CN112175888B

CN112175888B - 贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949及其应用

Info

Publication number: CN112175888B
Application number: CN202011244898.9A
Authority: CN
Inventors: 曹伟平; 宋健; 鹿秀云; 赵聚莹; 陈丹
Original assignee: Plant Protection Institute hebei Academy Of Agricultural And Forestry Sciences
Current assignee: Plant Protection Institute hebei Academy Of Agricultural And Forestry Sciences
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2040-11-10
Also published as: CN112175888A

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Hsg1949，保藏号为CGMCC No.20836。贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949对花生果腐病的抑菌率达到58.7~72.9%，对花生果腐病的田间防治效果可高达71.24%。利用本发明的贝莱斯芽孢杆菌可以制成相应的微生物菌剂，施入到花生田中，能够有效防止花生果腐病的发生。此外，本发明贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949抑菌谱广，除对花生果腐病菌外，对花生白绢病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌和棉花立枯病菌等均具有一定的抑制作用。

Description

贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949，还涉及利用该贝莱斯芽孢杆菌在防治花生果腐病等植物病害上的用途。

背景技术

果腐病是花生生产上的一种重要病害，花生果腐病的主要病症为花生果腐烂，轻的部分荚果为褐色或黑色，果仁小而硬实，严重的整个荚果都为深黑色，果皮和果仁均腐烂，一般整株或点片发生。花生染病地块轻则减产20%，严重的减产可达50% 以上，对花生产量和品质构成了极为严重的威胁。镰刀菌是引起花生果腐的主要病原之一，目前主要通过化学杀菌剂类农药进行防治，但是对环境污染较为严重且防治效果不佳，寻找一种经济、安全、有效的防治措施是当务之急。微生物防治是农业生产中一种重要的绿色防控技术，利用拮抗微生物防治农作物病害具有无污染、不易引起病害抗性等优点，近年来已得到广泛的重视和应用。

微生物防治的关键是筛选出对病原微生物有拮抗作用的有益微生物并形成制剂，目前在花生果腐病生物防治方面的研究和应用相对较少，因此，迫切需要筛选出一种能够高效拮抗花生果腐病病原菌的微生物菌株及相关的微生物菌剂，从而通过生物防治降低花生果腐病给花生生产带来的危害。目前尚没有非常理想的对花生果腐病有效的生物药剂。

芽孢杆菌具有耐热、耐旱、抗紫外线等特性，利用芽孢杆菌防治植物病害是目前农业生产上常用的生物防治技术之一。芽孢杆菌种类和数量众多，繁殖速度快，大多芽孢杆菌可在植物体内外定殖，而且芽孢杆菌发酵工艺成熟，便于生产应用。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)属于芽孢杆菌属的一个新种，目前已用于防治稻瘟病、棉花黄萎病、水稻条斑病、甘蔗赤霉病、生菜软腐病、梨灰霉病、烟草赤星病菌、香蕉枯萎病、苹果腐烂病等多种植物病害，但尚未发现其在花生果腐病防治中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一株贝莱斯芽孢杆菌及以其为活性成分的微生物菌剂，该微生物菌剂对花生果腐病具有有效的防治作用。

本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌是贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Hsg1949，该菌株已于2020年09月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20836。贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949是从1500余份土样中分离筛选得到的，所述土样采自河北大名、石家庄、保定、秦皇岛、唐山等县市花生果腐病发病程度不同的地块，该菌株对花生果腐病镰刀菌有良好的拮抗作用，可以用于制作防治花生果腐病的微生物菌剂。

本发明的有益效果在于，贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949对花生果腐病菌株的抑菌率达到58.7~72.9%，对花生果腐病的田间防治效果在1×10⁸~5×10⁸cfu/ mL浓度下可达56.36~71.24%，接近化学药剂的防治水平。此外，对花生白绢病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌和棉花立枯病菌等也具有一定的抑制作用。本发明的微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；菌剂制备方法简单、便于使用，成本低廉，易于推广应用。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949在固体 LB 培养基上培养 48 小时的菌落形态。

图2为贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949复红染色后的光学显微镜下的形态，其中a、营养体；b、芽孢。

图3为贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949对花生果腐病的抑制效果图。

图4为根据16S rDNA序列获得的菌株Hsg1949系统发育树。

图5为根据gyrA基因序列获得的菌株Hsg1949系统发育树。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进一步进行说明。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例 1 对花生果腐病具有拮抗作用的细菌的分离、筛选

2019年10月，河北省农林科学院植物保护研究所在河北大名、石家庄、保定、秦皇岛、唐山等县市的花生果腐病发病程度不同的地块中采集1500余份的土样，带回实验室后进行芽孢杆菌分离，在 LB 培养基上进行多次分离纯化，得到纯培养菌落后，以花生果腐病为指示菌，采用平板对峙方法筛选拮抗性能高的菌株。

具体步骤：分别称取上述花生田土壤样品1g土样放到装有100mL无菌水的灭菌三角瓶中，170rpm振荡30min，静置30min，取上清液10mL加入50mL灭菌离心管中，然后在80℃恒温水浴30分钟，取1mL加无菌水9mL，即成10mL10^-3倍土壤微生物悬液，取两种浓度的微生物悬液100μL分别涂布于LB培养基平板上，每个浓度重复3次，在30℃恒温培养3-5d，待平板长出菌落后，根据《常见细菌系统鉴定手册》中芽孢杆菌的形态特征进行单菌落筛选，并采用划线分离纯化，直到得到单菌落的纯培养物。以花生果腐病镰刀菌为指示菌，采用十字交叉法测定不同分离株对镰刀菌生长的抑制率。将筛选出的细菌菌株点接在距平板中央 3cm处的 4 个角上，平板中央同时接种直径5mm 的活化的花生果腐病镰刀菌菌块，每个菌株重复三次，28℃恒温培养 5d，测量、记录抑菌圈直径的大小并计算平均抑制率。筛选出了对花生果腐病镰刀菌拮抗作用最强的菌株，菌株编号Hsg1949。

实施例 2 拮抗菌株遗传稳定性的确定

对筛选出的拮抗作用最强的菌株Hsg1949在 LB 培养基上采用划线法进行传代培养，培养40代后，采用平板对峙法测定菌株对花生果腐病镰刀菌的拮抗效果，以原始菌株为对照，该拮抗菌株经过40代培养后与原始菌株具有相同的拮抗作用（表1），说明该拮抗菌株具有良好的遗传稳定性，刮取抑菌效果稳定的拮抗菌置于装有1mL 25%无菌甘油溶液的冻存管中，-80℃保存。

实施例 3 菌株Hsg1949的鉴定

（1）形态特征鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛得的拮抗菌株Hsg1949进行鉴定，菌落形态观测是在LB 培养基上进行的，将菌株划线接种后，于 28℃恒温培养 24 小时观察菌落形态。菌株Hsg1949的菌落近圆形，边缘啮蚀状，脐突状突起，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期，表面干燥有皱褶，颜色为乳白色，无光泽不透明，与培养基结合不紧密。挑取培养48小时菌苔革兰氏染色后在光学显微镜的100 倍油镜下观察，在显微镜下可以看到，菌株Hsg1949为芽孢杆菌，革兰氏阳性菌，芽孢位置中生或近中生，芽孢膨大，无伴孢晶体，单个出现。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠等编著，科学出版社，2001年）中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步确定菌株Hsg1949为芽孢杆菌。

（2）利用16S rDNA序列鉴定分类

将菌株Hsg1949接种到 LB 培养液，28℃摇床培养 24 h，以提取的总DNA 作为模板，以 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（SEQ ID No.1）和1492R：

5′- TACGGCTACCTTGTTACGAC TT-3 ′（SEQ ID No.2）为引物进行PCR扩增。PCR 反应体系为50μl，反应体系为：基因组 DNA 2.0μL，10×PCR buffer 5.0μL，27F 引物2μL，1492R 引物2μL，dNTPs 4μL，Taq酶 (5U/μL) 0.5μL，ddH2O 34.5μL。反应条件为：94℃ 预变性 3 min ；94℃变性 30s，54℃退火 30s，72℃ 延伸 1.5 min，循环 30 次；72℃ 10min。PCR产物用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳检测，送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的 DNA 序列（SEQ ID No.3），输入 GenBank，用 Blast 程序与数据库中的所有序列进行比较分析。利用 MEGA软件进行系统发育树的构建（图4），结果显示，菌株Hsg1949与芽孢杆菌属聚合到一起，说明菌株Hsg1949属于芽孢杆菌属。

（3）利用gyrA基因序列鉴定分类

以Hsg1949基因组DNA为模板，以细菌持家基因gyrA的引物GyrA-F：

5′ -CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′（ SEQ ID No.4）和

GyrA-R：5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′（SEQ ID No.5）进行PCR扩增。gyrA的PCR扩增反应体系50μl，反应体系为：基因组 DNA 2μL，10×PCR buffer 5.0μL，27F 引物2μL，1492R 引物2μL，dNTPs 4μL，Taq酶 (5U/μL) 0.5μL，ddH₂O 34.5μL。反应条件为：94℃预变性 3 min ；94℃变性 30s，54℃退火 30s，72℃ 延伸 1.5 min，循环 30 次；72℃ 10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得Hsg1949菌株的gyrA基因序列（SEQ ID No.6）。将获得的菌株Hsg1949的gyrA基因序列在Genbank中进行同源性比较。结果发现菌株Hsg1949与贝莱斯芽孢杆菌菌株NRRL B-41580的gyrA基因序列同源性最高，达到99.40％；利用MEGA软件构建系统发育树，结果（图5）显示菌株Hsg1949与贝莱斯芽孢杆菌聚合到一起，说明Hsg1949为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），并且与已知贝莱斯芽孢杆菌菌株不同，是一个新菌株。对该菌株Hsg1949进行了保藏，保藏编号为CGMCCNo.20836。

实施例4 菌株Hsg1949对花生果腐病的拮抗作用试验

（1）供试花生果腐病来源：花生果腐病LX、DM、XT菌株分别来自河北省大名县、行唐县和滦州市花生主产区果腐病发病率超过50%的病株，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，经ITS序列测序，均为镰刀菌。

（2）菌种活化：将保存于-80℃的贝莱斯芽孢杆菌菌株Hsg1949在LB平板培养基（其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0 .5g，氯化钠1g，琼脂粉15g，水1000mL）上划线，30℃培养24小时，挑取单菌落在LB平板培养基上，30℃培养24小时，得活化的菌株。

（3）试验方法：平板对峙实验：首先将花生果腐病菌株在PDA平板上活化培养5天，然后用打孔器在菌落边缘区域打孔制成菌片，将花生果腐病菌饼转接在另一个PDA平板中央，再将活化的贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949点接在距指示菌菌饼2.0 cm处，设空白对照（不点接Hsg1949菌株）。在25℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量花生果腐病的对照生长量（菌落半径）和处理生长量（接种Hsg1949后的抑制生长半径），拮抗作用用抑菌率表示。

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量× 100。

结果（见表1，图3）贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949初始菌株对不同来源的花生果腐病病菌的抑制率为58.7~72.9%；透明的抑菌带宽1.2~8.2mm；说明本发明贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949对花生果腐病具有明显的抑制作用，具有防治花生果腐病的生防潜力。

表1贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949对花生果腐病的拮抗作用试验结果

实施例5 贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949菌剂的制备

（1）菌种活化：同实施例4中菌种活化方法。

（2）种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基（其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0 .5g，氯化钠1g，水1000mL），在250mL三角瓶中装入LB培养液50mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤（1）活化好的菌株，在30℃、摇床转速200rpm的条件下进行振荡培养24小时，得种子液。

（3）棉籽粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将棉籽粉1.5％，黄豆粉2.0％，NaCl 0.5％，MnSO₄·H₂O 0.6％加入水中，搅拌混合均匀，即得棉籽粉黄豆粉培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；121℃灭菌30分钟，再降温到40℃以下备用。

（4）发酵培养：向步骤（3）所得棉籽粉黄豆粉培养基按照体积比1%的比例接种步骤（2）所得种子液2mL；30℃、转速200rpm的摇床条件下发酵培养36h，之后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽胞和总菌体数进行计数，并计算芽胞率（芽胞率（％）＝成熟芽胞数/（成熟芽胞数+菌体数）× 100）；芽胞率达到90％以上时停止发酵培养；共发酵培养约48h，得贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949的液体制剂。

实施例 6 贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949 的田间应用

（1）实验处理

（a）贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949液体制剂：田间使用的终浓度为1×10⁸cfu/mL，2×10⁸cfu/mL，5×10⁸cfu/mL。

（b）化学药剂：50%多菌灵可湿性粉剂，施用量为100g/亩

（c）空白对照：水

（2）试验方法

试验在河北省唐山市滦州市百信花生种植专业合作社花生田进行，该合作社常年种植花生，花生果腐病的发病在15-30%之间。2020年5月种植的花生品种为冀花11，田间正常管理，于花生下针期在根部喷淋施药，将Hsg1949液体制剂喷淋至花生根部土壤，使用剂量为 60kg/亩；常规对照使用常规剂量的化学农药多菌灵作为防治药物，水的使用量为60kg/亩，空白对照不施用防治药物但施加与处理组相同重量的水；每个处理 3 次重复，于花生收获时调查花生果腐病的发病情况和产量。

调查方法：每处理采用 5 点取样法，每点调查 1m² ，记录总荚果重量、总荚果数、被害荚果数。

防效计算方法：

荚果发病率 = 被害荚果数 / 总荚果数 ×100

防治效果（%）=（对照区荚果发病率-处理区荚果发病率）/ 对照区荚果发病率 ×100

防治效果如表 2 所示，在河北唐山市滦州市田间防病试验表明，本发明贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949及其微生物菌剂对花生果腐病具有良好的防治效果。

表 2 不同菌剂对花生果腐病的防治效果

实施例7 菌株Hsg1949对四种土传病害病原菌的抑制作用试验

（1）供试病害病原菌及来源：本实施例供试的花生白绢病菌（Sclerotiumrolfsii）、棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）和棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae），均由河北省农林科学院植物保护研究所分离提供。

（2）试验方法：平板对峙实验：首先将各供试病原菌在PDA平板上活化培养5天，然后用打孔器在菌落边缘区域打孔制成菌片，将供试病原菌菌饼转接在另一个PDA平板中央，再将实施例4步骤（2）活化的贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949点接在距指示菌菌饼2.0cm处，设空白对照（不点接Hsg1949菌株），每处理重复3次，在25℃恒温培养，逐日观察，待各病原菌空白对照即将长满整个培养皿时，测量各病原菌对照生长量（菌落半径）和处理生长量（接种Hsg1949后的抑制生长半径），计算抑菌率，测量细菌接种点至病原菌落边缘的间距（抑菌带），确定抑菌程度。

抑菌率（%）=（对照生长量-处理生长量）/对照生长量×100

表3贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949对植物病原菌拮抗作用试验结果

结果（见表3）本发明贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949对供试的4种病原真菌的抑菌率为48.0％～65.8％，其中对棉花黄萎病病菌的抑菌率达到了65.8％，对棉花枯萎病菌的抑菌率最低，为48.0％。说明本发明菌株Hsg1949除了对花生果腐病有明显的抑制作用外，对棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、棉花立枯病菌和花生白绢病也有很好的抑制作用，抑菌谱广。

序列表

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120> 贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1249

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 3

ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca 60

gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg 120

gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac 180

actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa 240

tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc 300

tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac 360

cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 420

tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc 480

ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg 540

gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg 600

actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat 660

accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta 720

gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc 780

aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 840

gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg 900

ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 960

agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag 1020

gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1080

tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt 1140

aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1200

gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttc 1249

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caaggtaatg ctccaggcat tgct 24

<210> 6

<211> 840

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 6

tcacagacgg attttgtacg caatgaatga tttaggcatg accagtgaca aaccatataa 60

aaaatctgcc cgtatcgtcg gtgaagttat cggtaagtac cacccgcacg gtgactcagc 120

ggtttacgaa tcaatggtca gaatggcgca ggattttaac taccgctaca tgcttgttga 180

cggacacggc aacttcggtt cggttgacgg cgactcagcg gccgcgatgc gttacacaga 240

agcgagaatg tcaaaaatcg caatggaaat cctccgggac attacgaaag atacgattga 300

ttatcaagat aactatgacg gcgcagaaag agaacctgtc gtcatgcctt cgagatttcc 360

gaatctgctc gtaaacggag ctgccggtat tgcggtcgga atggcgacaa atattcctcc 420

gcaccagctt ggggaagtca ttgaaggcgt gcttgccgta agtgagaatc ctgagattac 480

aaaccaggag ctgatggaat acatcccggg cccggatttt ccgactgcag gtcagatttt 540

gggccggagc ggcatccgca aggcatatga atccggacgg ggatccatca caatccgggc 600

taaggctgaa atcgaagaga catcatcagg aaaagaaaga attattgtca cagaacttcc 660

ttatcaggtg aacaaagcga gattaattga aaaaatcgca gatcttgtcc gggacaaaaa 720

aatcgaagga attactgatc tgcgtgacga atccgatcgt aacggaatga gaatcgtcat 780

tgagatccgc cgtgacgcca atgctcacgt cattttgaat aacctgtaca aacaaacggc 840

Claims

1.贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Hsg1949，保藏号为CGMCC No.20836。

2.含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949的微生物菌剂。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于剂型为液体制剂，田间使用时贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949的浓度为1×10⁸~5×10⁸cfu/ mL。

4.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949或权利要求2或3所述的微生物菌剂在防治花生果腐病、花生白绢病菌、棉花黄萎病菌、棉花立枯病菌或棉花枯萎病菌中的应用。