CN116676238B - 一种番茄青枯病高效生防复合菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番茄青枯病高效生防复合菌剂，其由链霉菌NJAU‑J78和链霉菌NJAU‑J82组成。本发明还公开了其研制的复合微生物液体肥料。本发明番茄青枯病高效生防复合菌剂，其单独施用和其研制的复合微生物液体肥料施用，均能有效促进番茄生长，同时消减土壤中的病原菌或在病原菌入侵后，有效防控番茄青枯病的发生，为番茄青枯病的生物防治措施提供复合菌资源及技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种番茄青枯病高效生防复合菌剂及其研制的复合微生物液体肥料与应用。
背景技术
蔬菜生产中，长期过量施用化肥会导致土壤板结、酸化、有机质含量降低和土壤生物群落退化等一系列问题，进而影响蔬菜品质，加剧连作障碍，制约土壤可持续生产的能力。因此，如何通过研发新型肥料部分替代化肥成为农业资源与环境领域的研究热点和难点。番茄是一种重要的经济作物，但其极易受青枯病危害，进而造成严重经济损失。青枯病是一种由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的土传植物病害，因其具有分布范围广，传染速度快，造成危害严重等特点，已引起全世界科学家的广泛关注。目前防控番茄青枯病的方法主要有施用农药等化学防治措施以及生物防治措施。其中，化学防治的防治成本较高，防控难度较大，易造成环境污染，且在一定程度上能促使病原菌抗性增强。生物防治具有稳定、环保且靶向性较强等优点，近年来备受研究人员关注。生物防治主要是利用能够在植株根际有效定殖，对植物生长有直接或间接促进作用，且能在一定程度上防控病害的益生菌，即植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）抑制土壤和植物根际的病原菌。PGPR可以通过在植物根际与病原微生物竞争生态位，或者通过分泌抗生物质抑制病原菌生长繁殖，达到对土传病害的抑制效果。目前应用较为普遍的PGPR菌株为芽孢杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属等微生物，然而，单一菌株不具备稳定调控效果，合成微生物生态系统（简称合成菌群或复合菌群）是由多个分类地位和功能相对明确的微生物种群组装而成，是继合成生物学的又一热点，利用这一系统可以检验微生物生态基本原理，也可以构建具有不同结构和功能的菌群，因此，设计和应用多功能微生物菌群成为当前根际微生物区系调控的前沿。
此外，近些年我国番茄的工厂化生产方式快速被推广，省工、省时、省力，灌溉与施肥融为一体的水肥一体化技术受到生产者的普遍欢迎，对新型液体肥料的需求越来越大。因此，开发一种能够防治番茄青枯病、提高土壤养分利用率、方便生产者使用的液体微生物肥料迫在眉睫。
发明内容
本发明提供一种番茄青枯病高效生防复合菌剂及其研制的复合微生物液体肥料与应用，目的是针对番茄青枯病，筛选新的高效生防复合菌剂，并创制含复合菌剂的复合微生物液体肥料，为番茄青枯病的生物防治措施提供复合菌资源、新型液体生物水溶肥产品及技术支撑，以解决现有技术的不足。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种番茄青枯病高效生防复合菌剂，其由链霉菌NJAU-J78和链霉菌NJAU-J82组成；其中，所述链霉菌NJAU-J78保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC NO.24371；所述链霉菌NJAU-J82保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC NO.24372。
进一步地，其由如下制备方式得到：将链霉菌NJAU-J78和链霉菌NJAU-J82液体发酵后，用无菌水调OD值，使各菌悬液的浓度都在5×106CFU/ml以上，然后按照体积比1:1混匀，得到所述番茄青枯病高效生防复合菌剂。
更进一步地，其由如下制备方式得到：将链霉菌NJAU-J78和链霉菌NJAU-J82分别接种于NA液体培养基中，30℃、170rpm培养3d，待培养结束后，用无菌水调OD值，使各菌悬液的浓度都在5×106CFU/ml以上，然后按照体积比1:1混匀，得到所述番茄青枯病高效生防复合菌剂。
本发明第二方面提供了一种复合微生物液体肥料，所述复合微生物液体肥料是于液体肥料中添加番茄青枯病高效生防复合菌剂得到，所述番茄青枯病高效生防复合菌剂是由链霉菌NJAU-J78和链霉菌NJAU-J82组成；其中，所述链霉菌NJAU-J78保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年1月24日，保藏编号为CGMCCNO.24371；所述链霉菌NJAU-J82保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC NO.24372。
进一步地，所述复合微生物液体肥料是于10%W/V尿素、5%W/V磷酸二氢钾、10%W/V黄腐酸和20%V/V氨基酸，pH为5.5的液体肥料中添加20%V/V番茄青枯病高效生防复合菌剂得到，其中，所述番茄青枯病高效生防复合菌剂是将链霉菌NJAU-J78和链霉菌NJAU-J82液体发酵后，用无菌水调OD值，使各菌悬液的浓度都在8×107CFU/ml以上，然后按照体积比1:1混匀得到。
更进一步地，所述番茄青枯病高效生防复合菌剂是将链霉菌NJAU-J78和链霉菌NJAU-J82分别接种于NA液体培养基中，30℃、170rpm培养3d，待培养结束后，用无菌水调OD值，使各菌悬液的浓度都在8×107CFU/ml以上，然后按照体积比1:1混匀得到。
本发明第三方面提供了上述番茄青枯病高效生防复合菌剂在生物防治番茄青枯病、促进番茄生长中的应用。
进一步地，应用时于番茄根际灌施所述番茄青枯病高效生防复合菌剂。
本发明第四方面提供了上述复合微生物液体肥料在生物防治番茄青枯病、促进番茄生长中的应用。
进一步地，所述复合微生物液体肥料稀释后采取灌根施肥方式。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种番茄青枯病高效生防复合菌剂，其由2种拮抗茄科劳尔氏菌单菌组成，分别为链霉菌NJAU-J78和NJAU-J82，能够有效抑制茄科劳尔氏菌的生长。在设施番茄生长中使用该复合菌剂，有效促进了设施番茄的生长，同时消减土壤中的病原菌-茄科劳尔氏菌，从而提高生产效益和生态环境效益。
将筛选出的复合菌剂研制成复合微生物液体肥料，进行番茄盆栽试验，添加复合微生物液体肥料的处理有效促进了苗期番茄的生长，且在病原菌-茄科劳尔氏菌入侵后，有效防控了番茄青枯病的发生。
本发明利用对茄科劳尔氏菌具有拮抗能力的有益微生物组合成复合菌群，对番茄青枯病进行生物防治。复合菌群由链霉菌NJAU-J78和NJAU-J82组合而成，其单独施用和其研制成复合微生物液体肥料施用，均能有效促进番茄生长，同时消减土壤中的病原菌或在病原菌入侵后，有效防控番茄青枯病的发生，为番茄青枯病的生物防治措施提供复合菌资源及技术支撑。
附图说明
图1为单菌及复合菌群拮抗茄科劳尔氏菌效果（平板试验）。
图2为单菌及复合菌群拮抗茄科劳尔氏菌效果（摇瓶试验）。
图3为单菌和复合菌群菌悬液田间试验效果（茎粗）。
图4为单菌和复合菌群菌悬液田间试验效果（株高）。
图5为单菌和复合菌群菌悬液田间试验效果（地上部鲜重）。
图6为单菌和复合菌群菌悬液田间试验效果（地上部干重）。
图7为单菌和复合菌群菌悬液田间试验效果（地下部鲜重）。
图8为单菌和复合菌群菌悬液田间试验效果（地下部干重）。
图9为单菌和复合菌群菌悬液田间试验效果（病原菌数量）。
图10为含复合菌群的复合微生物液体肥料货架期试验效果。
图11为灌施含复合菌群的复合微生物液体肥料盆栽试验效果（株高）。
图12为灌施含复合菌群的复合微生物液体肥料盆栽试验效果（茎粗）。
图13为灌施含复合菌群的复合微生物液体肥料盆栽试验效果（SPAD值）。
图14为灌施含复合菌群的复合微生物液体肥料盆栽试验效果（鲜重）。
图15为灌施含复合菌群的复合微生物液体肥料盆栽试验效果（干重）。
图16为灌施含复合菌群的复合微生物液体肥料盆栽试验效果（萎蔫系数-处理）。
图17为灌施含复合菌群的复合微生物液体肥料盆栽试验效果（萎蔫系数-发病时间）。
图18为菌株NJAU-J78鉴定结果。
图19为菌株NJAU-J82鉴定结果。
生物材料保藏信息
链霉菌NJAU-J78，分类命名为Streptomyces sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC NO.24371。
链霉菌NJAU-J82，分类命名为Streptomyces sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC NO.24372。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1 功能菌株的分离与筛选
选取番茄青枯病发病田块中健康番茄植株，无菌操作采集其根际土，将根际土用无菌水进行梯度稀释，均匀涂布于1/5NA平板培养基中，并均匀喷洒茄科劳尔氏菌，进行拮抗试验。培养结束后挑取具有明显拮抗效果菌株进行纯化分离，并多次检验其对茄科劳尔氏菌的拮抗效果，直至筛选出较为稳定且互不拮抗的5株细菌（NJAU-J17、NJAU-J18、NJAU-J78、NJAU-J82和NJAU-J84），其中4株细菌（NJAU-J17、NJAU-J18、NJAU-J78、NJAU-J82）与链霉菌属细菌同源性最高，鉴定为链霉菌属细菌；另1株细菌（NJAU-J84）和微杆菌属细菌同源性最高，鉴定为微杆菌属细菌。
实施例2 单菌和复合菌组合
将实施例1筛选的所有菌株分别接种于NA液体培养基中，在30℃、170rpm下培养3d。待培养结束后，用无菌水调OD值使各菌悬液的浓度都在106CFU/ml，按照随机组合方式设计1株菌、2株菌、3株菌、4株菌、5株菌的组合，复合菌由各菌等体积混合，总浓度为106CFU/ml。
实施例3 单菌和复合菌拮抗茄科劳尔氏菌的能力
将实施例2的单菌和复合菌群菌悬液分别接种于NA平板培养基上，分散且均匀接种三个重复，每个重复接种5μL菌悬液，待自然风干后，置于30℃静置培养。24h后取出，用无菌喷壶将稀释浓度为5×106CFU/mL左右的茄科劳尔氏菌菌悬液均匀地喷洒2ml在接有单菌或复合菌群处理的NA平板培养基上，30℃静置培养，每12h取出检查，待出现有明显拮抗圈时使用刻度直尺进行拮抗圈直径的量取，并计算拮抗强度。
如图1所示，不同的单菌及复合菌群在固体培养基上对茄科劳尔氏菌拮抗能力具有显著性差异，菌株NJAU-J78和NJAU-J82的单菌处理以及含有菌株NJAU-J78、NJAU-J82的复合菌群（复合菌群NJAU-J82+NJAU-J84、NJAU-J78+NJAU-J82和NJAU-J78+NJAU-J82+NJAU-J84），抑制茄科劳尔氏菌能力较强。虽然菌株NJAU-J84的单菌处理未表现出明显拮抗茄科劳尔氏菌的能力（NJAU-J84因为没有明显的拮抗能力，未能获得相应数据，所以无法展示在图1中），但是含菌株NJAU-J84的复合菌群NJAU-J82+NJAU-J84的拮抗茄科劳尔氏菌的能力要优于相应单菌处理。
按照1%(V/V)接种量，向液体NA培养基中分别接种实施例2的单菌和复合菌群菌悬液，置于30℃，170rpm震荡培养72h后，按照1%(V/V)接种量，摇瓶中接入稀释至5×106CFU/mL左右的茄科劳尔氏菌菌悬液，继续培养48h。培养结束后，使用无菌水将菌悬液进行梯度稀释，涂布于SMSA固体培养基统计病原菌数量。
如图2所示，与CK（清水处理）相比，复合菌群在液体培养过程中对茄科劳尔氏菌拮抗能力具有显著性差异，含有菌株NJAU-J17、菌株NJAU-J18的复合菌群（NJAU-J18+NJAU-J78、NJAU-J17+NJAU-J18+NJAU-J78+NJAU-J82+NJAU-J84、NJAU-J17+NJAU-J82+NJAU-J84和NJAU-J17+NJAU-J18），抑制茄科劳尔氏菌能力比较强；同时，含有菌株NJAU-J84的复合菌群（NJAU-J17+NJAU-J82+NJAU-J84和NJAU-J17+NJAU-J18+NJAU-J82+NJAU-J84）表现出比原有组合（NJAU-J17+NJAU-J82和NJAU-J17+NJAU-J18+NJAU-J82）更为强的抑制茄科劳尔氏菌能力。此外，单菌培养处理的抑菌能力较弱。
实施例4 单菌和复合菌群菌悬液田间试验效果
结合实施例3两项试验结果，选出优势菌群，应用于青枯病轻微发病（零星发病）田块的田间试验，评估灌施不同复合菌群（NJAU-J78+NJAU-J82+NJAU-J84、NJAU-J82+NJAU-J84、NJAU-J78+NJAU-J84、NJAU-J78+NJAU-J82、NJAU-J17+NJAU-J18+NJAU-J78、NJAU-J17+NJAU-J18、NJAU-J17+NJAU-J78和NJAU-J18+NJAU-J78）菌悬液对设施番茄生长和根际中茄科劳尔氏菌数量的影响。每个处理设3次重复，随机区组布置。小区面积5m2左右。腐熟鸡粪有机肥作为基肥亩施540kg。在番茄定植第30d时开始向番茄植株根际灌施20mL含菌量≥5×106CFU/mL单菌或复合菌群菌悬液（各菌株分别接种于NA液体培养基中，在30℃、170rpm下培养3d；待培养结束后，用无菌水调OD值使各菌悬液浓度在≥5×106CFU/ml，复合菌由各菌等体积混合），此后每14d灌施一次，在整个生育期共灌施三次。于定植80d后进行果实采摘，90d后进行番茄植株生物量（株高、茎粗、地上部的鲜重和干重、地下部的鲜重和干重）以及根际土壤中茄科劳尔氏菌含量测定。
如图3-9所示，进一步通过灌施单菌和复合菌群菌悬液的田间试验，评估了筛选出的复合菌群在田间的促生以及抑病效果。研究结果表明，在植物促生效果方面，相较于CK（灌施清水）及灌施单菌菌悬液处理，灌施复合菌群菌悬液处理显著提高了番茄植株株高、地上部重量和地下部重量，灌施两株菌复合菌群（如NJAU-J78+NJAU-J82）菌悬液处理相比于CK效果较优，且差异显著，而灌施单菌菌悬液处理与CK之间没有显著差异。在对根际病原菌抑制效果方面，灌施复合菌群NJAU-J78+NJAU-J82菌悬液处理的根际中茄科劳尔氏菌数显著低于其他处理。
实施案例5 复合菌群在复合微生物液体肥料中的应用
为研制含复合菌群的复合微生物液体肥料，本实施例将田间试验筛选得到的优势复合菌群中的菌株NJAU-J78和NJAU-J82分别进行液体发酵（接种于NA液体培养基中，在30℃、170rpm下培养3d），用无菌水调OD值，体积比1:1混匀后使复合菌群菌悬液的总浓度≥8×107CFU/ml，将复合菌群菌悬液按照20%(V/V)添加量加入到配方为10%（W/V）尿素、5%（W/V）磷酸二氢钾、10%（W/V）黄腐酸和20%（V/V）氨基酸（所述氨基酸以废弃动物羽毛下脚料为原料，添加硫酸酸解制取的动物源氨基酸，游离氨基酸含量≥10%），pH为5.5的液体肥料中，形成复合微生物液体肥料，并进行为期三个月的货架期试验：将配置好的复合微生物液体肥料放置于50ml离心管中，在存放第15d、35d、90d，采用NA固体培养基平板涂布方式对复合微生物液体肥料中的有效活菌数进行测定。
如图10所示，货架期试验结果表明，储存3个月后，复合微生物液体肥料功能菌活菌数为5.96×107CFU/mL，高于5×107CFU/mL，符合中华人民共和国农业行业标准（NYT798-2015）。
实施案例6 复合微生物液体肥料盆栽效果验证
盆栽试验设置3个处理，分别为：CK：灌施清水；SR：灌施不含功能微生物的液体肥料（10%（W/V）尿素、5%（W/V）磷酸二氢钾、10%（W/V）黄腐酸和20%（V/V）氨基酸，pH为5.5）；SR1：灌施含20%(V/V)复合菌群（NJAU-J78+NJAU-J82，菌株NJAU-J78和NJAU-J82分别进行液体发酵（接种于NA液体培养基中，在30℃、170rpm下培养3d），用无菌水调OD值，体积比1:1混匀后使复合菌群菌悬液的总浓度≥8×107CFU/ml）的复合微生物液体肥料（10%（W/V）尿素、5%（W/V）磷酸二氢钾、10%（W/V）黄腐酸和20%（V/V）氨基酸，pH为5.5）。盆栽试验所用土壤是草地土（自然条件下未种植农作物撂荒土）和基质（由泥炭+椰糠+珍珠岩构成主要成分，全氮磷钾总量：3-5%）按体积比1:1混合后高温灭菌所得，盆栽试验无需施基肥。
每个处理21个重复，采取灌根施肥方式，于番茄苗长至两叶一心后，在每棵番茄根部灌施20mL稀释500倍的相应液体肥料，每6d灌施一次，共施用3次。种植25d后（即两叶一心25d后）测定番茄植株的株高、茎粗、SPAD值以及植株鲜重和干重。
将含菌量≥3×108CFU/mL的茄科劳尔氏菌菌悬液稀释100倍后，向剩余番茄植株根际灌施，每棵番茄植株20mL，随后保持高温高湿状态（温度不低于35℃，持续保持土壤湿润），待植株发病后，每日同一时间统计发病程度和发病率，以数字1-4划分感病程度（1代表轻微发病，2代表少量叶片发病，3代表多数叶片发病，4代表全株萎蔫），并代表每棵植株进行统计。
如图11-15所示，与CK（灌施清水）和SR（灌施不含功能微生物的液体肥料）相比，SR1（灌施含复合菌群的复合微生物液体肥料）处理具有明显的促生效果，其中，SR1处理中番茄植株株高显著高于CK（p<0.05），增加了44.6%，番茄植株干重显著高于CK（p<0.05），增加了129.4%，茎粗、SPAD值和植株鲜重也有所提高。此外，如图16-17所示，SR1（灌施含复合菌群的复合微生物液体肥料）处理与CK（灌施清水）和SR（灌施不含功能微生物的液体肥料）相比，显著降低了番茄青枯病发病率。
实施例7 菌株NJAU-J78和NJAU-82的系统发育鉴定
通过形态学鉴定结果发现：菌株NJAU-J78菌落着生于固体培养基表面，呈淡黄色，表面生成有环形凸起，环内有条形凸起，较干燥，易整片剥落，没有明显气生菌丝；菌株NJAU-J82菌落着生于固体培养基表面，呈淡黄色，表面稍显球状凸起，较干燥，易整片剥落，没有明显气生菌丝。
通过对菌株NJAU-J78和NJAU-J82的16s rRNA基因序列与相近序列进行比对，并构建发育树。结果如图18和19所示，菌株NJAU-J78和NJAU-J82均与链霉菌同源性较高。菌株NJAU-J78和NJAU-J82均已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO.24371、CGMCC NO.24372。
Claims (8)
1.一种番茄青枯病高效生防复合菌剂，其特征在于，其由链霉菌（Streptomyces sp.）NJAU-J78和链霉菌（Streptomyces sp.）NJAU-J82组成；其中，所述链霉菌NJAU-J78保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC NO.24371；所述链霉菌NJAU-J82保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC NO.24372；
其由如下制备方式得到：将链霉菌NJAU-J78和链霉菌NJAU-J82分别液体发酵后，用无菌水调OD值，使各菌悬液的浓度都在5×106CFU/ml以上，然后按照体积比1:1混匀，得到所述番茄青枯病高效生防复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的番茄青枯病高效生防复合菌剂，其特征在于，其由如下制备方式得到：将链霉菌NJAU-J78和链霉菌NJAU-J82分别接种于NA液体培养基中，30℃、170rpm培养3d，待培养结束后，用无菌水调OD值，使各菌悬液的浓度都在5×106CFU/ml以上，然后按照体积比1:1混匀，得到所述番茄青枯病高效生防复合菌剂。
3.一种复合微生物液体肥料，其特征在于，所述复合微生物液体肥料是于10%W/V尿素、5%W/V磷酸二氢钾、10%W/V黄腐酸和20%V/V氨基酸，pH为5.5的液体肥料中添加20%V/V的番茄青枯病高效生防复合菌剂得到，所述番茄青枯病高效生防复合菌剂是由链霉菌（Streptomyces sp.）NJAU-J78和链霉菌（Streptomyces sp.）NJAU-J82组成；其中，所述链霉菌NJAU-J78保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC NO.24371；所述链霉菌NJAU-J82保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年1月24日，保藏编号为CGMCC NO.24372；所述番茄青枯病高效生防复合菌剂是将链霉菌NJAU-J78和链霉菌NJAU-J82分别液体发酵后，用无菌水调OD值，使各菌悬液的浓度都在8×107CFU/ml以上，然后按照体积比1:1混匀得到。
4.根据权利要求3所述的一种复合微生物液体肥料，其特征在于，所述番茄青枯病高效生防复合菌剂是将链霉菌NJAU-J78和链霉菌NJAU-J82分别接种于NA液体培养基中，30℃、170rpm培养3d，待培养结束后，用无菌水调OD值，使各菌悬液的浓度都在8×107CFU/ml以上，然后按照体积比1:1混匀得到。
5.权利要求1-2任一权利要求所述的番茄青枯病高效生防复合菌剂在生物防治番茄青枯病、促进番茄生长中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，应用时于番茄根际灌施所述番茄青枯病高效生防复合菌剂。
7.权利要求3-4任一权利要求所述的复合微生物液体肥料在生物防治番茄青枯病、促进番茄生长中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述复合微生物液体肥料稀释后采取灌根施肥方式。
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