CN114085788A

CN114085788A - 一株雅马纳假单胞菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN114085788A
Application number: CN202111252221.4A
Authority: CN
Inventors: 胡瑞瑞; 刘宝生; 白鹏华
Original assignee: Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2041-10-27
Also published as: CN114085788B

Abstract

本发明公开了一株雅马纳假单胞菌菌株及其应用，所述菌株从萝卜地土壤中分离得到，经鉴定为雅马纳假单胞菌Pseudomonas yamanorum，保藏编号为CGMCC NO.22058。改菌株可用于苹果轮纹病、苹果褐腐病、桃褐腐病、梨黑星病、梨黑斑病和苹果斑点落叶病等果树果实和叶部病原真菌的生物防治。菌丝生长速率测定法表明菌株L1212发酵稀释液（2×10⁵cfu/mL）对以上6种病害96 h的抑制率范围是81.11~88.89%。菌株L1212发酵原液（2×10⁷cfu/mL）对苹果轮纹病、苹果褐腐病和梨黑星病离体试验表明防效均高于60%。对苹果轮纹病毒力测定，其EC₅₀值为4.49×10³ cfu/mL。以上结果说明可以用于北方地区大宗水果主要病害的防治。在果树病害的生物防治中具有非常广泛的应用前景。

Description

一株雅马纳假单胞菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于植物保护中杀菌剂技术领域，涉及一株雅马纳假单胞菌菌株及其应用，具体地说涉及一种高效防治苹果轮纹病等6种果树病害生防菌株雅马纳假单胞菌L1212及应用。

背景技术

苹果、梨和桃在我国广泛种植，年产量居世界领先水平。但在我国的苹果产区，苹果腐烂病、褐腐病和斑点落叶病是苹果生产中的三种重要病害；梨黑星病、黑斑病和桃褐腐病是近年来梨园和桃园生产中遇到的主要病害。上述几种病害会造成采前落叶、落果、腐烂，贮藏期烂果等现象，使经济遭受巨大损失。

目前我国对果树病害的防治还以化学防治为主，但大量使用化学农药不仅会影响果实品质，导致病原菌抗性增强，而且会破坏果园中有益微生物的数量和平衡。因此，生物防治将成为我国果树病害的主要防控措施之一，从而降低有害化学物质对环境和植物的影响。植物病害生物防治是利用有益微生物及其代谢产物对农作物病害进行有效防治的技术与方法。生防菌株来源广，可以从植物体表、植物组织内和土壤中培养获得。如有研究者从土壤中分离鉴定出对马铃薯疮痂病有良好防效的芽孢杆菌，还有从土壤中分离培养出分别对7种靶标病原菌有拮抗作用的放线菌株。

假单胞菌属最初被描述为包括革兰氏阴性菌、严格有氧杆状菌和通过极性鞭毛运动的细菌，其代谢产物具有高度多样性，是最多样化和最普遍的细菌属之一，其物种可从南极洲到热带环境中的沉积物、水、土壤、海洋、沙漠、植物根际、真菌、患病动物标本和人类临床标本分离得到。铜绿假单胞菌（P. aeruginosas）和荧光假单胞菌（P. fluorescens）是比较常见的假单胞菌属细菌。而亚马那假单胞菌（P. yamanorum）被报道为一种极地耐冷细菌，多用于研究其对土壤重金属离子的耐受性，但对果树等各种植物病害的研究尚属空白。研究表明，假单胞菌可有效防治多种植物细菌性和真菌性病害，对植物具有明显的促生长、增产作用。它耐温性较好，质量稳定，药效持久，无任何药害和残留，是无公害、绿色、有机果蔬生产的首选微生物制剂。在农业病害防治中假单胞菌具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一株雅马纳假单胞菌（P. yamanorum）及其应用。

第一方面，本发明要求保护一株雅马纳假单胞菌。

本发明所要求保护的菌株为雅马纳假单胞菌菌株L1212，保藏号为CGMCCNo.22058，保藏时间为2021年3月23日。保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Cultuer Collection Centre）进行保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

生理生化特性如下：

雅马纳假单胞菌菌株L1212：在NA培养基上菌落表面光滑，呈米白色，挑起有粘性。菌体为杆状，单个或排列分布，大小为（0.4~0.45）μm ×（1.3~1.8）μm。不形成芽孢，胞囊膨大，中生到端生。革兰氏染色为阴性，鞭毛为周生。雅马纳假单胞菌菌株L1212在NA固体培养基和NA液体培养基中培养发酵，培养条件：温度28~32 ℃，培养24 h，该菌的鉴定特征为：L1212为假单胞菌属杆状无核细菌，G^-，严格好氧。该菌株极度耐低温，在4~33 ℃范围内均能生长，最适生长温度范围为28~33 ℃；最适pH范围为5~6，该分离物能够在NaCl（w/v）为0~10%的条件下生长，所测得的16 S rRNA序列比对结果表明该菌株为雅马纳假单胞菌Pseudomonas yamanorum （同源性=100%）；所述的固体培养基为蛋白胨8.0 g，牛肉浸膏3.0g，NaCl 5.5 g，琼脂17 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0±0.1；所述的NA液体培养基：蛋白胨10.0g，NaCl 10.0 g，酵牛肉浸膏3.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0±0.1。

所述雅马纳假单胞菌（P. yamanorum）L1212的16S rDNA部分核苷酸序列如下：为SEQ ID No.1

GTGCAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAATTAATACTTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTC。

第二方面，本发明要求保护一种微生物发酵液。该方法包括：挑取活化后的假单胞菌L1212于NA培养基中，28 ℃、130 rpm恒温振荡培养24 h获得种子液。按照种子液:发酵培养基 = 1:100（v:v）的比例扩大培养，于28℃，130 rpm恒温振荡培养24 h得假单胞菌L1212发酵液。

本发明所要求保护的微生物发酵液浓度含量为2.0×10⁷～3.2×10⁷cfu/mL。

第三方面，本发明要求保护所述假单胞菌（P. yamanorum）L1212或所述微生物发酵液对果树病害真菌具有强烈的抑制作用，可制备成生物农药应用，

第四方面，本发明要求保护所述假单胞菌（P. yamanorum）L1212或所述微生物发酵液的施药方式，为喷雾或伤口注射中的一种。

第五方面，本发明要求保护所述假单胞菌（P. yamanorum）L1212或所述微生物发酵液在苹果、梨和桃等大田果树的真菌性病害防治中的应用。例如苹果轮纹病、苹果褐腐病、桃褐腐病、梨黑星病、梨黑斑病病害。其症状为：叶部病害为苹果斑点落叶病，即真菌性病原菌。实验结果显示：所述菌株L1212对苹果斑点落叶病菌丝生长抑制率随着培养时间呈逐渐上升的趋势，96 h后的抑制率为85.56%。

本发明公开的单胞菌菌株及其应用与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）本发明提供的雅马纳假单胞菌（P. yamanorum）L1212对人、畜、农作物安全，对环境友好。

（2）本发明提供的雅马纳假单胞菌（P. yamanorum）L1212杀菌谱广，抑菌活性高，可以减少化学农药的使用量，对延缓病原菌抗药性的产生，降低对生态环境的污染和促进农业可持续发展具有重要作用。

保藏说明

菌种名称：雅马纳假单胞菌

拉丁名：Pseudomonas yamanorum

菌株编号：L1212

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021年3月23日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No . 22058。

附图说明

图1：菌株L1212在NA培养基上的菌落形态图；

图2：菌株L1212对6种病原菌菌丝生长的抑制作用图；实线框为对照，虚线框为假单胞菌处理；编号1-3分别代表苹果褐腐病菌（Monilinia fructigena）、苹果斑点落叶病菌（Alternaria mali）和桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）；编号4-6分别代表梨黑斑病菌（Alternaria alternata）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）、梨黑星病菌（Venturia nashicola）；

图3：菌株L1212苹果轮纹病毒力试验图；

图4：菌株L1212对苹果轮纹病离体防效图；左：对照处理；右：雅马纳假单胞菌处理

图5：菌株L1212对苹果褐腐病离体防效图；左：对照处理；右：雅马纳假单胞菌处理

图6：菌株L1212梨黑星病离体防效图；左：对照处理；右：雅马纳假单胞菌处理。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明绝非仅限于这些实施例。以下实施例仅为本发明较优选的实施例，仅仅用于阐述本发明，不能理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的实质和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

如无特殊说明，本发明所采用的各种材料和试剂均能通过商业方式获得。同样，所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明提供了一株雅马纳假单胞菌，申请人命名为L1212，已于2021年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No . 22058。

实施例1

一株假单胞菌，所述假单胞菌株为雅马纳假单胞菌Pseudomonas yamanorum菌株L1212，于2021年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 22058。

雅马纳假单胞菌菌株L1212在NA固体培养基和NA液体培养基中培养发酵，培养条件：温度28℃，培养24 h，该菌的鉴定特征为：L1212为假单胞菌属杆状无核细菌，G^-，严格好氧，该菌株极度耐低温，在4~33℃范围内均能生长，最适生长温度为28~33 ℃；最适pH范围为5~6，该分离物能够在NaCl（w/v）为10%的条件下生长，所测得的16 S rRNA序列比对结果表明该菌株为雅马纳假单胞菌Pseudomonas yamanorum （同源性=100%）；所述的固体培养基为蛋白胨8.0 g，牛肉浸膏3.0 g，NaCl 5.5 g，琼脂17 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0±0.1；所述的NA液体培养基：蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，酵牛肉浸膏3.0 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0±0.1。

实施例2

一种假单胞菌菌株L1212可制成微生物发酵液；所述的菌液浓度为2×10⁷cfu/mL，其方法包括：挑取活化后的假单胞菌L1212于NA培养基中，28 ℃、130 rpm恒温振荡培养24h获得种子液。按照种子液:发酵培养基 = 1:100（v:v）的比例扩大培养，于28℃，130 rpm恒温振荡培养24 h得到假单胞菌L1212发酵液。进一步采取常规的喷雾或伤口直接注射对离体果树病害进行防控。

实施例3

菌株的鉴定特征

1 菌株形态观察和染色反应

L1212菌株在NA平板上的形态特征为：菌类米白色，圆润，表面光滑，大小（0.4~0.45）μm ×（1.3~1.8）μm。结晶紫染色后观察该菌形态为杆状。

2 菌株在不同环境因素中的稳定性

2.1 菌株L1212对氧气的耐受力

采用深层琼脂法测定菌株L1212对氧气的耐受力，在装有NA深层培养基的试管中的不同深度处接入L1212，做好标记，28 ℃恒温培养箱内静置培养，逐日观察其生长状况，直至7 d后结果清晰为止。根据在不同深度培养基种的生长情况，判断其对氧气的需求及耐受力。结果表明，L1212只在培养基表层生长，为严格好氧菌。

2.2 菌株L1212在不同温度中的稳定性

制备NA平板，将L1212涂平板，将平板倒置于4 ℃、10 ℃、25 ℃、28 ℃、33 ℃、35℃、36 ℃及37 ℃条件下保温48 h后，观察其生长状况，每处理重复3次。

表1 菌株L1212在不同温度中的稳定性

“-”表示不生长，“+”表示生长较差，“++”表示生长一般，“+++”表示生长良好，下同。

由表1可知，L1212耐低温，可在4 ℃的温度条件下生长；25~33 ℃是其最适生长温度，生长良好；33 ℃以上该菌不能生长。

2.3 pH对菌株L1212的影响

制备pH 2~12的NA液体培养基，每一处理接种等量、等浓度的L1212菌液，120 rpm/min，30 ℃下振荡培养24 h后，测定培养物的OD₆₀₀值。每处理重复3次。

表2 菌株L1212在pH条件中的稳定性

由表2可知，L1212的生长最适pH范围是5~6，为偏酸性菌株。

2.4 渗透压对菌株L1212的影响

制备含0%、0.85%、2%、5%、8%、10%、15%及20%NaCl的NA平板。将L1212涂平板，28℃恒温培养7 d，然后观察并记录不同处理条件下L1212的生长情况。每处理重复3次。

表3 菌株L1212在不同渗透压中的稳定性

由表3可知，L1212可在10%的盐浓度下生长，但不属于嗜盐细菌。

实施例4

假单胞菌L1212对6种果树病原真菌的抑菌作用

1）供试病原菌

供试病原菌包括苹果轮纹病、苹果褐腐病、桃褐腐病、梨黑星病、梨黑斑病和斑点落叶病。以上供试菌株均由天津市农业科学院植物保护研究所果林病虫研究室分离保存所有。

2）试验方法：

本实验采用菌丝生长速率法测定菌株L1212对病原真菌的抑制作用，具体如下：每皿（直径90 mm）中加入1 mL菌株L1212发酵液（2×10⁶cfu/mL）和9 mL冷却至45~50℃的PDA培养基，混匀均匀，此时菌株L1212的菌浓度为2×10⁵cfu/mL。冷却后在平皿中等距离接入一直径为6 mm的病原菌菌饼，设置不含L1212菌液处理为空白对照，28 ℃恒温培养，分别于48 h、72 h和96 h调查各处理病原菌生长直径，计算抑制率。每处理重复3次，取平均值。抑菌率结果详见详见表4，抑菌试验照片见图2。

表4 本发明所述菌株L1212对病原菌菌丝生长的抑制率

表4结果显示本发明所述菌株L1212对6种病原真菌均有强抑制作用，随着培养时间的延长，菌株L1212对各菌株的抑制率呈逐渐上升的趋势。96 h后的抑制率均达80%以上（81.11%~88.89%），可以有效防治上述病害。

实施例5

本发明所述菌株L1212对苹果轮纹病的毒力测定

各处理组为菌株L1212发酵原液和稀释液。具体操作为：将本发明所述菌株L1212发酵原液用无菌水稀释10倍、100倍、1000倍、2000倍、4000倍和8000倍，此时各处理的浓度分别为：2×10⁶cfu/mL、2×10⁵cfu/mL、2×10⁴cfu/mL、1×10⁴cfu/mL、5×10³cfu/mL和2.5×10³cfu/mL。按实施例2中菌丝生长速率法测定各浓度对苹果轮纹病菌的抑制率，设置不含L1212菌液处理为空白对照，28 ℃恒温培养，培养5 d，每个处理设3个重复。毒力测定结果见表5和图3。

表5 本发明所述菌株L1212对对苹果轮纹病的毒力测定

表5结果显示本发明所述菌株L1212原液对苹果轮纹病病原菌抑菌率高达89.81%，毒力回归方程为y = 0.258x-0.658，EC₅₀值为4.49×10³ cfu/mL。

实施例6

本发明所述菌株L1212注射处理对3种果实病的防治效果

将本发明所述菌株L1212发酵原液，浸每个处理设3个重复。防效按如下公式计算，表中数据为3个重复处理的平均值，试验结果详见表3和图5。

防效（%）=（对照病斑直径-处理病斑直径）/对照病斑直径×100

表6 本发明所述菌株L1212对3种果实病害离体防效

表6结果显示：本发明所述菌株L1212对苹果轮纹病、苹果褐斑病和梨黑星病3种果实病害的离体防效均高于60%，说明所述菌株L1212对果树病害具有较高的防控效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市农业科学院

<120> 一株雅马纳假单胞菌菌株及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgcagtcga gcggtagaga gaagcttgct tctcttgaga gcggcggacg ggtgagtaat 60

gcctaggaat ctgcctggta gtgggggata acgtccggaa acggacgcta ataccgcata 120

cgtcctacgg gagaaagcag gggaccttcg ggccttgcgc tatcagatga gcctaggtcg 180

gattagctag ttggtggggt aatggctcac caaggcgacg atccgtaact ggtctgagag 240

gatgatcagt cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300

gaatattgga caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggtctt 360

cggattgtaa agcactttaa gttgggagga agggcagtaa attaatactt tgctgttttg 420

acgttaccga cagaataagc accggctaac tctgtgccag cagccgcggt aatacagagg 480

gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcgcg taggtggttc gttaagttgg 540

atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgcattcaaa actgacgagc tagagtatgg 600

tagagggtgg tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatagga aggaacacca 660

gtggcgaagg cgaccacctg gactgatact gacactgagg tgcgaaagcg tggggagcaa 720

acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg tcaactagcc gttgggagcc 780

ttgagctctt agtggcgcag ctaacgcatt aagttgaccg cctggggagt acggccgcaa 840

ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 900

cgaagcaacg cgaagaacct taccaggcct tgacatccaa tgaactttct agagatagat 960

tggtgccttc gggaacattg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020

atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct tagttaccag cacgtaatgg 1080

tgggcactct aaggagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1140

atcatggccc ttacggcctg ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca gagggttgcc 1200

aagccgcgag gtggagctaa tcccagaaaa ccgatcgtag tccggatcgc agtctgcaac 1260

tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgaatca gaatgtcgcg gtgaatacgt 1320

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcacc agaagtagct 1380

agtctaacct tc 1392

Claims

1.一株雅马纳假单胞菌菌株，其特征在于所述菌株为雅马纳假单胞菌Pseudomonas yamanorum菌株L1212，于2021年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 22058。

2.权利要求1所述的雅马纳假单胞菌菌株L1212，其特征如下：雅马纳假单胞菌菌株L1212在NA固体培养基和NA液体培养基中培养发酵，培养条件：温度28~32 ℃，培养24 h，该菌的鉴定特征为：L1212为假单胞菌属杆状无核细菌，G^-，严格好氧；该菌株极度耐低温，在4~33 ℃范围内均能生长，最适生长温度范围为28~33 ℃；最适pH范围为5~6，该分离物能够在NaCl（w/v）为0~10%的条件下生长，所测得的16 S rRNA序列比对结果表明该菌株为雅马纳假单胞菌P. yamanorum（同源性=100%）；所述的固体培养基为蛋白胨8.0 g，牛肉浸膏3.0g，NaCl 5.5 g，琼脂17 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0±0.1；所述的NA液体培养基：蛋白胨10.0g，NaCl 10.0 g，酵牛肉浸膏3.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0±0.1。

3.权利要求1所述的雅马纳假单胞菌菌株L1212可用于防治北方地区大宗果树主要果实和叶部病虫害方面的应用；所述的大宗果树指的是：苹果、梨和桃。

4.权利要求3所述应用，其特征在于所述主要果实病害为苹果轮纹病Botryosphaeria dothidea、苹果褐腐病Monilinia fructigena、桃褐腐病Monilinia fructicola、梨黑星病Venturia nashicola、梨黑斑病Alternaria alternata褐苹果斑点落叶病Alternaria mali。

5.权利要求3所述应用，其特征在于所述主要叶部病害为苹果斑点落叶病。

6.根权利要求3所述应用，其特征在于所述果实和叶部病害均为真菌性病原菌。

7.权利要求1所述的雅马纳假单胞菌菌株L1212可制成微生物发酵液；所述的菌液浓度为2×10⁷~3.2×10⁷cfu/mL。

8.权利要求7所述微生物发酵液制备方法，其特征在于所该方法包括：挑取活化后的假单胞菌L1212于NA培养基中，28 ℃、130 rpm恒温振荡培养24 h获得种子液；按照种子液:发酵培养基 = 1:100（v:v）的比例扩大培养，于28℃，130 rpm恒温振荡培养24 h得假单胞菌L1212发酵液。

9.权利要求7所述微生物发酵液，其特征在于所述微生物发酵液对任一病害的离体防治方式可以采取喷雾或伤口注射中的一种。