CN110240528A - 一种微生物有机肥料及其应用 - Google Patents

一种微生物有机肥料及其应用 Download PDF

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CN110240528A CN201910680210.2A CN201910680210A CN110240528A CN 110240528 A CN110240528 A CN 110240528A CN 201910680210 A CN201910680210 A CN 201910680210A CN 110240528 A CN110240528 A CN 110240528A
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罗超越
张春红
王友玲
关小敏
马兴
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    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
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Abstract

本发明公开一种微生物有机肥料，包括如下步骤制备得到：将保藏号为CGMCC No.13639的萎缩芽孢杆菌QHZ‑3接种到LB培养液中液体发酵，发酵获得的QHZ‑3菌液有效活菌数≥1×109CFU/mL；氨基酸有机肥的制备：将动物源氨基酸原液按15ml/100g加入到有机肥中，发酵5d，使其pH为6.5‑6.8；将QHZ‑3菌液按5mL/100g接种至氨基酸有机肥中，进行二次固体发酵，使QHZ‑3有效活菌数≥0.2×109cfu/g，含水量蒸发至30％以下。本发明的微生物有机肥料不仅对马铃薯黑痣病病原菌具有拮抗效果，也可有效促进马铃薯植株的生长并提高块茎产量。

Description

一种微生物有机肥料及其应用
技术领域
本发明涉及微生物肥料技术领域，具体涉及一种微生物有机肥料及其应用。
背景技术
马铃薯是仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物，也是世界公认的全价食品。据FAO数据显示，我国是马铃薯的最大生产国。然而近年来，马铃薯的连续种植以及大量化学肥料的施用，造成病原菌在土壤中大量累积引发土传病害频发，在导致生产成本上升的同时降低了马铃薯的产量和品质。
全球范围内日益加剧的马铃薯土传病害，尤其是由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)侵染引起的马铃薯黑痣病已成为影响马铃薯产量及商品价值的主要病害。在我国马铃薯主产区东北、河北及内蒙等地的发病率不断提高，严重发病地块的植株死亡率高达70％-80％，块茎发病率达到100％。黑痣病已成为限制我国马铃薯产业健康发展的主要土传病害。
由立枯丝核菌引起的马铃薯黑痣病(又称茎溃疡病、茎基腐病、丝核菌溃疡病和黑色粗皮病)是一种真菌性病害，以带病种薯和土壤为主要传播途径。病原菌可多部位侵染危害幼芽、茎基部、匍匐茎和薯块，造成芽腐、根腐、立枯、顶端萎蔫或叶片卷曲等症状，成熟时在薯块上形成黑痣，严重影响其商品性以及种薯质量。
马铃薯黑痣病可通过化学防治、农业防治和生物防治等方法进行。化学防治是目前普遍采用的方法，防治效果较好，但会引发土壤微生物区系遭受破坏等问题，导致抑病型土壤向导病型土壤的退化，又加剧土传病害的发生，而农业防治的防治效果有限。生物防治是利用有益微生物或拮抗微生物对马铃薯黑痣病进行防治，是一种对环境无污染，对人畜无毒，对土壤中有益微生物无影响，对马铃薯无副作用，且立枯丝核菌不易产生抗性，使用成本较低，是很有前景的防治方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物有机肥料及其在促进马铃薯生长和增产，以及在防治马铃薯黑痣病中的应用，以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种微生物有机肥料，包括如下步骤制备得到：
步骤1：将保藏号为CGMCC No.13639的萎缩芽孢杆菌QHZ-3接种到LB培养液中进行液体发酵生产，得到QHZ-3菌液，其发酵生产的条件为：初始pH7.0-7.2，发酵温度25-35℃，转速150-180r/min，发酵获得的QHZ-3菌液有效活菌数≥1×109CFU/mL；
步骤2：氨基酸有机肥的制备：将氨基酸原液按15ml/100g加入到有机肥中，发酵5d，使其pH为6.5-6.8；其中，氨基酸原液中氨基酸为动物蛋白氨基酸，其含量≥100g/L，微量元素：Fe+Mn+Zn+B≥20ng/L；
步骤3：将步骤1得到的QHZ-3菌液按5mL/100g接种至步骤2得到的氨基酸有机肥中，进行二次固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵周期为5-7d，使QHZ-3有效活菌数≥0.2×109cfu/g，在温度不超过60℃的条件下将含水量蒸发至30％以下即获得微生物有机肥料。
进一步地，步骤1中LB培养液配制方法为：以配制1L培养液为例，蒸馏水950ml、蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl 10g混合均匀，再用蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.0-7.2，121℃灭菌30min。
进一步地，步骤2中有机肥为畜禽粪便有机肥，包括鸡粪有机肥、牛粪有机肥、马粪有机肥、羊粪有机肥、猪粪有机肥、兔粪有机肥中的一种或多种。
进一步地，步骤3所制微生物有机肥料的发芽指数为98％以上，有机质含量(以干基计)≥40％，含水量≤30％。
本发明第二方面提供了上述微生物有机肥料在促进马铃薯生长和增产中的应用。
本发明第三方面提供了上述微生物有机肥料在防治马铃薯黑痣病中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明以菌株QHZ-3、动物源氨基酸原液、有机肥制成的微生物有机肥料(BOF)对马铃薯黑痣病病原菌具有拮抗效果，同时可有效促进马铃薯植株生长并提高块茎产量。
2、本发明微生物有机肥料(BOF)可显著提高马铃薯根际的生物活性，土壤中可培养细菌、放线菌的数量、微生物量碳/氮以及脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和过氧化氢酶等土壤酶的活性显著高于等养分量的化肥(CF)和有机肥(OF)处理；BOF也可显著促进马铃薯种薯的萌发及根系的生长，BOF处理的总根长、根表面积、根体积以及根尖数等形态学指标、根系活力以及根系生物量均显著高于CF和OF处理；BOF块茎产量分别比CF和OF增加了22％和28％。以菌株QHZ-3、动物源氨基酸原液、有机肥制成的微生物有机肥料BOF通过增加马铃薯根际土壤中可培养细菌和放线菌的数量，提高土壤的微生物生物量和酶活性，从而提高土壤生物活性，改善了根际的微生态环境，为根系的生长创造了良好条件，促进了根系的生长和吸收能力，进而促进了马铃薯生长，增加块茎产量。
3、本发明微生物有机肥料(BOF)对马铃薯黑痣病病原菌拮抗作用优于单独QHZ-3菌液对马铃薯黑痣病病原菌拮抗作用。微生物有机肥料中菌株QHZ-3、动物源氨基酸原液、有机肥料协同作用提高了对马铃薯黑痣病病原菌拮抗作用。
附图说明
图1为基于菌株QHZ-3的16S rDNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树。
图2为不同处理土壤细菌数量的比较。
图3为不同处理土壤真菌数量的比较。
图4为不同处理土壤放线菌数量的比较。
图5为不同处理对土壤脲酶活性的影响。
图6为不同处理对土壤蔗糖酶活性的影响。
图7为不同处理对土壤磷酸酶活性的影响。
图8为不同处理对土壤过氧化氢酶活性的影响。
生物材料保藏信息
菌株QHZ-3，分类命名为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2017年1月19日，其保藏编号为CGMCC No.13639。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1、功能菌株的分离及鉴定
采集甘肃省白银市白银区黄瓜蔬菜大棚枯萎病发病地块的健康植株根际土和根系。称取根际土和根系共5g，其中根系用无菌剪刀剪成1mm的小段，于无菌环境下将其置于90ml事先装入玻璃珠的无菌水中，28℃，180rpm·min-1摇床培养0.5h，进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6的稀释液0.1mL涂布，28℃恒温培养3d，共分离出195株形态、颜色各异的细菌。对挑选到的细菌进行平板对峙试验(平板对峙试验方法参考文献：乔胜伟.一株黄瓜枯萎病拮抗细菌的分离鉴定及其相关特性的研究[D].南京:南京农业大学，2010.)，筛选到10株效果良好的细菌后将其连续培养10代后进行平板对峙试验，筛选到菌株QHZ-3。
菌株QHZ-3在LB平板培养基上，28±2℃，培养24h，可呈现明显菌落，菌落呈圆形、乳白色、不透明、表面有褶皱、边缘不整齐，3天后菌落成褐色。革兰氏染色呈阳性，为中生芽孢。
菌株QHZ-3生理生化特性的测定如表1所示。
表1
测定指标 试验结果 测定指标 试验结果
葡萄糖 + 产H<sub>2</sub>S +
果糖 + 产吲哚乙酸 +
蔗糖 + 尿素水解 -
淀粉 + 柠檬酸 +
甘油 + 苯丙氨酸 -
V-P试验 + 色氨酸 +
M-R试验 - 酪氨酸 +
淀粉水解 + 接触酶 +
明胶液化 + 硝酸盐还原 +
产氨 + 石蕊牛奶试验 +
菌株QHZ-3的16Sr DNA序列长度为1417bp。在NCBI基因数据库中进行BLAST比对，绘制系统发育树，如图1所示，结果表明：菌株QHZ-3与萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeusstrain NBRC 15539NR 112723.1的亲缘性最高，结合菌株菌落形态及生理生化测定结果，初步确定QHZ-3为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。
将菌株QHZ-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年1月19日，其保藏编号为CGMCC No.13639。
实施例2、功能菌菌液的生产
将菌株QHZ-3活化后接种至LB培养液中进行液体发酵生产，条件为：pH7.0-7.2，发酵温度28±2℃，转速为170r/min，发酵获得QHZ-3菌液，菌液中的有效活菌数≥1.0×109CFU/mL。
所用LB培养液配制LB培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：蒸馏水950ml、蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl 10g混合均匀，再用蒸馏水定容至1000mL，5mol/LNaOH调pH至7.0-7.2，121℃灭菌30min。
实施例3、微生物有机肥料的研制
按有机肥质量的15％(V/m，ml/g)添加动物源氨基酸原液(江阴市联业生物科技有限公司)到有机肥(白银鑫昊生物科技有限公司，牛粪有机肥)中，发酵5d，当其pH值为6.5-6.8时，按5％(V/m，ml/g)将上述制备的QHZ-3菌液接种至氨基酸有机肥中，进行二次固体发酵，发酵温度为40±2℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵7d，使QHZ-3有效活菌数≥0.2×109cfu/g，在温度50℃的条件下将含水量蒸发至25％，获得微生物有机肥料，用于盆栽试验。
实施例4、微生物有机肥料在马铃薯盆栽上的应用效果试验
盆栽试验于2017年5月至2017年10月在甘肃省甘肃农业大学温室内进行。马铃薯的品种为“陇薯10号”，购于甘肃省定西市农业科学院。
试验共设4组，分别为：对照，不施肥(CK)；单施化肥处理(尿素、过磷酸钙、硫酸钾镁按质量1:1:1复合)(CF)；普通有机肥处理(白银鑫昊生物科技有限公司，牛粪有机肥)(OF)；QHZ-3微生物有机肥料处理(实施例3制备)(BOF)，试验共设18盆/组，6株/盆，6.8kg土/盆。
CF(单施化肥)、OF(普通有机肥)、BOF(QHZ-3的微生物有机肥料)的用量为土壤质量的1.5％。处理间采用等养分(N/P/K)设计。
在马铃薯生长的各个生育时期测定不同处理马铃薯根际土壤的可培养微生物数量(图2-图4)，微生物量碳、氮(表2、表3)和酶活性(图5-图8)，同期测定马铃薯植株的根系生长(表4-表7)、形态(表8)、活力(表9)和马铃薯的块茎产量(表10)等。
图2结果显示，在马铃薯生长的苗期，与CK相比，BOF显著增加了土壤可培养细菌的数量，其他处理之间无显著差异，且随着马铃薯生育进程的推进和土壤可培养细菌数量的增加，BOF的可培养细菌数量均显著高于其它处理，处理之间的差异也越来越大，至成熟期达到最大。
图3结果显示出，不同处理对土壤中可培养真菌数量的影响与细菌完全不同。BOF可显著降低土壤中可培养真菌的数量。
图4结果显示，不同处理对土壤可培养放线菌数量的影响同可培养细菌的基本一致。
表2不同处理对土壤微生物量碳的影响(mg·kg-1)
Table 2 Effect of different treatments on microbial biomass carbon insoil(mg·kg-1)
注(Note)：同列数值后不同字母表示差异达5％显著水平
Values followed by different in the same column mean significant at5％level.
表2结果显示，与CK相比，所有处理均显著增加了土壤微生物量碳，说明施肥可以促进微生物的繁殖，从而增加土壤微生物量碳。并且随着马铃薯生育进程的推进和土壤中微生物量碳的增加，不同处理之间的差异逐渐增大趋势，至成熟期达到最大值，与等养分量的CF、OF相比较，BOF的土壤微生物量碳增加了38％、34％。
表3不同处理对土壤微生物量氮的影响(mg·kg-1)
Table 3 Effect of different treatments on microbial biomass nitrogenin soil(mg·kg-1)
注(Note)：同列数值后不同字母表示差异达5％显著水平
Values followed by different in the same column mean significant at5％level.
与土壤的微生物量碳相比，土壤的微生物量氮仅占土壤微生物生物量的很小比例。表3结果显示，不同处理在马铃薯生长的苗期即表现出差异，随着马铃薯生育进程的推进和土壤微生物量氮的增加，不同处理之间的差异逐渐增大趋势，至成熟期达到最大，BOF的效果最为显著，与等养分量的CF、OF相比较，BOF的土壤微生物量氮分别增加了64％、59％。
图5结果显示，不同处理的土壤脲酶活性在马铃薯生长的苗期即表现出显著差异。随着马铃薯生育进程的推进，BOF的土壤脲酶活性均显著高于其它处理。
图6结果显示，不同处理的土壤蔗糖酶活性在马铃薯生长的各时期均表现出显著差异，且与CK相比较，所有处理均显著增加了土壤蔗糖酶活性，说明施肥有助于土壤蔗糖酶活性的增加，且BOF的效果最为显著。
图7结果显示，不同处理的土壤磷酸酶活性在马铃薯生长的苗期即表现出了显著差异，且与CK相比，所有处理均显著增加了土壤磷酸酶的活性，说明施肥有助于土壤磷酸酶活性的增加。随着马铃薯生育进程的推进，BOF的土壤磷酸酶活性均显著高于其它处理。
图8结果显示，在马铃薯生长的各时期，不同处理的土壤过氧化氢酶活性均表现出显著差异，且BOF的效果最为显著。
表4不同处理马铃薯总根长的比较(cm/株)
Table 4 Comparison of total root length of potato with differenttreatents
注(Note)：同列数值后不同字母表示差异达5％显著水平
Values followed by different in the same column mean significant at5％level.
表4结果显示，在马铃薯生长的整个生育期内，除苗期外，BOF处理的马铃薯的总根长显著大于其它处理。
表5不同处理马铃薯根表面积的比较(cm2/株)
Table 5 Comparison of root surface area of potato with differenttreatents
注(Note)：同列数值后不同字母表示差异达5％显著水平
Values followed by different in the same column mean significant at5％level.
表5结果显示，在马铃薯生长的整个生育期内，除苗期外，BOF处理的马铃薯根表面积显著大于其它处理。
表6不同处理马铃薯根体积的比较(cm3/株)
Table 6 Comparison of root volume of potato with different treatents
注(Note)：同列数值后不同字母表示差异达5％显著水平
Values followed by different in the same column mean significant at5％level.
表6结果显示出，在马铃薯生长的整个生育期内，除苗期外，BOF处理的马铃薯根体积均显著高于其他处理。
表7不同处理马铃薯根尖数的比较(个/株)
Table 7 Comparison of apical number of potato with differenttreatents
注(Note)：同列数值后不同字母表示差异达5％显著水平
Values followed by different in the same column mean significant at5％level.
表7结果显示，在马铃薯生长的整个生育期内，BOF处理的马铃薯根尖数均显著高于其他处理。
表8不同处理马铃薯根系生物量的比较(g/株)
Table 8 Comparison of potato root biomass with different treatents
注(Note)：同列数值后不同字母表示差异达5％显著水平
Values followed by different in the same column mean significant at5％level.
表8结果显示，在马铃薯生长的整个生育期内，除苗期外，BOF处理的马铃薯根系生物量均显著高于其他处理。
表9不同处理马铃薯根系活力的比较(μg·g-1·h-1)
Table 9 Comparison of activities of potato with different treatents(μg·g-1·h-1)
注(Note)：同列数值后不同字母表示差异达5％显著水平
Values followed by different in the same column mean significant at5％level.
表9结果显示，在马铃薯生长的整个生育期内，BOF处理的马铃薯根系活力均显著高于其他处理。
表10不同处理马铃薯块茎产量的比较(g/盆)
Table 10 Comparison of yield of potato tuber with different treatents(g/盆)
注(Note)：同列数值后不同字母表示差异达5％显著水平
Values followed by different in the same column mean significant at5％level.
表10结果显示，所有处理与CK相比较，均显著增加了马铃薯的块茎产量。且以BOF效果最显著，与等养分量的CF、OF相比较，BOF的产量增加了22％、28％。
实施例5、微生物有机肥料对马铃薯黑痣病的防治效果试验
平板对峙法
在PDA平板(90mm)中央接入直径为8mm的立枯丝核菌菌饼，并点接已纯化的菌株QHZ-3在距培养基中央2.5cm处的4个点上，以只接病原菌的培养基为对照(CK)，25℃恒温培养。当对照长满整个培养皿，挑选对峙平板中具有明显抑菌圈的菌株，进行复筛。抑菌率＝(CK菌落直径一对峙菌落直径)/CK菌落直径×100％。结果表明，平板对峙法中菌株QHZ-3对马铃薯立枯丝核菌的抑菌率达到58.6％。
盆栽试验设计
供试种薯为马铃薯大西洋原原种，经消毒催芽后，每盆播10颗，培养至两叶一心时，将长势一致的6株马铃薯幼苗定植，装土1公斤/盆，每处理浇水量及浇水时间相同。
试验共设3组，分别为：T1(对照，健康土+病原菌)、T2(处理1，健康土+病原菌+QHZ-3菌液)、T3(处理2，健康土+病原菌+QHZ-3微生物有机肥料)。
T1、T2、T3土壤接种病原菌:将5块直径为8mm的立枯丝核菌菌饼加入90ml无菌水中，制备为菌悬液，以0.5g/kg的量加入土壤中，于定植后第三天均匀拌入灭菌土壤中。
T2土壤加入QHZ-3菌液：将实施例2液体发酵培养至菌液OD值为2时，有效活菌数约为1.0×108CFU/mL，于定植后第三天将菌液按1.5％(V/m，ml/g)加入到土壤中。
T3土壤加入QHZ-3微生物有机肥料：将实施例3微生物有机肥料二次固体发酵至有效活菌数约为1.0×108CFU/g，于定植后第三天按土壤质量的1.5％加入。
处理间采用等养分(N/P/K)设计。
定植15天后，将马铃薯根完整的挖出，轻轻抖落根系上粘附的土，用灭菌刷子轻轻刷下附着在根系上的根际土壤，置于灭菌的离心管于-80℃冰箱保存。提取基因组采用TIANGEN TiANamp soil DNA Kit土壤基因组DNA提取试剂盒，提取后用qPCR进行定量。对马铃薯根际土中提出的基因组进行荧光定量PCR定量发现，与对照相比，处理1和处理2使立枯丝核菌的基因拷贝数分别减少了29.2％与32.5％。

Claims (6)

1.一种微生物有机肥料，其特征在于，包括如下步骤制备得到：
步骤1：将保藏号为CGMCC No.13639的萎缩芽孢杆菌QHZ-3接种到LB培养液中进行液体发酵生产，得到QHZ-3菌液，其发酵生产的条件为：初始pH7.0-7.2，发酵温度25-35℃，转速150-180r/min，发酵获得的QHZ-3菌液有效活菌数≥1×109CFU/mL；
步骤2：氨基酸有机肥的制备：将氨基酸原液按15ml/100g加入到有机肥中，发酵5d，使其pH为6.5-6.8；其中，氨基酸原液中氨基酸为动物蛋白氨基酸，其含量≥100g/L，微量元素：Fe+Mn+Zn+B≥20ng/L；
步骤3：将步骤1得到的QHZ-3菌液按5mL/100g接种至步骤2得到的氨基酸有机肥中，进行二次固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵周期为5-7d，使QHZ-3有效活菌数≥0.2×109cfu/g，在温度不超过60℃的条件下将含水量蒸发至30％以下即获得微生物有机肥料。
2.根据权利要求1所述的微生物有机肥料，其特征在于，步骤1中LB培养液配制方法为：以配制1L培养液为例，蒸馏水950ml、蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl10g混合均匀，再用蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.0-7.2，121℃灭菌30min。
3.根据权利要求1所述的微生物有机肥料，其特征在于，步骤2中有机肥为畜禽粪便有机肥，包括鸡粪有机肥、牛粪有机肥、马粪有机肥、羊粪有机肥、猪粪有机肥、兔粪有机肥中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的微生物有机肥料，其特征在于，步骤3所制微生物有机肥料的发芽指数为98％以上，有机质含量(以干基计)≥40％，含水量≤30％。
5.权利要求1-4任一权利要求所述的微生物有机肥料在促进马铃薯生长和增产中的应用。
6.权利要求1-4任一权利要求所述的微生物有机肥料在防治马铃薯黑痣病中的应用。
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