CN110616171B

CN110616171B - 一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌及其活菌制剂与应用

Info

Publication number: CN110616171B
Application number: CN201910931659.1A
Authority: CN
Inventors: 孙中涛; 辛寒晓; 刘丽英; 赵升远; 孙国科; 杨越超; 史庆华; 候汉学; 寇娟妮; 刘珂欣
Original assignee: Dezhou Bahu Biotechnology Co ltd; Shandong Zoeticland Biological Technology Co ltd; Shandong Agricultural University
Current assignee: Dezhou Bahu Biotechnology Co ltd; Shandong Zoeticland Biological Technology Co ltd; Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2021-01-19
Anticipated expiration: 2039-11-20
Also published as: CN110616171A

Abstract

本发明公开了一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌及其活菌制剂与应用。一株分离自盐碱地白菜根际土壤的太平洋芽孢杆菌(Bacillus pacificus)YJJK‑16，2019年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18300。该菌株的发酵液加入没食子酸丙酯、生化黄腐酸粉和卡松搅拌均匀，得到活菌制剂。太平洋芽孢杆菌YJJK‑16耐盐碱能力较强，在盐碱土壤中定植率高，对白菜软腐病病原菌具有较强的拮抗作用，可用于生产微生物肥料，特别是盐碱地白菜专用微生物肥料，用于白菜软腐病的生物防治，减少病害发生，提高产量和质量。

Description

一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌及其活菌制剂与应用

技术领域

本发明涉及一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌及其在防治白菜软腐病方面的应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

白菜也称黄芽菜、大白菜，为十字花科芸薹属植物，在我国广泛栽培，具有“百菜之王”之称。软腐病一直是制约大白菜高产优质栽培和大面积发展的关键因素之一，在全国各地都普遍发生，且危害期很长。它在田间、贮运期以至市场上都能引起白菜腐烂而造成十分严重的损失，产量损失可达30％-50％，储藏损失可达20％左右。

软腐病的病原菌属于欧文氏菌属(Erwinia)，分为3个群，即火疫病菌群(amylorora)、草生欧文氏菌群(herhiacala)和胡萝卜软腐欧文氏菌群(carotovora)。其中胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜致病亚种(Erwinia carotovora subsp.Carotovora)是导致白菜软腐病发生的主要致病菌。软腐病病菌在土壤中或在带病残体上越冬，经雨水、灌溉水或者昆虫传播，引起白菜软腐病大面积发生。

长期以来，白菜软腐病以化学防治为主，并结合选育抗病品种、优化栽培管理等技术措施。化学防治以大量使用农用链霉素、氯溴异氰尿酸、叶枯唑、森铜悬浮剂等药物为主。大量使用化学农药对人类健康、食品安全和环境保护存在巨大的潜在威胁，已经引起社会的日益关注。发展生物防治技术，减量使用化学农药，是农业发展的必然趋势。

生物防治是利用有益生物或其代谢产物来防治病虫害的方法。其特点是不污染环境、对人和其他生物安全、节约能源、保持生态平衡等特点，是发展绿色食品、保护人身健康的重要手段。目前，蜡状芽孢杆菌、哈茨木霉、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、淡紫灰链孢、灰色链霉菌等有益微生物已用于白菜软腐病的生物防治，但由于防治效果有限，未能在农业生产中大面积推广。针对上述现状，本发明提供一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌，用于白菜软腐病的生物防治，特别是用于盐碱地栽培的白菜软腐病的生物防治。

发明内容

本发明的目的是提供一株分离自盐碱地白菜根际土壤的太平洋芽孢杆菌(Bacillus pacificus)YJJK-16及其活菌制剂与应用。太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌株耐盐碱能力强，能在盐碱土壤中存活、定植，且对胡萝卜软腐欧文氏菌引起的白菜软腐病具有较高的防效。

一株分离自盐碱地白菜根际土壤的太平洋芽孢杆菌(Bacillus pacificus)YJJK-16，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCCNo.18300；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年7月26日。

所述太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌株的菌落及菌体特征：在LB培养基上37℃培养2天，菌落呈乳白色，直径1.5-2.5mm，半透明、隆起状，表面光滑湿润，边缘规则，质地较均匀；菌体杆状，有芽孢。其菌落形态和菌体形态分别如图1-2所示。

所述太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌株的生理生化特征：革兰氏染色试验阳性、接触酶试验阳性、淀粉水解试验阳性、运动性试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、明胶液化试验阳性、D-葡萄糖产酸试验阳性、厌氧生长试验阴性、乙酰甲基甲醇试验阴性、生长温度范围28-40℃、10％氯化钠中生长。

所述太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌株活菌制剂的制备方法，其特征是，太平洋芽孢杆菌(Bacillus pacificus)YJJK-16经扩大培养(采用LB培养基)后，接种于发酵培养基，35-37℃培养24-28h，得到发酵液，然后加入没食子酸丙酯(PG)0.01-0.02％(w/w)、生化黄腐酸粉5-7％(w/w)和卡松0.01-0.02％(w/w)，搅拌均匀，得到活菌制剂。

所述发酵培养基的配方为：豆粕粉15-20g、玉米粉20-25g、酵母浸粉1g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.0g、硫酸锰0.2g、复合酶制剂0.1g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为(质量比)：碱性蛋白酶60％、纤维素酶40％。

太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂的使用方法：太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂加水稀释200～300倍，移苗时蘸根或浇水时随水冲施。

本发明的有益效果：

本发明太平洋芽孢杆菌YJJK-16分离自盐碱地土壤，耐盐碱能力较强，在盐碱土壤中定植率高，且对白菜软腐病病原菌具有较强的抑制作用，可用于生产生物肥料，特别是盐碱地专用微生物肥料，用于白菜软腐病的生物防治，可减少病害发生，提高白菜产量和质量。

本发明的发酵培养基中添加复合酶制剂，灭菌时在升温过程中对豆粕与玉米粉等原料进行水解，可缩短延迟期，提高原料利用率，提高发酵液中的活菌浓度。发酵液中加入抗氧化剂没食子酸丙酯与对活菌具有保护作用的生化黄腐酸粉，可以减少菌剂在存放过程中的活菌损失，提高产品的生物稳定性。

附图说明

图1为本发明太平洋芽孢杆菌YJJK-16的菌落形态；

图2为本发明太平洋芽孢杆菌YJJK-16的菌体形态。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：太平洋芽孢杆菌YJJK-16的筛选

(1)耐盐碱菌株的筛选

太平洋芽孢杆菌YJJK-16分离自白菜根际土壤。土壤取样于山东省东营市，为盐碱土壤。具体分离方法为：称取10g土样，放入预灭菌的装有90mL去离子水和10-20粒玻璃珠的250mL锥形瓶中，180r/min震荡20min。采用梯度稀释法，将土壤溶液稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。吸取0.1mL不同稀释度的土壤溶液，放入高盐碱选择性培养基平板中，涂布均匀，然后于37℃培养24-48h。根据菌落及菌体形态的差异，将不同菌株分别转接至保藏培养基试管斜面上，37℃培养1-2d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用。共筛选出耐盐碱菌株82株。

所述高盐碱选择培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl₂＝10∶1∶1)30g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH9.0，121℃灭菌20min。

所述保藏培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH7.0，121℃灭菌20min。

(2)抑菌圈法筛选白菜软腐病致病菌的拮抗菌株

将200mL LB培养基融化，待冷却到45℃左右时，加入5mL(10⁵cfu/mL)的白菜软腐病致病菌——胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜致病亚种(Erwinia carotovorasubsp.Carotovora)的菌悬液，摇匀，倒入培养皿中。在其上点接步骤(1)筛选到的耐盐碱菌株，每皿接四种不同菌株，于37℃恒温培养48h后，观察各种菌株的生长情况，筛选菌落大、抑菌圈与菌落直径比值大的菌株。共筛选出具有较强抑菌活性的菌株3株。

综合考虑所筛3株耐盐碱拮抗菌株的生长速度和对白菜软腐病病原菌的拮抗能力，选取一株作为生产菌株，编号为YJJK-16。

实施例2：太平洋芽孢杆菌YJJK-16的鉴定

(1)形态与生理生化特征

所述太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌株的菌落及菌体特征：在LB培养基上37℃培养2天，菌落呈乳白色，直径1.5-2.5mm，半透明、隆起状，表面光滑湿润，边缘规则，质地较均匀；菌体杆状，有芽孢。所述LB培养基即Luria-Bertani培养基，其配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂20g、水1000mL，pH7.0。

(2)16S rDNA序列分析

将YJJK-16菌株接种到LB培养基中，于37℃，180r/min摇床培养24h，收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27:5′-AGA GTT TGA TCATGG CTC AG-3′和F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由上海生工生物技术有限公司测序，所得序列如序列表SEQ-1所示。

通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为太平洋芽孢杆菌，命名为太平洋芽孢杆菌(Bacillus pacificus)YJJK-16。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.18300；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年7月26日。

实施例3：太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌剂的制备

所述太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌株菌剂的制备方法包括以下步骤：

1)菌种活化：将低温保藏的太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌种转接至LB培养基试管斜面，于37℃培养24h进行活化。所述LB培养基即Luria-Bertani培养基，其配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂20g、水1000mL，pH7.0。

2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌苔，接种于LB培养基中，37℃培养24h。所述LB培养基即Luria-Bertani培养基，其配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂20g、水1000mL，pH7.0。

3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以2％的接种量转接入装有6L LB培养基的10L种子罐中，于37℃培养20h，全程搅拌转速200rpm，0-6h通风量为3L/min，6-20h通风比为6L/min。

4)发酵培养：将种子罐菌种以2％的接种量转接入500L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基300L，37℃培养28h，获得太平洋芽孢杆菌YJJK-16的发酵液。全程搅拌转速为180rpm，0-6h通风量为200L/min，6-28h通风量为300L/min。发酵结束后，发酵液中太平洋芽孢杆菌YJJK-16的活菌数为(1～2)×10¹⁰cfu/ml。

步骤4)所述发酵培养基的配方为：豆粕粉15g、玉米粉20g、酵母浸粉1g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.0g、硫酸锰0.2g、复合酶制剂0.1g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为碱性蛋白酶60％、纤维素酶40％。碱性蛋白酶和纤维素酶均由泰安信得利生物科技有限公司生产，产品规格均为20万U/g。碱性蛋白酶的活力单位定义与检测方法执行国家标准GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》，纤维素酶的酶活力单位定义与检测方法执行中华人民共和国轻工行业标准QB 2583-2003《纤维素酶制剂》。

步骤4)所述发酵培养基的制备方法为：按照配方称取原料，溶于水中，加热至50-55℃，保温1-2h，然后升温至121℃，保温20-30min进行灭菌。

向步骤4)所述太平洋芽孢杆菌YJJK-16发酵液中加入没食子酸丙酯(PG)0.01％(w/w)、生化黄腐酸粉5％(w/w)和0.01％卡松，搅拌均匀，获得活菌制剂，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×10¹⁰cfu/g。所述生化黄腐酸粉由山东泉林嘉有肥料有限责任公司生产，其黄腐酸含量为40％。

实施例4：太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌剂对白菜软腐病的防治作用

盆栽实验用土取自山东省东营市垦利区，土壤类型为滨海盐渍土，pH8.01，全盐含量2.21‰，有机质含量7.4g/kg，全氮含量719mg/kg，速效氮含量52.6mg/kg，速效磷含量22.54mg/g，速效钾含量79.54mg/g。盆栽试验施肥量：有机肥使用量为1％(有机肥干重/土壤干重)，所述有机肥由山东佐田氏生物科技有限公司生产，其养分指标为有机质55.6％、N2.1％、P₂O₅ 2.2％、K₂O 1.6％。

盆栽试验共设3个处理组(T1～T3)和2个对照组(CK1～CK2)，每组设50株白菜幼苗。

处理组T1～T3：每株白菜幼苗接种太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂(1×10¹⁰cfu/g)100倍稀释液和欧文氏菌孢子悬浮液(1×10⁶孢子/mL)各50mL；

对照组CK1：每株接种预灭菌的太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂100倍稀释液50mL，欧文氏菌孢子悬浮液(1×10⁶孢子/mL)50mL；

对照组CK2：每株接种预灭菌的太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂100倍稀释液50mL，预灭菌的欧文氏菌孢子悬浮液(1×10⁶孢子/mL)50mL。

白菜植株生长到3～4叶期后，将太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂(1×10¹⁰cfu/g)稀释至100倍，处理组T1～T3幼苗每株灌根50mL。对照组CK1和CK2每株灌根50mL预灭菌的太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂100倍稀释液。5天后，处理组T1～T3和对照组CK1每株灌根50mL欧文氏菌孢子悬浮液(1×10⁶孢子/mL)，对照组CK2每株灌根50mL预灭菌的欧文氏菌孢子悬浮液(1×10⁶孢子/mL)。病原菌灌根5天、10天、20天、30天后，观察症状并统计病害严重度和防效。

病害分级标准以整株为指标，具体分级为：

0级：无症状；

1级：叶片始见水渍状褐色病斑；

3级：底部第1～2叶片基部有明显病斑；

5级：外部叶片有1/3～1/2腐烂；

7级：外部叶片全部腐烂；

9级：整株腐烂。

病情指数(％)＝∑(级值×株数)/(9×总株数)×100。

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

试验结果如表1所示，接种欧文氏菌5天后，对照组CK1个别植株上叶片始见水渍状褐色病斑，而处理组T1～T3植株无任何症状。10天后，对照组CK1植株底部第1～2叶片基部有明显病斑，处理组T1～T3植株有个别植株上叶片始见水渍状褐色病斑。三个处理组T1～T3植株病情指数分别为0.44、0.89和0.67，而对照组CK1病情指数达到了6.89，防效分别为93.61％、87.08％和90.28％。20天后，对照组CK1植株外部叶片有1/3～1/2腐烂，而处理组T1～T3植株有个别植株底部第1～2叶片基部有明显病斑，处理组T1～T3植株病情指数分别为2.00、3.56和4.44，而对照组CK1病情指数达到16.67，防效分别为88.00％、78.64％和73.37％。30天后，对照组CK1植株出现外部叶片全部腐烂，有一株整株腐烂，处理组T1～T3植株有个别植株底部第1～2叶片基部有明显病斑。三个处理组T1～T3植株病情指数分别为3.11、4.00和4.89，而对照组CK1病情指数达到了28.22，防效分别为88.98％、85.83％和82.67％。

表1太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂对白菜软腐病的防治作用

从结果可以看出：本发明的太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌剂对欧文氏菌引起的白菜软腐病具有较高的防效，30天平均防效在85％以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东佐田氏生物科技有限公司

<120> 一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌及其活菌制剂与应用

<130> 0

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 太平洋芽孢杆菌（Bacillus pacificus）YJJK-16的16S rDNA 序列

<400> 1

cagtcgagcg aatggattga gagcttgctc tcaagaagtt agcggcggac gggtgagtaa 60

cacgtgggta acctgcccat aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120

taacattttg aaccgcatgg ttcgaaattg aaaggcggct tcggctgtca cttatggatg 180

gacccgcgtc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 240

cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360

atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag aacaagtgct agttgaataa 420

gctggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggtggt 540

ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg aaactgggag 600

acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatat 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc tggtctgtaa ctgacactga ggcgcgaaag 720

cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780

gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg aagttaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgaaaac 960

cctagagata gggcttctcc ttcgggagca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080

catcattaag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac 1200

aaagagctgc aagaccgcga ggtggagcta atctcataaa accgttctca gttcggattg 1260

taggctgcaa ctcgcctaca tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380

ccgaagtcgg tggggtaacc tttatggagc cagccgccta aggtgacaga g 1431

Claims

1.一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌(Bacillus pacificus)YJJK-16，该菌株的保藏编号为CGMCC No.18300。

2.权利要求1所述的耐盐碱太平洋芽孢杆菌YJJK-16在防治欧文氏菌引起的白菜软腐病方面的应用。

3.一种以权利要求1所述的耐盐碱太平洋芽孢杆菌YJJK-16为主要有效成分的活菌制剂。

4.权利要求3所述的活菌制剂的生产方法，其特征是，将权利要求1所述的太平洋芽孢杆菌YJJK-16经扩大培养后，接种于发酵培养基，35-37℃培养24-28h，得到发酵液，然后进一步制备活菌制剂；

所述发酵培养基为：豆粕粉15-20g、玉米粉20-25g、酵母浸粉1g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.0g、硫酸锰0.2g、复合酶制剂0.1g、水1000mL，初始pH7.5；

所述复合酶制剂按质量比计为：碱性蛋白酶60％、纤维素酶40％。

5.如权利要求4所述的活菌制剂的生产方法，其特征是，发酵液中加入没食子酸丙酯0.01-0.02％、生化黄腐酸粉5-7％和卡松0.01-0.02％，搅拌均匀，得到活菌制剂。

6.权利要求3所述的活菌制剂在防治欧文氏菌引起的白菜软腐病方面的应用。

7.一种防治盐碱地白菜软腐病的方法，其特征是，将权利要求3所述的太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂加水稀释200～300倍，移苗时蘸根或浇水时随水冲施，活菌制剂的活菌含量为(1.0～2.0)×10¹⁰cfu/g。