CN110577911B

CN110577911B - 一株短小芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110577911B
Application number: CN201910877938.4A
Authority: CN
Inventors: 丁延芹; 杜秉海; 汪城墙; 王文团; 姚良同; 刘凯
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2039-09-17
Also published as: CN110577911A

Abstract

本发明提供一株短小芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。该菌株已于2019年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.18363。其具有产生蛋白酶、产铁载体、溶磷等功能，在盆栽条件下，本发明的短小芽孢杆菌发酵液在小麦定苗后灌根处理，能明显增强土壤盐碱环境下小麦的根系活力促进小麦植株的生长，株高、地上部分生物量、根系部分的生物量、根系发育以及叶绿素含量，改善小麦幼苗的生长状况，对土壤盐碱环境下生长的小麦有良好的促生效果，本发明筛选获得的短小芽孢杆菌生长速度快且具有良好的耐盐碱能力，能够在盐碱土壤中发挥有益作用，具有良好的实际应用之价值。

Description

一株短小芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株短小芽孢杆菌及其应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

影响农作物正常生长的盐碱地一般是指盐分含量大于0.3％、pH值大于8的土壤生态环境，这样的土壤环境几乎都具有有机质含量低、全氮量低下碱解氮更低、有效磷含量极低、有效水分含量低下、土壤团粒结构差、土壤通透性下降、微生物菌群的活动受到抑制、土壤地温春秋偏低夏季偏高等特性，不仅妨碍了农作物对水肥的吸收，降低了土壤对水、肥、气、热的供应和协调能力，而且限制了土壤肥力的进一步提高和潜在肥力的发挥。

随着人口数量的增加，可使用的耕地面积减少，目前国家高度重视盐碱地的开发与利用。植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR)是指植物根际的一类可促进植物生长、防治病害、增加作物产量的有益菌类。研究表明，通过将PGPR与耐盐碱植物相结合的方法治理盐碱地初见成效，该方法起效快、可持续、成本低、无污染、极具潜力。通过微生物菌剂的使用可缓解土壤pH值、含盐量等对植物的不利影响，促进根系发育，使植物茁壮成长。在盐碱等逆境胁迫下，PGPR还能表现出一定的降盐、降碱的特性，促进盐碱胁迫下的植物生长主要表现在，种子发芽率和存活率提高、生物量增加、根系发达、抗逆性增强使土壤中Na⁺和Cl^-浓度降低而其它营养离子浓度升高。

植物根际促生菌PGPR刺激植物生长的机制涉及源自遗传过程的营养物的可用性，例如生物固氮和磷酸盐降解或者是通过调节ACC脱氨酶的表达来减轻植物生长抑制，以及产生植物激素和铁载体等。其促生机制一般是通过增加生物固氮、磷的溶解、解钾、合成植物激素、铁载体生成以及生物防治等作用。

目前，关于促生菌的报道很多，但是关于耐盐碱并同时具有多种促生功能的芽孢杆菌鲜有报道。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一株短小芽孢杆菌及其应用，经试验证明，本发明提供的短小芽孢杆菌能够改善小麦在盐碱环境下的生长状况，增强小麦对盐碱环境的适应性，为小麦促生提供了新的微生物种质资源。

为实现上述发明目的，本发明公开以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6，该菌株已于2019年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.18363。

所述短小芽孢杆菌35W6的发酵产物也属于本发明的保护范围。

所述短小芽孢杆菌35W6的发酵产物是将所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6接种于液体发酵培养基中进行发酵培养得到的；

其中，所述液体发酵培养基优选为LB培养基；

发酵培养条件具体为：在30～40℃(优选为37℃)培养20～30h(优选为24h)，转速：180-200rpm。

本发明的第二个方面，提供一种微生物菌剂，其含有所述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)35W6和/或含短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6的发酵产物。

本发明的第三个方面，上述短小芽孢杆菌35W6和/或微生物菌剂在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

1)产蛋白酶；

2)解磷；

3)产铁载体；

4)促进植物生长；所述促进植物生长具体在盐碱胁迫条件下进行。

本发明的第四个方面，提供一种促进小麦生长的方法，所述方法包括在小麦定苗后，向小麦植株根际土壤中施用上述短小芽孢杆菌35W6和/或微生物菌剂。

与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：

(1)本发明的短小芽孢杆菌35W6具有在土壤中能产生蛋白酶、铁载体并且能够降解土壤中难溶性磷等能力，能够改善小麦幼苗的生长状况，对土壤盐碱环境下生长的小麦有良好的促生效果。

(2)本发明筛选的短小芽孢杆菌在盆栽条件下对小麦的促生效果的研究，所采用的试验方法更贴近实际应用状态，通过直接以盐碱土壤种植小麦为试验样品，接近于小麦的农业种植方式，有力地证明了在盐碱地生产种植中对小麦显著的促生效果。

(3)本发明检测了采用本发明短小芽孢杆菌制备的发酵液的盆栽小麦株高、地上部分生物量、根系部分的生物量、根系发育以及叶绿素含量，证明了本菌株能够显著改善小麦在盐碱环境下的生长状况，增强小麦对盐碱环境的适应性，为小麦促生提供了新的微生物资源，丰富了植物促生功能的菌种资源。

综上，本发明筛选获得的短小芽孢杆菌生长速度快且具有良好的耐盐碱能力，能够在盐碱土壤中发挥有益作用，具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中短小芽孢杆菌的镜检图。

图2为本发明实施例1中短小芽孢杆菌的平板菌落图。

图3为本发明实施例3中短小芽孢杆菌解蛋白能力图。

图4为本发明实施例3中短小芽孢杆菌的降解有机磷效果图。

图5为本发明实施例3中短小芽孢杆菌产铁载体能力图。

图6为本发明实施例2中盆栽实验根系扫描对比图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一个具体实施方式中，提供一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6，该菌株已于2019年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.18363。

在本发明中，通过测定该菌株的16S rDNA基因序列(见SEQ ID NO.1)并通过形态特征及生理生化指标测定，最终确定该菌株属于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6的培养方法，具体为：将活化后的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6置于LB液体培养基中培养，培养条件为37℃下有氧培养24h，如摇床振荡(180rpm)培养。表面不规则隆起，湿润，呈乳白色，边缘干燥；菌体形态呈杆状，革兰氏阳性，有芽孢。

所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6的生理生化特征为：接触酶阳性，V-P实验阴性，D-葡萄糖阳性，L-阿拉伯糖阳性，D-甘露醇阳性，水解淀粉酶阳性，柠檬酸盐利用阳性。

其中，所述LB培养基配方为(质量百分比)：酵母粉，0.5％；蛋白胨，1％；氯化钠，1％；蒸馏水；琼脂，1.6％；pH7.0；所述蒸馏水在121℃灭菌20min，pH7.0。

上述短小芽孢杆菌35W6的培养方法获得的发酵产物也属于本发明的保护范围。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，其含有所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6和/或含短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6的发酵产物。

本发明的又一具体实施方式中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。

本发明的又一具体实施方式中，所述固体载体为矿物材料、生物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、草炭土和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。

本发明的又一具体实施方式中，所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。

本发明的又一具体实施方式中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

本发明的又一具体实施方式中，上述短小芽孢杆菌35W6和/或微生物菌剂在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

1)产蛋白酶；

2)解磷；

3)产铁载体；

本发明的又一具体实施方式中，所述植物优选为小麦，所述促进小麦生长包括但不限于：

提高小麦株高、提高小麦地上部分生物量、提高小麦根系部分的生物量、促进小麦根系发育和提高小麦叶绿素含量中的一种或多种。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种促进小麦生长的方法，所述方法包括在小麦定苗后，向小麦植株根际土壤中施用上述短小芽孢杆菌35W6和/或微生物菌剂。所述施用方式包括但不限于喷施、灌注；小麦生长环境为盐碱环境。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。其中，实施例2中盐碱土壤取自滨州市无棣县，土壤pH大于8.6，呈碱性。

实施例1：菌株鉴定

本发明通过对筛选获得的一株具有耐盐碱同时具有促小麦生长的菌株，经16SrDNA以及生理生化指标鉴定，确定该菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。如图1-2所示，所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6的菌落及菌体特征为：在LB培养基上培养24h后菌落呈圆形，表面不规则隆起，湿润，呈乳白色，边缘干燥；菌体形态呈杆状，革兰氏阳性，有芽孢。该菌株的生理生化特征为：接触酶阳性，V-P实验阴性，D-葡萄糖阳性，L-阿拉伯糖阳性，D-甘露醇阳性，水解淀粉酶阳性，柠檬酸盐利用阳性。

所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6的16S rDNA序列如下：

TGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCATAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGG(SEQ IDNo.1)。

实施例2：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6盐碱环境下的促生试验

发酵液的制备：将将斜面保存的短小芽孢杆菌35W6菌种转接到装有LB液体培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12h，温度：37℃，转速：180rpm；将活化好的菌液按1％接种量接入到LB液体培养基中，放入摇床培养24h，温度：37℃，转速：180rpm，制成发酵液。

将小麦幼苗移栽盐碱土壤中，在小麦定苗后取1ml发酵液稀释，然后以盆栽中每株小麦1ml稀释后发酵液(稀释倍数为20倍)的用量进行灌根处理(CK组为取1ml灭菌LB液体培养基稀释到20ml后进行灌根处理)。在培养28d和40d后测量对小麦的促生效果，结果如表1-3以及图6所示。可以看出：35W6能够显著促进小麦植株的生长，20d和40d的小麦植株根系干重分别增长：36.36％和100％；根系鲜重分别增长：13.54％和280％；地上部分株高分别增加15.50％和14.76％。同时较对照组相比：叶绿素a含量增加了66.13％；叶绿素b含量增加了42.98％；类胡萝卜素含量增加了83.77％。可以看出，在盆栽条件下，用本发明短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6的发酵液在盐碱土壤条件下对小麦生长初期灌根处理后，能够对小麦产生很好的促生效果，小麦株高、根系干湿重、叶绿素含量较对照组均有很大的增加，达到了显著或极显著差异。

表1施菌20d促生效果

表2施菌40d促生效果

表3小麦叶片叶绿素含量检测结果

实施例3：菌株35W6产蛋白酶、解磷、产铁载体以及耐盐碱试验

检测短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)35W6产蛋白酶、解磷、产铁载体以及耐盐碱能力，结果如表4-9以及图3-5所示。

表4产蛋白酶检测结果

表5解磷能力检测结果

表6菌株产铁载体能力检测结果

表7菌株耐盐能力检测结果

表8菌株耐碱能力检测结果

表9菌株耐盐碱能力检测结果

注：表7-9中“+++”表示生长旺盛；“++”表示生长较好；“+”表示生长；“*”表示微量生长；“-”表示不生长。

综上，可以看出，本发明得短小芽孢杆菌能产生蛋白酶、铁载体、溶磷等功能，在盆栽条件下，用本发明的短小芽孢杆菌的发酵液在小麦定苗后灌根处理，能增强土壤盐碱环境下小麦的根系活力促进小麦的植株的生长，株高、地上部分生物量、根系部分的生物量、根系发育以及叶绿素含量，能够改善小麦幼苗的生长状况，对土壤盐碱环境下生长的小麦有良好的促生效果，有力地证明了在盐碱地生产种植中对小麦非常明显的促生效果。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一株短小芽孢杆菌及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1426

<212> DNA

<213> 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）35W6 16S rDNA

<400> 1

tgcaagtcga gcggacagaa gggagcttgc tcccggatgt tagcggcgga cgggtgagta 60

acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccggag ctaataccgg 120

atagttcctt gaaccgcatg gttcaaggat gaaagacggt ttcggctgtc acttacagat 180

ggacccgcgg cgcattagct agttggtggg gtaatggctc accaaggcga cgatgcgtag 240

ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300

ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360

gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc gagagtaact 420

gctcgcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540

ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggaa 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720

cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780

gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac 960

cctagagata gggctttccc ttcggggaca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080

cagcatttag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200

aaagggctgc gagaccgcaa ggtttagcca atcccataaa tctgttctca gttcggatcg 1260

cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgcaacac 1380

ccgaagtcgg tgaggtaacc tttatggagc cagccgccga aggtgg 1426

Claims

1.一株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）35W6，该菌株已于2019年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.18363。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）35W6和/或含短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）35W6的发酵液。

3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述短小芽孢杆菌35W6的发酵液是将所述短小芽孢杆菌35W6接种于液体发酵培养基中进行发酵培养得到的。

4.如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述液体发酵培养基为LB培养基。

5.如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，发酵培养条件具体为：在30~40℃培养20~30h，转速：180-200rpm。

6.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，发酵培养条件具体为：在37℃培养20~30h。

7.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，发酵培养条件具体为：在30~40℃培养24h。

8.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，发酵培养条件具体为：在37℃培养24h。

9.如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂还包括载体。

10.如权利要求9所述的微生物菌剂，其特征在于，所述载体为固体载体或液体载体。

11.如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的剂型为液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

12.权利要求1所述短小芽孢杆菌35W6和/或权利要求2-7任一项所述微生物菌剂在如下1)-4)中全部或部分中的应用：

1）产蛋白酶；

2）解磷；

3）产铁载体；

4）促进植物在盐碱胁迫条件下进行生长，所述植物为小麦。

13.权利要求12所述应用，其特征在于，促进小麦生长包括：

14.一种促进小麦生长的方法，其特征在于，所述方法包括在小麦定苗后，向小麦植株根际土壤中施用权利要求1所述短小芽孢杆菌35W6和/或权利要求2-11任一项所述微生物菌剂；

小麦生长环境为盐碱环境。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述施用方式包括喷施和灌注。