽孢杆菌LRS-1对辣椒疫霉菌的室内持久抑菌率以及温室病害防效分别可达68％和63.4％(赵旖森，张亮，盛浩，袁红，周清.2019.辣椒疫霉病生防细菌的筛选鉴定及其防效.中国蔬菜，(01)：65-69.)。

但是，多粘类芽孢杆菌应用于立枯丝核菌的防治鲜有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为提供能够抑制包括立枯丝核菌在内的植物病原真菌和/或植物病原细菌的菌株，以防控包括白菜茎基腐病在内的植物病害的发生。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株多粘类芽孢杆菌。

本发明所提供的多粘类芽孢杆菌具体为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)ZF197，其于2019年4月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17632。

上述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的16S rDNA序列如SEQ IDNo.1所示。

上述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的gyrB基因序列如SEQ IDNo.2所示。

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的培养物也属于本发明的保护范围。

上述培养物是将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197在微生物培养基中培养得到的物质；如发酵液或菌悬液。

所述微生物培养基可以为BPY培养基、黄豆粉8号培养基、棉籽饼粉培养基、黄豆粉+玉米粉培养基、玉米鱼粉培养基等等；在本发明优选的实施方式中，所述微生物培养基为棉籽饼粉培养基。

本发明进一步提供了一种菌剂。

本发明菌剂含上述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197和/或多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的代谢物和/或多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的培养物。

上述菌剂中，所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的代谢物可从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的培养物中获得。

上述菌剂的活性成分可以为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197和/或多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的代谢物和/或多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的培养物，还可含有其他非活性成分，其他活性成分本领域技术人员可根据需要确定。

上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。

上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

所述菌剂可为下述任一种菌剂：

B1)抑制植物病原真菌的菌剂；

B2)防治(预防和/或治疗)由植物病原真菌所致的病害的菌剂；

B3)抑制植物病原细菌的的菌剂；

B4)防治(预防和/或治疗)由植物病原细菌所致的病害的菌剂；

B5)防治(预防和/或治疗)植物茎基腐病菌剂。

本发明还提供了上述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197和/或多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的代谢物和/或多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的培养物和/或菌剂的应用。

本发明所述的应用为如下任一所示：

A1)抑制植物病原真菌中的应用；

A2)制备用于防治植物病原真菌中的产品的应用；

A3)防治由植物病原真菌所致的病害中的应用；

A4)制备用于防治由植物病原真菌所致的病害的产品的应用；

A5)抑制植物病原细菌中的应用；

A6)制备用于防治植物病原细菌中的产品的应用；

A7)防治由植物病原细菌所致的病害中的应用；

A8)制备用于防治由植物病原细菌所致的病害的产品的应用；

A9)防治植物茎基腐病中的应用；

A10)制备用于防治植物茎基腐病中的产品的应用。

上文中，所述植物病原真菌可为立枯丝核菌、大丽轮枝菌、灰葡萄孢菌、炭疽菌、匍柄霉菌、茄病镰刀菌、多主棒孢菌和/或茄链格孢菌。

上文中，所述植物病原细菌可为野油菜黄单胞辣椒斑点致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种、酸痂链霉菌、西瓜嗜酸菌、茄青枯雷尔氏菌和/或密执安棒形杆菌环腐亚种。

本发明进一步还提供了一种防治植物茎基腐病的方法。

本发明防治植物茎基腐病的方法，所述方法为1)或2)：

1)将上述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197在棉籽饼粉培养基中培养得到的物质作用于植物，实现防治植物茎基腐病；

2)将上述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197和/或多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197的代谢物和/或多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)ZF197的培养物和/或上述菌剂作用于植物，实现防治植物茎基腐病。

上文中，所述植物可为下述任一种植物：

P1)白菜；

P2)十字花科植物；

P3)双子叶植物。

本发明多粘类芽孢杆菌ZF197对包括立枯丝核菌在内的多种植物病原真菌和病原细菌具有良好的广谱拮抗活性，离体叶片和盆栽对白菜茎基腐病进行病情指数和防效测定表明接种多粘类芽孢杆菌ZF197的白菜发病率和病情指数均显著降低，离体叶片防效可达82.35％，盆栽防效达78.57％，证明其生防性状优良，在蔬菜病害生物防治中有一定的应用潜力，为该菌株的进一步开发和应用提供理论依据。

保藏说明

菌株名称：多粘类芽孢杆菌

拉丁名：Paenibacillus polymyxa

参具的生物材料(株)：ZF197

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年04月25日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17632

附图说明

图1为菌株ZF197对立枯丝核菌的抑制作用，其中，A：菌株ZF197对立枯丝核菌抑制效果；B：对照立枯丝核菌菌落；C：ZF197抑制菌丝形态；D：正常菌丝。

图2菌株ZF197基于多基因序列的系统进化树。

图3多粘类芽孢杆菌ZF197酶活性测定，其中，A：纤维素酶酶活性测定结果；B：蛋白酶酶活性测定结果。

图4不同培养时间不同浓度的多粘类芽孢杆菌ZF197发酵液对立枯丝核菌的抑制效果。

图5不同浓度的多粘类芽孢杆菌ZF197在不同培养基中的发酵液对立枯丝核菌的抑制效果。

图6多粘类芽孢杆菌ZF197抑菌谱抑制效果，其中，A：棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)；B：黄瓜棒孢叶斑病的致病菌为多主棒孢菌(Cotynesporacassiicola)；C：黄瓜灰霉病的致病菌为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)；D：黄瓜早疫病的致病菌为茄链格孢菌(Alternaria solani)；E：番茄斑点病致病菌番茄匍柄霉菌(Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto)；F：黄瓜根腐病致病菌茄病镰刀菌(Fusarinm solani)；G：辣椒炭疽病的致病菌为炭疽菌(Colletotrichum spp.)；H：马铃薯疮痂病病原菌酸痂链霉菌(Streptomyces scabies)；I：瓜类细菌性果斑病原菌西瓜嗜酸菌(Acidororax citrulli)；J：花椰菜黑腐病的病原菌野油菜黄单胞野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)；K：马铃薯环腐病原菌密执安棒形杆菌环腐亚种(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)；L：番茄青枯病的致病菌为茄雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)；M：番茄细菌性斑点病原菌野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)；N：CK。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中用到的培养基如下：

LB培养基(用于芽胞杆菌的分离纯化)：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g、蒸馏水1000mL。

PDA培养基(用于拮抗作用试验)：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。

WA培养基(用于细菌抑菌谱的测定)：琼脂5g、蒸馏水1000mL。分装5mL试管。

CMC培养基(用于纤维素酶的测定)：MgSO₄ 0.1g、(NH₄)₂SO₄ 1g、10×PhosphateBuffer 100mL、酵母粉5g、甘油2mL、CMC 1g、Bacto Agar 12g、水1000mL。

脱脂牛奶培养基(用于蛋白酶的测定)：蛋白胨10g、牛肉粉3g、NaCl 5g、水1000mL、脱脂牛奶100mL，pH 7.0。

BPY培养基：牛肉浸膏5g、蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 5g、葡萄糖10g、蒸馏水1000mL。

黄豆粉8号培养基：黄豆饼粉30g、蛋白胨2g、KH₂PO₄ 0.2g、CaCO₃ 1g、葡萄糖5g、酵母粉3g、蒸馏水1000mL。

黄豆粉+玉米粉培养基：玉米粉30g、黄豆饼粉30g、(NH₄)₂SO₄ 0.3g、MgSO₄ 0.3g、KH₂PO₄ 2g、CaCO₃ 1g、蒸馏水1000mL。

棉籽饼粉培养基：棉籽饼32.5g、玉米粉14g、麸皮12g、磷酸二氢钾KH₂PO₄ 1.1g、硫酸铁FeSO₄ 0.049g，蒸馏水1000mL。

玉米鱼粉培养基：玉米粉25g、鱼骨粉5g、蔗糖1g、蛋白胨1.5g、K₂HPO₄ 0.5g和MgSO₄0.25g、蒸馏水1000mL。

生理生化特性测定所用培养基参见《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.2001.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社.)。

实施例1、多粘类芽孢杆菌ZF197的分离筛选和鉴定

1、生防菌株分离、纯化

取自山东省高密市露地白菜土壤样品，每份土样称取10g，加入到90mL灭菌水中，置于28℃恒温摇床振荡培养30min。超净工作台下，将混匀的土样按照10^-1至10^-5进行梯度稀释，将稀释至梯度10^-3、10^-4、10^-5的土样进行涂板，每个梯度吸取100μL，涂布LB固体平板，各涂两个平板，置于28℃恒温培养箱培养24h。待所涂平板长出单菌落后，用灭菌牙签挑选不同形态的单菌落在LB固体平板上划线，进行纯化，置于28℃恒温培养箱培养至长出形态一致的单菌落，4℃冰箱保存备用。

通过上述方法共分离获得104株细菌。

2、拮抗细菌的筛选

采用平板对峙法测定细菌对立枯丝核菌的抑制率(郭芳芳，谢镇，卢鹏，郭岩彬，张立钦，王勇军.2014.一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定.中国生物防治学报(4)，489-496.)：

PDA平板正中央接种直径5mm的立枯丝核菌菌饼，28℃培养1d后，处理组在距平板中央3.5cm处接种5μL OD₆₀₀＝0.8的待测细菌菌株，以不接待测细菌菌株为对照组，28℃培养3d。每个处理重复3次。测量对照组菌落半径和处理组菌落直径，计算抑菌率：抑菌率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％。

通过上述方法对104株细菌进行初步筛选，获得53株对立枯丝核菌具有抑制效果的拮抗细菌，对其编号为ZF151-ZF203。为得到对白菜立枯丝核菌具有最好抑制效果的拮抗细菌，利用平板对峙法对53株细菌进行复筛，最终获得如表1所示的10株对白菜立枯丝核菌具有较好的抑制效果的拮抗细菌，该10株拮抗细菌可抑制白菜立枯丝核菌的菌丝生长；其中，菌株ZF197的抑制率较其他菌株有显著的差异性，其抑制率最大，可达69.65％，在菌株ZF197处理下，立枯丝核菌菌落有明显的直线边界，边界处菌丝变黄褐色，分支增多，产生畸形膨大，形成空泡等(图1)，因此，选取菌株ZF197作为白菜茎基腐病拮抗菌。

表1 10株牛防细菌对立枯丝核菌平板对峙抑制率

注：不同小写字母表示在0.05水平上有显著性差异。

3、菌株ZF197的鉴定

3.1形态学特征及生理生化特性分析

参考《常见细菌系统鉴定书册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》中的方法，对菌株ZF197分别进行形态学特征观察、生长温度试验、耐盐性试验、游动性试验、接触酶试验、V-P试验、M-R试验、淀粉水解试验、柠檬酸盐利用试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验等生理生化试验。

菌株ZF197的形态学特征观察结果显示，菌株ZF197在LB培养基平板上菌落为圆形或近圆形，直径5mm，乳白色、半透明，菌落周围光滑湿润，挑起有黏性。

菌株ZF197的生理生化反应结果如表2所示：菌株ZF197为革兰氏阳性细菌，最适生长温度为28-30℃，NaCl含量1％-4％之间均可正常生长，具有游动性。接触酶、V-P反应、淀粉水解、硝酸盐还原等均为阳性，氧化酶反应、H₂S产生、柠檬酸盐利用、琥珀酸钠利用均为阴性。

表2菌株ZF197生理生化特征

注：+表示该试验结果为阳性；-表示该试验结果为阴性。

3.2 Biolog检测

挑取ZF197单菌落接种至LB培养基试管斜面上，28℃恒温培养24h，使用BIOLOGGENIII试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对菌株ZF197进行唯一碳源利用的测定。

结果表明，菌株ZF197可利用D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖和D-松二糖等36种碳源，不能利用3-Methyl葡萄糖、肌苷、D-丝氨酸、D-山梨醇、D-阿拉伯醇等51种碳源。

从3.1和3.2的结果，初步鉴定菌株ZF197为芽孢杆菌属。

3.3 16S rDNA基因扩增及序列分析

利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒小量提取菌株ZF197基因组DNA后，用细菌16S rDNA的通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，对菌株ZF197的16S rDNA序列进行PCR扩增。扩增体系为50μL，包括27F 1μL，1492R 1μL，模板DNA 1μL；T-Taq Mix 25μL；ddH₂O 22μL。PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共34个循环；72℃延伸10min。所得PCR产物由博迈德生物公司进行测序。经PCR扩增后，得到菌株ZF197的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示，利用NCBI网站进行Blast比对。

利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒小量提取菌株ZF197基因组DNA后，使用引物UP1和UP2r，对菌株ZF197的gyrB基因序列进行PCR扩增。扩增体系为50μL，包括UP1引物5’-TATATTGGCTCCACGAG-3’1μL，UP2r引物5’-GATGATCTCGTCACGTTC-3’1μL，模板DNA 1μL；T-Taq Mix 25μL；ddH₂O 22μL。PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共34个循环；72℃延伸10min。所得PCR产物由博迈德生物公司进行测序。经PCR扩增后，得到菌株ZF197的gyrB基因序列如SEQ ID No.2所示，利用NCBI网站进行Blast比对。

用MEGA 7.0、Sequence Matrix、Seaview4按顺序连接、比对不同菌株的16S rDNA(其余序列均下载于NCBI网站)和gyrB基因，采用最大自然法构建系统发育树，分析其分类地位，结果如图2所示：该菌株与多粘类芽孢杆菌模式菌株SC2聚在一簇，确定菌株ZF197属于多粘类芽孢杆菌。

结合上述菌株ZF197的形态学特征、生理生化测定、Biolog测定、16S rDNA和gyrB序列分析和多基因系统发育树分析结果，确定菌株ZF197为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，并将菌株ZF197命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)ZF197，以下简称多粘类芽孢杆菌ZF197。

多粘类芽孢杆菌ZF197已于2019年4月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.17632，分类命名为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa。

实施例2多粘类芽孢杆菌ZF197的特性的测定

1、多粘类芽孢杆菌ZF197的抑菌谱测定

1.1真菌抑菌谱测定

选择8株常见的蔬菜病原真菌进行抑菌谱试验，方法参照实施例1中步骤2拮抗细菌的筛选方法。

蔬菜病原真菌出处如下：

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)已在文献“高苇、李宝聚、孙军德、石延霞、金丹.绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用.中国蔬菜2008，(6)：9-12.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)已在文献“刘芮池、程有普、柴阿丽、石延霞、谢学文、帕提古丽、李宝聚.蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系的建立与应用.中国农业科学2019，52(12)：2069-2078.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)已在文献“高苇、李宝聚、石延霞、谢学文.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化.园艺学报2011，38(3)：465-470.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)已在文献“石延霞、唐明、晋知文、谢学文、柴阿丽、李宝聚.蔬菜作物灰葡萄孢菌对不同类型杀菌剂抗性评价.中国蔬菜2016，(03)：60-65.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

茄链格孢菌(Alternaria solani)已在文献“柴阿丽、石延霞、谢学文、帕提古丽、李宝聚.加工番茄早疫病病原菌鉴定.华北农学报2015，30(增刊)：316-320.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

匍柄霉菌(Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto)已在文献“李宝聚、周艳芳、李金萍、谢学文.番茄匍柄霉叶斑病(灰叶斑病)的诊断与防治.中国蔬菜2010，(23)：24-26.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

茄病镰刀菌(Fusarium solani)已在文献“贲海燕、石延霞、谢学文、柴阿丽、李宝聚.氰氨化钙土壤消毒对黄瓜根腐病及土壤病原菌的控制效果.园艺学报2016，43(11)：2173-2181.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

炭疽菌Colletotrichum spp.)已在文献“于洋、石延霞、傅俊范、李宝聚.亲和病原菌诱导黄瓜组织结构抗病性机制.植物保护学报2008，(01)：37-42.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

结果如表3所示，多粘类芽孢杆菌ZF197可以有效抑制立枯丝核菌、大丽轮枝菌、灰葡萄孢菌、炭疽菌、匍柄霉菌等病原真菌菌丝生长，对茄病镰刀菌、多主棒孢菌、茄链格孢菌抑制效果较差。多粘类芽孢杆菌ZF197对立枯丝核菌抑菌率最高达到69.65％，对其他病原真菌的抑菌率在7.26％～41.56％之间。

1.2细菌抑菌谱测定

对6株常见的蔬菜病原细菌的抑菌谱试验采取双层培养的方法(Stonier，T..1960.Agrobacterium tumefaciens conn.ii.production of an antibioticsubstance.Journal of Bacterioloey，79(6)，889.)：

多粘类芽孢杆菌ZF197接种在液体LB培养基中，25℃下震荡培养16h，获得多粘类芽孢杆菌ZF197菌悬液；在90mm培养皿的LB平板中心，用小枪头打孔，在其中加入5μL ZF197菌悬液，设置只接入液体LB培养基为对照，25℃下培养24h；将培养皿倒置，在通风橱中每个培养皿里加入3mL氯仿，通风放置12h。将病原细菌在25℃下NB培养基中震荡培养36h，获得病原细菌菌悬液；在5mL 5％(m/v)WA培养基中加入100μL病原细菌菌悬液，倒入PDA平板，作为上层。28℃培养48h后测量抑菌圈直径，计算抑菌率，每个处理重复3次。抑菌率(％)＝抑菌直径/对照菌落直径×100％。

病原细菌出处如下：

酸痂链霉菌(Streptomyces scabies)已在文献“崔占、石延霞、傅俊范、谢学文、李宝聚.马铃薯疮痂病药剂防治筛选模型的初步研究.中国园艺学会2009∶1.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

西瓜嗜酸菌(Acidororax citrulli)已在文献“田惠、谢学文、李焕玲、魏松红、李宝聚.李宝聚博士诊病手记(七十)砧木南瓜种传细菌性果斑病的发生及防治.中国蔬菜2014，(05)：65-66.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

野油菜黄单胞野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)已在文献“张扬、李金萍、周慧敏、李宝聚.十字花科蔬菜细菌性黑腐病的发生规律及防治.中国蔬菜2011，17：23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

密执安棒形杆菌环腐亚种(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)已在文献“马海艳、张家森、王丽、高中强、余宏军、蒋卫杰.蒋卫杰博士：聚焦生产一线(十四)滕州市早春拱棚马铃薯高效栽培技术.中国蔬菜2015，(08)：70-73.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

茄青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)已在文献“康华军，柴阿丽，石延霞，谢学文，袁军海，李宝聚.番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法.园艺学报2018，45(11)：2254-2264.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(X.campestris pv.vesicatoria)已在文献“李焕玲，钏锦霞，李宝聚.李宝聚博士诊病手记(六十二)茄果类蔬菜细菌性病害种类.中国蔬菜2013，(15)：23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

密执安棒杆菌密执安亚种(C.michiganensis subsp.Michiganensis)已在文献“李焕玲、石延霞、谢学文、李宝聚.番茄溃疡病的发生规律与防治技术.中国蔬菜2011，23：24-27.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

结果如表3所示，多粘类芽孢杆菌ZF197对病原细菌也有较好的抑制效果，对野油菜黄单胞辣椒斑点致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种和酸痂链霉菌的抑菌直径均在2.0em以上，还可抑制西瓜嗜酸菌、茄青枯雷尔氏菌和密执安棒形杆菌环腐亚种的生长。

以上结果说明多粘类芽孢杆菌ZF197具有广谱拮抗作用，能够有效抑制8种病原真菌和6种病原细菌的生长。

表3多粘类芽孢杆菌ZF197对病原菌的抑菌效果

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。

2、多粘类芽孢杆菌ZF197酶活分析

2.1纤维素酶的检测

在CMC培养基中心位置接种5μL OD₆₀₀＝0.8的多粘类芽孢杆菌ZF197菌悬液，28℃培养24h后，加入3mL刚果红染料，染色30min，倒掉染料，再加入5mL 1mol/L NaCl溶液脱色15min，每个处理重复3次，观察消解圈。结果显示，多粘类芽孢杆菌ZF197在CMC培养基中经过染色、脱色，形成半透明圈(图3中A)。

2.2蛋白酶的检测

在脱脂牛奶培养基中心位置接种5μL OD₆₀₀＝0.8的多粘类芽孢杆菌ZF197菌悬液，每个处理重复3次，28℃培养24h后观察消解圈。

结果显示，多粘类芽孢杆菌ZF197在脱脂牛奶培养基中有非常明显的透明圈产生(图3中B)。

上述酶活分析结果表明，多粘类芽孢杆菌ZF197在代谢过程中产生蛋白酶和纤维素酶，破坏立枯丝核菌菌丝的细胞壁，使菌丝畸形，从而抑制立枯丝核菌菌丝生长。

3、多粘类芽孢杆菌ZF197发酵液对立枯丝核菌生长的抑制效果

3.1不同发酵时间发酵液对立枯丝核菌生长的抑制效果

以NB培养基为基质，用灭过菌的牙签挑取多粘类芽孢杆菌ZF197至NB培养基中，28℃、180r/min振荡培养24h。向250mL的三角瓶中加入NB液体培养基100mL，将已振荡培养24h的菌种按照5∶100的比例量接入三角瓶，28℃、200r/min分别振荡培养48、96和120h后，将发酵液以10000r/min离心15min，取上清液，将上清液通过0.22μm的细菌滤器过滤，在20mLPDA培养基中混入上清过滤液，使其终浓度分别为1％、5％和10％，并以不加发酵液的PDA平板接菌作为对照，每处理设3个重复。在平板中央接入立枯丝核菌的菌碟，28℃培养3d，计量其菌落生长直径和菌落形态。

结果如图4所示：以发酵时间为变量，随着发酵液添加比例的增加，对立枯丝核菌平板的抑制率逐渐提高。相同添加比例的情况下，当多粘类芽孢杆菌ZF197发酵液的发酵时间为96h，对立枯丝核菌平板抑制率均高于其他两组处理抑制率为58.58％。发酵时间120h时，其抑制效果均差于发酵时间48h(图4)。

3.2不同培养基中发酵液对白菜茎基腐生长的抑制效果

将多粘类芽孢杆菌ZF197接入相应的液体培养基(BPY培养基、黄豆粉8号培养基、棉籽饼粉培养基、黄豆粉+玉米粉培养基、玉米鱼粉培养基)中，28℃、200r/min振荡发酵培养168h，测定方法同3.1。

结果如图5所示：以发酵培养基为变量，相同添加比例下，棉籽饼粉培养基发酵液对立枯丝核菌平板的抑制率均高于其他培养基处理，BPY培养基发酵液对立枯丝核菌平板的抑制率均低于其他培养基处理。当添加比例为10％时，棉籽饼粉培养基的发酵液对立枯丝核菌的抑制率最大为82.41％。

以上菌株发酵试验结果表明，多粘类芽孢杆菌ZF197 96h发酵液对立枯丝核菌抑制率最高，抑制率可达58.58％；而以棉籽饼粉作为碳源的发酵液对立枯丝核菌抑制率最高，且抑制率随着发酵上清液添加比例的提高而上升。

实施例3多粘类芽孢杆菌ZF197防治白菜茎基腐病的防效测定

1、多粘类芽孢杆菌ZF197防治白菜茎基腐病的离体防效测定

将多粘类芽孢杆菌ZF197接种在液体LB培养基中，28℃下振荡培养24h，收集发酵液，用无菌液体LB培养基稀释发酵液，至液体的OD₆₀₀＝0.8(以无菌液体LB培养基为空白对照)，得到多粘类芽孢杆菌ZF197菌悬液。选取大小基本一致的二叶一心期的白菜叶片放于保鲜盒中，均匀喷施多粘类芽孢杆菌ZF197菌悬液，以清水、4％井冈霉素水剂500倍液(浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司生产)分别作为对照组，设置3个重复，每重复10个白菜叶片。用保鲜膜封好后，28℃下光暗交替培养24h后，将直径5mm立枯丝核菌菌碟贴于叶片中心，用保鲜膜封好，28℃下培养5d后，参考病斑分级标准(Wiwattanapatapee，Chumthong，Pengnoo，Kanjanamaneesathian.2013.Preparation and evaluation of Bacillusmegaterium-alginate microcapsules；for control of rice sheath blightdisease.World Journal of Microbiology&Biotechnology，29(8)，1487-1497.)调查发病情况，计算病情指数和防治效果。

病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×最高级数值)×100

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

结果如表4所示，从病情指数来看，经过多粘类芽孢杆菌ZF197和井冈霉素处理过的白菜叶片病情指数均低于15％，且二者之间无显著差异；经多粘类芽孢杆菌ZF197菌悬液处理后的白菜叶片的病情指数为6.67％，对照组白菜叶片的病情指数为37.78％，二者存在显著性差异(P＜0.05)。从防治效果来看，多粘类芽孢杆菌ZF197对白菜茎基腐病的防效为82.35％，接近化学药剂井冈霉素的防治效果(表4)。

表4多粘类芽孢杆菌ZF197对白菜茎基腐病的防治效果

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。

2、多粘类芽孢杆菌ZF197防治白菜茎基腐病的盆栽防效测定

分别将步骤1中的OD₆₀₀＝0.8的多粘类芽孢杆菌ZF197菌悬液灌根处理白菜幼苗，保湿24h。取立枯丝核菌种子液，用无菌水配置成OD₆₀₀为0.8菌悬液，等量均匀进行白菜幼苗灌根，保湿培养7-10d。以喷施无菌水、4％井冈霉素水剂500倍液(浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司生产)、22％氟唑菌苯胺悬浮剂1500倍液(拜耳股份公司生产)作为对照。设置3个重复，每重复3株白菜。观察并计算病情指数和防治效果。

白菜茎基腐病情分级标准如下(李斯深，刘爱新，李强.1999.小麦纹枯病抗性研究进展.山东农业大学学报，(01)：86-91.)

0级 茎基部无病斑

1级 茎基部病斑面积占整个根部面积25％以下

2级 茎基部病斑面积25％～50％

3级 茎基部病斑面积51％～75％

4级 茎基部病斑面积76％～100％

病情指数＝100×∑(各级发病数×相对级数值)/(调查总株数×4)

防治效果(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。

结果如表5所示，从病情指数来看，多粘类芽孢杆菌ZF197处理白菜茎基腐病病情指数为16.67％，4％井冈霉素水剂处理的病情指数为8.33％，22％氟唑菌苯胺悬浮剂处理的病情指数为11.11％，无菌水对照的病情指数为77.78％，3个处理与对照相比，病情指数均差异显著(P＜0.05)；其中，多粘类芽孢杆菌ZF197处理的病情指数比对照的病情指数低61.11％。从防治效果来看，多粘类芽孢杆菌ZF197对白菜茎基腐病的防效为78.57％，接近了化学药剂井冈霉素和氟唑苯菌胺的防治效果(表5)。

表5菌株ZF197对白菜茎基腐病的盆栽防效

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一株多粘类芽孢杆菌及其在防治白菜茎基腐病中的应用

<130> GNCFY192282

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1546

<212> DNA

<213> 多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）ZF197

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggggttattt agaagcttgc ttctaaataa cctagcggcg gacgggtgag taacacgtag 120

gcaacctgcc cacaagacag ggataactac cggaaacggt agctaatacc cgatacatcc 180

ttttcctgca tgggtgaagg aggaaaggcg gagcaatctg tcacttgtgg atgggcctgc 240

ggcgcattag ctagttggtg gggtaatggc ctaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 300

agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360

tagggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 420

ttttcggatc gtaaagctct gttgccaggg aagaacgtct tgtagagtaa ctgctataag 480

agtgacggta cctgagaaga aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540

tagggggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gctctttaag 600

tctggtgttt aatcccgagg ctcaacttcg ggtcgcactg gaaactgggg agcttgagtg 660

cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca 720

ccagtggcga aggcgactct ctgggctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag 780

caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttaggg 840

gtttcgatac ccttggtgcc gaagttaaca cattaagcat tccgcctggg gagtacggtc 900

gcaagactga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcagtggag tatgtggttt 960

aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ccctctgacc gctgtagaga 1020

tatggctttc cttcgggaca gaggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080

tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgcttagttg ccagcaggtc 1140

aagctgggca ctctaagcag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1200

aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtacta caatggccgg tacaacggga 1260

agcgaagccg cgaggtggag cgaatcctag aaaagccggt ctcagttcgg attgcaggct 1320

gcaactcgcc tgcatgaagt cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1380

tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttaca acacccgaag 1440

tcggtgaggt aaccgcaagg agccagccgc cgaaggtggg gtagatgatt ggggtgaagt 1500

cgtaacaagg tagccgtatc ggaaggtgcg gctggatcac ctcctt 1546

<210> 2

<211> 1587

<212> DNA

<213> 多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）ZF197

<400> 2

tatattggct ccacgagtgt caaggggctc catcatctgg tctgggaagt tgtggacaac 60

agcattgacg aagcgctggc gggttattgt aacagcattc aagttgtcgt tcacgaagat 120

aacagcatta ccgttacaga taacggccgc ggtattccgg taagtgaaca cgccaaaatg 180

aaaaaatcgg cgctggaagt cgtaatgacc gtgcttcacg caggtggtaa atttggaggc 240

ggagggtaca aggtatccgg tggtctgcac ggggttggtg tatccgtggt gaacgctctc 300

tccagcaaaa tgatcgtccg tgttaaacgg gatggacatg tatatgagca ggaatatcat 360

cgtggtgttc cacaatatga tgtcagagtc atcggtgaca cagaagagac aggtacccaa 420

acgaccttct atccggatga acagattttt accgaaacga ccgtatatga ctatgatacg 480

cttcagacgc ggattcgtga gctagccttc ctgaacaaag gcattgcaat cagcttgact 540

gatgaacgga caggcgccag cgattcattc cactatgagg gcggaatcag tgaatatgtg 600

cagtttctga atcaaaaaag ggaagccctg catgaacaac cgatttatgt cgaaggttca 660

cgtgatatga ttcaggttga agttgctttg caatataacg acagctatac cgaaaatatt 720

tattctttcg ccaacaatat caacacccat gagggcggaa cgcacgaatc aggtttcaag 780

agtgcattaa cccggattat taacgattat gcacgcaaaa atggcttgat taaggataac 840

aacgccaatt taaccggtga tgatgtacgc gaaggtttga cagcgattat ttccgtcaag 900

atcccagaac cacagtttga gggtcagacg aaaacaaagc tcggcaacag tgaagtgcga 960

ggaattgtcg agtctctgtt cgcagagaaa cttcaggaat tcctagagga aaatccggct 1020

gtctcccgcc gtgtagtcga taaatcatta caagcagccc gtgcccggga agcagcgcgc 1080

aaagcgcgtg agcttacacg tcgtaaaagt gcgctggaaa tcagttcgct cccaggtaag 1140

ctagccgatt gctcctccaa ggacgcttcg atcagtgaat tgtacatcgt cgaaggtgac 1200

tccgcaggtg gatcggccaa gcaagggcgt gatcgtcact ttcaagcgat tttgccaatt 1260

cgcggtaaga ttttgaatgt tgaaaaagca cgcttggacc gtattctgtc cagtgatgaa 1320

atacgctcga tggttacagc aatgggtaca gggatcgggg atgattttga catcgccaaa 1380

gcccgttatc acaaggtcat tatcatgacc gatgctgatg tcgatggtgc ccatattcgt 1440

acattgttgc taacgttctt ctatcgctac atgcgtaaaa tcattgatgc gggctatata 1500

tacattgctc agccgccact atttaaaatt gagcgtaaca aagttgtgcg ttatgcgaac 1560

tctgaggcgg aacgtgacga gatcatc 1587

Claims (10)

1.一株多粘类芽孢杆菌，其特征在于：所述多粘类芽孢杆菌为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZF197，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.17632。

2.权利要求1所述多粘类芽孢杆菌的培养物，其特征在于：所述多粘类芽孢杆菌的培养物是将权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌在微生物培养基中培养得到的物质。

3.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌和/或多粘类芽孢杆菌的代谢物和/或权利要求2所述的培养物。

4.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌和/或多粘类芽孢杆菌的代谢物和/或权利要求2所述的培养物和/或权利要求3所述的菌剂在如下任一中的应用：

A1)抑制植物病原真菌中的应用；

A2)制备用于抑制植物病原真菌中的产品的应用；

A3)防治由植物病原真菌所致的病害中的应用；

A4)制备用于防治由植物病原真菌所致的病害的产品的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述病原真菌为立枯丝核菌、大丽轮枝菌、灰葡萄孢菌、炭疽菌、匍柄霉菌、茄病镰刀菌、多主棒孢菌和/或茄链格孢菌。

6.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌和/或多粘类芽孢杆菌的代谢物和/或权利要求2所述的培养物和/或权利要求3所述的菌剂在如下任一中的应用：

B1)抑制植物病原细菌中的应用；

B2)制备用于抑制植物病原细菌中的产品的应用；

B3)防治由植物病原细菌所致的病害中的应用；

B4)制备用于防治由植物病原细菌所致的病害的产品的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述病原细菌为野油菜黄单胞辣椒斑点致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种、酸痂链霉菌、西瓜嗜酸菌、茄青枯雷尔氏菌和/或密执安棒形杆菌环腐亚种。

8.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌和/或多粘类芽孢杆菌的代谢物和/或权利要求2所述的培养物和/或权利要求3所述的菌剂在如下任一中的应用：

C1)防治植物茎基腐病中的应用；

C2)制备用于防治植物茎基腐病中的产品的应用。

9.一种防治植物茎基腐病的方法，其特征在于，所述方法为1)或2)：

1)将权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌在棉籽饼粉培养基中培养得到的物质作用于植物，实现防治植物茎基腐病；

2)将权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌和/或多粘类芽孢杆菌的代谢物和/或权利要求2所述的培养物和/或权利要求3所述的菌剂作用于植物，实现防治植物茎基腐病。

10.根据权利要求4-8任一所述的应用，或，权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述植物为下述任一种：

P1)白菜；

P2)十字花科植物；

P3)双子叶植物。

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