CN111004760B

CN111004760B - 一株苏云金芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN111004760B
Application number: CN202010015318.2A
Authority: CN
Inventors: 丁延芹; 汪成墙; 董建海; 厉启梅; 孙永淑; 邴辉
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2040-01-07
Also published as: CN111004760A

Abstract

本发明提供一株苏云金芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。该菌株已于2019年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.19222。本发明的苏云金芽孢杆菌其具有产生蛋白酶、产铁载体等功能，本发明筛选获得的苏云金芽孢杆菌能够明显改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，提高植株生物量，增加生姜茎叶干湿重，从而证明了本发明提供菌株的促生效果，并丰富了植物促生菌的菌种资源，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一株苏云金芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株苏云金芽孢杆菌及其应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

微生物与农业(如土壤肥力、作物根际微生态环境)关系密切，各类微生态制剂的研究与应用技术也不断被报道，植物促生菌(PGPR)就是其中之一。PGPR是自由生活的土壤细菌，能促进矿物质的溶解，有助于增强宿主植物的抗性、对养分的吸收，从而增强植物的生长和产量的影响。

生姜作为我国主要的经济蔬果之一，在我国广泛种植，我国也是世界上生姜栽培面积最大且生产总量最多的国家，其中北方则主要以山东省种植面积最大。但是随着生姜在我国的种植面积逐渐广泛，生姜病害也日益严重，由于开始时长期使用化学农药，导致大量地区土壤板结，肥力下降不能供给足够的营养给植物，从而造成大量减产。研究人员希望通过使用将植物促生菌进行发酵后施用于土壤或植物表面的微生物接种剂来改变生姜种植现状。

微生物接种剂是天然产品，广泛用于控制害虫，改善土壤和作物的质量，从而保证人类健康。微生物接种剂与土壤混合后可以提高土壤肥力，减少土传病害的发生。微生物接种剂能够最大限度地减少化学品使用造成的的负面影响，从而提高农产品的质量和产量。并且微生物接种剂施用后不会对周围环境造成不良影响，并且可以持续地为作物提供植物营养。随着二十世纪后期世界农业生产对微生物接种剂应用的日益重视，我国也开展了将植物促生菌应用在水稻、小麦、玉米、大豆、马铃薯、番茄等农作物上的研究。

然而，发明人发现，目前有关在生姜上具有显著促生作用的植物促生菌特别是芽孢杆菌报道却较少。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一株苏云金芽孢杆菌及其应用，经试验证明，本发明提供的苏云金芽孢杆菌能够明显改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，增加生姜茎叶干湿重等。从而为生姜促生提供了新的微生物种质资源。

为实现上述发明目的，本发明公开以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201，该菌株已于2019年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.19222。

本发明的第二个方面，提供一种微生物菌剂，其含有所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201。

具体的，所述微生物菌剂为一种微生物接种剂。将本发明微生物接种剂在生姜定苗后灌根处理，可以显著促进生姜生长。

更具体的，所述微生物接种剂是将所述苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)TA-201接种于液体培养基中进行培养得到的；

其中，所述液体培养基优选为LB培养基；

所述LB培养基组分为：酵母浸膏，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，蒸馏水，1000mL。121℃灭菌20min，pH7.0。

培养条件具体为：在30～40℃(优选为37℃)培养20～30h(优选为24h)，转速：160-200rpm(优选180rpm)。

本发明的第三个方面，上述苏云金芽孢杆菌TA-201和/或微生物菌剂在如下1)-3)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

1)产蛋白酶；

2)产铁载体；

3)促进植物生长。

其中，所述植物具体为生姜，促进植物生长具体表现为：改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，增加生姜茎叶干湿重。

本发明的第四个方面，提供一种促进生姜生长的方法，所述方法包括在生姜定苗后，向生姜植株根际土壤中施用上述苏云金芽孢杆菌TA-201和/或微生物菌剂。具体的，施用方式包括但不限于喷施、灌注；更具体的，施用方式为将苏云金芽孢杆菌TA-201和/或微生物菌剂进行灌根处理。

与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：

本发明首次报道了一种具有促生姜生长作用的苏云金芽孢杆菌，经盆栽试验证明，本发明筛选获得的苏云金芽孢杆菌能够明显改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，增加生姜茎叶干湿重，从而证明了本发明提供菌株的促生效果，并丰富了植物促生菌的菌种资源。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中苏云金芽孢杆菌的镜检图。

图2为本发明实施例1中苏云金芽孢杆菌的平板菌落图。

图3为本发明实施例2中苏云金芽孢杆菌产蛋白酶能力图。

图4为本发明实施例2中苏云金芽孢杆菌的产铁载体能力图。

图5为本发明实施例3中苏云金芽孢杆菌盆栽试验促生效果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一个具体实施方式中，提供一株苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)TA-201，该菌株已于2019年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCCNo.19222。

在本发明中，通过测定该菌株的16S rDNA基因序列(见SEQ ID NO.1)并通过形态特征及生理生化指标测定，最终确定该菌株属于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。

具体的，所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201在LB平板培养基(酵母浸膏，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，琼脂，1.6％，蒸馏水，1000mL，121℃灭菌20min，pH7.0)上培养24h后菌落呈圆形规则状，乳白色，凸起，不透明；菌体呈长杆状，产芽孢，革兰氏阳性。

所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201的生理生化特征为：淀粉水解试验阳性，明胶液化试验阳性，葡萄糖发酵试验阳性，阿拉伯糖发酵试验阴性，甘露醇发酵试验阳性，木糖发酵试验阳性。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)TA-201的培养方法，具体为：将活化后的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)TA-201置于LB液体培养基中培养，培养条件为37℃下有氧培养24h，如摇床振荡(180rpm)培养。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，其含有所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201。所述微生物菌剂可以为一种微生物接种剂。

本发明的又一具体实施方式中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。

本发明的又一具体实施方式中，所述固体载体为矿物材料、生物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、草炭土和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。

本发明的又一具体实施方式中，所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。

本发明的又一具体实施方式中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

本发明的又一具体实施方式中，上述苏云金芽孢杆菌TA-201和/或微生物菌剂在如下1)-3)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

1)产蛋白酶；

2)产铁载体；

3)促进植物生长。

本发明的又一具体实施方式中，所述植物具体为生姜，促进植物生长具体表现为：改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，增加生姜茎叶干湿重中的一种或多种。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种促进生姜生长的方法，所述方法包括在生姜定苗后，向生姜植株根际土壤中施用上述苏云金芽孢杆菌TA-201和/或微生物菌剂。施用方式包括但不限于喷施、灌注。更具体的，施用方式为将苏云金芽孢杆菌TA-201和/或微生物菌剂进行灌根处理。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1：菌株鉴定

本发明通过对筛选获得的一株具有促生姜生长的菌株，经16S rDNA以及生理生化指标鉴定，确定该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。如图1和2所示，所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201的菌落及菌体特征为：在LB培养基上培养24h后菌落呈圆形规则状，乳白色，凸起，不透明；菌体呈长杆状，产芽孢，革兰氏阳性。该菌株的生理生化特征为：淀粉水解试验阳性，明胶液化试验阳性，葡萄糖发酵试验阳性，阿拉伯糖发酵试验阴性，甘露醇发酵试验阳性，木糖发酵试验阳性。

所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201的16S rDNA序列如下：

GTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGAC(SEQ IDNo.1)。

实施例2：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201对生姜的促生试验

菌液的制备方法：将斜面保存的菌种转接到装有5mL LB液体培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12h，温度：37℃，转速：180rpm；将活化好的菌液按1％接种量接入到50mLLB液体培养基中，放入摇床培养24h，温度：37℃，转速：180rpm，制成菌液。

其中，LB液体培养基：酵母浸膏，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，蒸馏水，1000mL。121℃灭菌20min，pH7.0。

将生姜幼苗移栽到盆栽土壤中，在生姜定苗后取2mL菌液稀释(稀释倍数为100倍)，然后以盆栽中每株生姜200mL稀释后菌液的用量进行灌根处理(CK组为取2mL灭菌LB液体培养基稀释到20mL后进行灌根处理)。在培养50d后测量对生姜的促生效果，结果如表1以及图3所示。可以看出：在盆栽条件下，用本发明苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)TA-201的菌液在实际土壤条件下对生姜生长初期灌根处理后，能够对生姜产生很好的促生效果，生姜株高、生姜地径、最大根长和茎叶湿重较对照组均有很大的增加，达到了显著或极显著差异。

表1促生效果

实施例3：菌株TA-201产蛋白酶、产铁载体试验

检测苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201产蛋白酶、产铁载体能力，结果如表2-3以及图4-5所示。

表2蛋白酶产生结果

表3铁载体定量结果

综上，本发明筛选获得的苏云金芽孢杆菌具产蛋白酶、铁载体等功能，本发明筛选的菌株在盆栽条件下对生姜促生效果的研究，所采用的试验方法更贴近实际应用状态，通过直接以土壤种植生姜为试验样品，接近于生姜的农业种植方式，这也有力地说明了在生产种植中对生姜促生方面的效果是非常明显的。同时，本发明检测了盆栽生姜株高、最大根长、地径以及茎叶湿重，有力的证明了本菌株的促生效果。另外，目前关于苏云金芽孢杆菌在植物促生上的应用鲜有报道，这说明本研究筛出的菌株丰富了菌种资源。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一株苏云金芽孢杆菌及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1424

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌TA-201 16S rDNA

<400> 1

gtcgagcgaa tggattaaga gcttgctctt atgaagttag cggcggacgg gtgagtaaca 60

cgtgggtaac ctgcccataa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggata 120

acattttgaa ctgcatggtt cgaaattgaa aggcggcttc ggctgtcact tatggatgga 180

cccgcgtcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg 240

acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300

agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 360

gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa caagtgctag ttgaataagc 420

tggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480

aatacgtagg tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggtggttt 540

cttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg gtcattggaa actgggagac 600

ttgagtgcag aagaggaaag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatatgg 660

aggaacacca gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact gacactgagg cgcgaaagcg 720

tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt 780

gttagagggt ttccgccctt agtgctgaag ttaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840

acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900

tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgaaaaccct 960

agagataggg cttctccttc gggagcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1020

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccat 1080

cattaagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac 1140

gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acggtacaaa 1200

gagctgcaag accgcgaggt ggagctaatc tcataaaacc gttctcagtt cggattgtag 1260

gctgcaactc gcctacatga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg 1380

aagtcggtgg ggtaaccttt ttggagccag ccgcctaagg tgac 1424

Claims

1.一株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201，该菌株已于2019年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCCNo.19222。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-201。

3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为微生物接种剂。

4.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂是由苏云金芽孢杆菌TA-201接种于液体培养基中进行培养得到的。

5.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述液体培养基为LB培养基。

6.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，发酵培养条件具体为：在30～40℃培养20～30h，转速：160-200rpm。

7.如权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，发酵培养条件具体为：在37℃培养24h，转速：180rpm。

8.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂还包括载体。

9.如权利要求8所述的微生物菌剂，其特征在于，所述载体为固体载体或液体载体。

10.如权利要求8所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的剂型为液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

11.权利要求1所述苏云金芽孢杆菌TA-201和/或权利要求2-10任一项所述微生物菌剂在如下1)-3)中全部或部分中的应用：

1)产蛋白酶；

2)产铁载体；

3)促进生姜生长。

12.权利要求11所述应用，其特征在于，促进生姜生长包括：

改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，提高植株生物量，增加生姜茎叶干湿重中的一种或多种。

13.一种促进生姜生长的方法，其特征在于，所述方法包括在生姜定苗后，向生姜植株根际土壤中施用权利要求1所述苏云金芽孢杆菌TA-201和/或权利要求2-10任一项所述微生物菌剂。

14.如权利要求13所述的促进生姜生长的方法，其特征在于，所述施用方式包括喷施和灌注。