CN108504586B - 软化类芽孢杆菌及秸秆腐熟剂 - Google Patents

软化类芽孢杆菌及秸秆腐熟剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种秸秆腐熟剂，其包括组分软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)CGMCC No.14564和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)CICC No.10089；腐熟剂中总有效活菌数为0.5×108～2×108个/g，总有效活菌数中软化类芽孢杆菌有效活菌数占65％～70％；本发明还公开了秸秆腐熟剂的制备方法，与现有技术采用多种菌种进行制备腐熟剂相比，采用本发明公开的方法制备腐熟剂不仅原料品种少，制备工艺简单，而且本发明采用了现有技术没有用过的枯草芽胞杆菌作为原料之一与软化类芽孢杆菌进行相互作用，其使用效果显著，因此可以在相关企业推广生产。

Description

软化类芽孢杆菌及秸秆腐熟剂
技术领域
本发明涉及腐熟剂制备技术领域，具体涉及一种秸秆腐熟剂及其制备方法。
背景技术
作物秸秆是农作物生产过程中产生的一种生物资源。自20世纪80年代，在粮食产量大幅提高的情况下，秸秆数量也迅速增多，粮食作物秸秆产量从2001年的4.6×108t增加到2010年的5.8×108t。随着清洁能源的推广与普及，农业存在大量剩余的秸秆。每年都有大部分玉米、小麦等农作物秸秆被烧掉，焚烧过程中产生大量CO和CO2，秸秆焚烧不仅会污染空气，还会破坏土壤结构和土壤微生物菌群。
秸秆还田作为一项先进的保护性耕作技术，得到世界上农业发达国家足够的重视。德国有严格的法律禁止焚烧秸秆，日本把秸秆直接还田当作农业生产中的法律去执行，美国把秸秆还田当作农作制中的一项关键技术，近年来，我国高度重视秸秆综合利用研究，秸秆直接还田是今后秸秆肥料化的主要途径。但是因为秸秆富含纤维素、半纤维素和木质素，又缺乏配套技术，腐解速度慢、周期长，对下茬作物的播种和生长影响较大而未能大面积推广，所以秸秆的快速腐解是秸秆直接还田的重要保证。
秸秆腐熟剂是指能加速各类农作物秸秆腐熟的微生物活体制剂，是有机物料腐熟菌剂中的一种。秸秆腐熟剂由多种不同的微生物组成，能使秸秆等有机废弃物快速腐熟，使秸秆中所含的有机质及磷、钾等元素快速成为植物生长所需的营养，提高土壤有机质，改善作物品质，提高作物产量。
目前市面上已有的秸秆腐熟剂，大部分都需要很长的分解时间，需要将秸秆成堆，操作复杂，分解作用不稳定，对环境的要求很高，如遇低温或下雨，催腐效果明显降低，而且存在单一性，不能广泛应用。比如，名称为“一种秸秆腐熟剂”(申请号为201310666396.9)的发明专利公开的腐熟剂的组分包括括如下活性组分：软化类芽孢杆菌、米曲霉、里氏木霉、黄孢平革菌、以及嗜热脂、肪地芽孢杆菌，其组分数量多，制备工艺要求，制备过程复杂，给企业推广应用带来难度。因此，效果良好、制备方法相对简单的腐熟剂的研究有待深入。
发明内容
本发明的提供一种降解时间短、分解作用稳定、适用性广、成本低廉、应用简单的复合型秸秆腐熟剂。
为了实现上述目的，本发明通过研究获得的成果有：
筛选获得了一种软化类芽孢杆菌R-807，保藏于2017年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14564；基因序列如：SEQ IDNo.1所示；形态特征：营养细胞为杆状，革兰氏染色阳性，以周生鞭毛运动，宽0.5～2.5μm，长1.2～10μm；在膨大胞囊内有椭圆形芽孢，在营养琼脂上无可溶性色素。
优选的，所述的软化类芽孢杆菌R-807的筛选方法，步骤包括：
(1)软化类芽孢杆菌分离培养基的制作(g/L)：称取葡萄糖10.0g，磷酸钙5.0g，硫酸铵0.5g，氯化钾0.2g，七水硫酸镁0.1g，硫酸锰0.0001g，硫酸亚铁0.0001g，酵母提取物0.5g，琼脂20g，加水至1000ml，pH6.5，在121℃下高温灭菌30min，待用；
(2)收集玉米秸秆与猪粪堆肥样品，取10g悬于90mL无菌蒸馏水中震荡均匀，取上清液按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度依次稀释，分别从各浓度的稀释液中吸取0.05ml，于分离培养基平板均匀涂布，在30℃下恒温培养24h，镜检各菌落形态，挑取杆状菌落，反复划线分离纯化，获得该菌菌株。
利用该软化类芽孢杆菌R-807的秸秆腐熟剂，包括组分软化类芽孢杆菌R-807(Paenibacillus macerans，简称：软化类芽孢杆菌)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)；腐熟剂中总有效活菌数为0.5×108～2×108个/g，总有效活菌数中软化类芽孢杆菌有效活菌数占65％～70％。当然也可以合理推定所有软化类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)应该具有类似的效果，两种菌混合的制剂均比现有技术有技术进步和优势。
本发明的第二目的是提供一种上所述的秸秆腐熟剂的制备方法，其步骤为：
(1)菌种活化：将软化类芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌分别接种于各自的斜面培养基培养，其中软化类芽孢杆菌在35～37℃、pH7.0～7.2的条件下培养23～24h，枯草芽胞杆菌在28～30℃、pH7.0～7.2的条件下培养23～24h；
(2)摇瓶培养：将步骤(1)中活化的软化类芽孢杆菌和枯草芽胞杆菌分别接种于各自的液体培养基中，摇床振荡培养至各菌种培养液中菌种有效活菌数均为108～2×108个/ml；
(3)种子罐发酵：将步骤(2)中各菌种培养液按5％接种量分别接种于各自的种子罐中，培养至各菌种培养液中菌种有效活菌数均为108～2×108个/ml；
(4)发酵罐发酵：将步骤(3)中各菌种培养液按5％接种量分别接种于各自的发酵罐中，培养至各菌种发酵培养液中菌种有效活菌数分别为108～2×108个/ml，得软化类芽孢杆菌菌液和枯草芽胞杆菌菌液；
(5)将步骤(4)中软化类芽孢杆菌菌液、枯草芽胞杆菌菌液按1.8～2.4:1的体积比混合，得混合菌液，将混合菌液与麦麸或碎秸秆按3:6～8的质量比混和搅拌，自然风干，得总有效活菌数为0.5×108～2×108个/g的混合物，将混合物粉碎、制剂，得秸秆腐熟剂。
本发明的有益效果是：本发明的秸秆腐熟剂中各菌群能够和谐共处、相互促进，达到优势互补的效果，能有效分解作物秸秆中的木质素、纤维素和半纤维素等，降解时间短，分解作用稳定，且能够有效杀灭病菌，常温下即具有分解作用，因此实际使用时可直接喷洒在田间使用，不仅使用方便，而且可以大大缩短秸秆腐熟时间。需要说明的是，本发明的秸秆腐熟剂既可以用来堆肥，也可以用于秸秆还田，同时还能够有效提高作物的抗病性。与现有技术采用多种菌种进行制备腐熟剂相比，采用本发明公开的方法制备腐熟剂不仅原料品种少，制备工艺简单，而且本发明采用了现有技术没有用过的枯草芽胞杆菌作为原料之一与软化类芽孢杆菌进行相互作用，其使用效果显著，因此可以在相关企业推广生产。
具体的方案为，步骤(1)中软化类芽孢杆菌的斜面培养基配方为：蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g,琼脂20g，补水至1000ml，pH7.2，在121℃下高温灭菌30min。
具体的方案为，步骤(2)中软化类芽孢杆菌的液体培养基配方为：蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g，补水至1000ml，pH7.2，在121℃下高温灭菌30min。
进一步的，步骤(2)中软化类芽孢杆菌是在30～35℃、170～190rmp条件下摇床振荡培养23～24h，枯草芽胞杆菌是在30～35℃、140～160rmp条件下摇床振荡培养23～24h。
优选方案为，步骤(3)中软化类芽孢杆菌的种子罐培养基、以及步骤(4)中软化类芽孢杆菌的发酵罐培养基均与步骤(2)中软化类芽孢杆菌的液体培养基配方相同；步骤(3)中枯草芽胞杆菌的种子罐培养基、以及步骤(4)中枯草芽胞杆菌的发酵罐培养基均与步骤(2)中枯草芽胞杆菌的液体培养基配方相同。各菌种的种子罐培养基、发酵罐培养基均与步骤(2中各菌种的液体培养基配方一致时，不仅培养基能够满足菌种培养的需求，而且培养基制备方便，简化操作过程。
具体实施方式
以下通过实施例1～4来进一步说明的本发明公开的技术方案。
软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)R-807的筛选方法和确认：
1、软化类芽孢杆菌的筛选
(1)软化类芽孢杆菌分离培养基的制作(g/L)：称取葡萄糖10.0g，磷酸钙5.0g，硫酸铵0.5g，氯化钾0.2g，七水硫酸镁0.1g，硫酸锰0.0001g，硫酸亚铁0.0001g，酵母提取物0.5g，琼脂20g，加水至1000ml，pH6.5，在121℃下高温灭菌30min，待用；
(2)收集四川绵阳三台县一堆肥厂玉米秸秆与猪粪堆肥样品，取10g悬于90mL无菌蒸馏水中震荡均匀，取上清液按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度依次稀释，分别从各浓度的稀释液中吸取0.05ml，于分离培养基平板均匀涂布，在30℃下恒温培养24h，镜检各菌落形态，挑取杆状菌落，反复划线分离纯化，获得该菌菌株，其性状特征如下：
形态特征：营养细胞为杆状，革兰氏染色阳性，以周生鞭毛运动，宽0.5～2.5μm，长1.2～10μm；在膨大胞囊内有椭圆形芽孢，在营养琼脂上无可溶性色素。
培养性质：最适pH为7，最适的温度28～30℃，兼性厌氧，在液体分离培养基上生长菌落较薄，无菌膜，液体澄清；在固体分离培养基上生长良好，菌落扁平，表面光滑、半透明。
分子生物学鉴定：提取该菌株全基因组DNA，PCR扩增16S rDNA片段，测序，测序结果在NCBI中进行比对，比对结果显示该菌株为软化类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)；该菌株全基因组DNA序列如：SEQ ID No.1所示。
实施例1：软化类芽孢杆菌发酵液的制备
(1)菌种活化：将软化类芽孢杆菌接种于斜面培养基(蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，补水至1000ml，pH7.2)中，35℃恒温培养箱中培养24h；
(2)摇瓶培养：将步骤(1)中活化的软化类芽孢杆菌接种于液体培养基(蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g，补水至1000ml，pH7.2)中，在35℃、130rmp的条件下摇床振荡培养24h；
(3)种子罐发酵：将步骤(2)中的软化类芽孢杆菌培养液按5％接种量接种于种子罐中，培养至软化类芽孢杆菌培养液中菌种有效活菌数为2×108个/ml，种子罐培养基与其步骤(2)中的液体培养基配方相同；
(4)发酵罐发酵：将步骤(3)中的软化类芽孢杆菌培养液按5％接种量发酵罐中，培养至软化类芽孢杆菌发酵培养液中菌种有效活菌数为2×108个/ml，得软化类芽孢杆菌菌液，发酵罐培养基与其步骤(2)中的液体培养基配方相同。
实施例2：枯草芽胞杆菌发酵液的制备
菌种来源：枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)为市售菌种，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC No.10088；地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，邮编：100015；
(1)菌种活化：将枯草芽胞杆菌接种于斜面培养基(蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g,琼脂20g，补水至1000ml，pH7.0)中，35℃恒温培养箱中培养24h；
(2)摇瓶培养：将步骤(1)中活化的枯草芽胞杆菌接种于液体培养基(蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g，补水至1000ml，pH7.2)中，在35℃、130rmp的条件下摇床振荡培养24h；
(3)种子罐发酵：将步骤(2)中的枯草芽胞杆菌培养液按5％接种量接种于种子罐中，培养至枯草芽胞杆菌培养液中菌种有效活菌数为2×108个/ml，种子罐培养基与其步骤(2)中的液体培养基配方相同；
(4)发酵罐发酵：将步骤(3)中的枯草芽胞杆菌培养液按5％接种量发酵罐中，培养至枯草芽胞杆菌发酵培养液中菌种有效活菌数为2×108个/ml，得枯草芽胞杆菌菌液，发酵罐培养基与其步骤(2)中的液体培养基配方相同。
实施例3：秸秆腐熟剂的制备
将实施例1制备的软化类芽孢杆菌菌液和实施例2制备的枯草芽胞杆菌菌液按体积比2:1混合，得到混合菌液，将混合菌液与尺寸不超过2cm的碎秸秆按3:7的湿重比混和搅拌，自然风干，粉碎过20目筛，制剂，得秸秆腐熟剂，该秸秆腐熟剂的总有效活菌数约108个/g。
实施例4：秸秆腐熟剂的应用效果
一、水稻秸秆腐熟试验
(1)选取粗细、长度接近的完整的水稻秆(秸秆长度约30cm)，均分成四份堆放，编号对照组1、对照组2、试验组1、试验组2，将四份秸秆分别喷上2倍质量的水，放置在相同环境下；
(2)对照组1、2不做任何处理，试验组1、2分别添加质量百分比为0.2％的实施例3制备的秸秆腐熟剂，观察记录秸秆腐熟情况，结果如表1。
表1水稻秸秆腐熟记录表
Figure BDA0001496061420000071
表1记载的观察记录结果显示，与对照组相比，使用秸秆腐熟剂后，水稻秸秆提前5天变褐黄，提前15天腐烂，由此说明采用本发明公开的方法制备的秸秆腐熟剂的使用效果显著，且实际应用时直接使用在较大尺寸的秸秆上即可，因此可以直接施加在农田里收获作物后的秸秆上，非常方便。
二、秸秆腐熟剂的抗病性试验
(1)从试验基地里取4株大小形态相似、都有约20％的叶片枯萎且都患有轻微青枯病的番茄植株，移栽到同样大小的花盆里，编号对照组1、对照组2、试验组1、试验组2，每个盆里土壤物化性能一致；
(2)称取两份实施例3制备的秸秆腐熟剂，每份1g，分别加入到三角瓶中，每个三角瓶再加入200ml无菌水，搅拌混匀，然后分别浇在试验组1、2的番茄植株根部，对照组1、2的番茄植株根部分别浇200ml的无菌水，一周后观察记录番茄植株的生长情况，结果表明：试验组1的番茄植株长势良好，叶片无枯萎现象，叶子上无虫孔；试验组2的番茄植株有2片叶片发生枯萎现象，生长良好的叶子上无虫孔；对照组1的番茄植株有90％的叶片枯萎，且没枯萎的叶片上有虫孔；对照组2的番茄植株已枯死。由此可见，本发明公开的秸秆腐熟剂对青枯病的防治是有效果的，其可以有效杀灭病虫，提高作物的抗病性。
三、对小麦秸秆的失重率影响
1、试验时间：2016年6月25日～2016年8月15日；
2、试验地点：河南省开封市柳园口乡陶庄村边恒亮家；
3、试验方法：
以河南省开封市柳园口乡陶庄村边恒亮家的面积80m2责任田为试验点，小麦收割后，小麦秸秆经切碎翻耕还田深度8cm，进行玉米种植。将试验田划分为两个组，编号试验组、对照组，试验组与对照组之间隔有一定距离，不会发生相互干涉；
试验组：常规施肥+全量秸秆还田+亩用实施例3制得的秸秆腐熟剂1公斤(秸秆腐熟剂与麦麸按照1:10的质量比例拌匀后均匀的施撒在粉碎后的秸秆上)；
对照组：常规施肥+全量秸秆还田。
试验在常规施肥的基础上进行。种植玉米的常规施肥为：不施底肥，大喇叭口期追施复合肥(15-15-15复合肥)30kg。本试验严格按照试验方案要求，从2016年6月14日开始实施。试验采用小麦秸秆全量还田方式，秸秆经切碎翻耕还田深度8cm。
另外，选取粗细与长度接近的完整的小麦秸秆，长度3～5cm，称取50g放入尼龙网袋中(40目，25×35cm)，共计65袋样品：其中5袋样品直接置于85℃下烘干处理6h后，准确称重并记录每袋的重量，计平均值N0＝42.92g；再取30袋用秸秆腐熟剂，秸秆腐熟剂用量为秸秆重量的5％，余下的30袋不施用秸秆腐熟剂，将这60袋样品埋入深度8cm左右的土层中，分别于6月24日、7月4日、7月14日、7月24日、8月3日、8月13日随机取出样品5袋，进行检测，60d后(即8月13日)的秸秆样品干重如表2所示：
表2 60d时秸秆样品干重Nx(g)
Figure BDA0001496061420000091
使用腐熟剂秸秆还田后在第10d、20d、30d、40d、50d和60d观察记载秸秆定性腐解度(实验组和对照组每次都是任选埋在土层中的5袋，失重率取5袋的平均值)，采用秸秆失重率法测定秸秆腐解度。秸秆腐解程度可定性比较，统计师把秸秆颜色中黄、微黄、褐黄、黑黄分别定位1、2、3、4级，秸秆气味中的霉味、氨味、酒味、腐烂味分别定为1、2、3、4级，手感软化程度中的硬、微软、软、腐烂分别定为1、2、3、4级，统计时个处理中的腐解程度数值为三大指标级别数值之和，数值越大表示该处理的秸秆腐烂越快，腐熟作用越明显。
表3不同时间内的秸秆失重率
Figure BDA0001496061420000092
Figure BDA0001496061420000101
表4 60d时两组各5袋秸秆的失重率统计表
Figure BDA0001496061420000102
施用“有机物料腐熟剂”提高了小麦秸秆的失重率。由表3、表4可以看出，施用“秸秆腐熟剂”与不施“秸秆腐熟剂”10d、20d、30d、40d、50d、60d相比，失重率分别提高了2.67、2.90、3.55、3.48、4.72、6.51。由此可见，施用“有机物料腐熟剂”可以加快小麦秸秆的腐熟，提高秸秆的失重率。
四、水稻秸秆的还田试验
1、试验时间：2016年9月20日～2016年10月25日；
2、试验地点：河南省洛阳市新安县大章新村；
3、试验方法：
以洛阳市新安县大章新村王某家的1.5亩稻田为试验点，水稻采用收割机收割后，稻茬高度留20cm左右，将稻田划分为三个区域，编号试验组1、试验组2、对照组，试验组与对照组之间隔有一定距离，不会发生相互干涉；
(2)将对照组以及试验组1、2的稻田灌满水，使倒茬被水淹没，秸秆腐熟剂用清水活化，然后向试验组1、2的稻田中均匀喷洒，每亩稻田用1公斤秸秆腐熟剂。之后每隔5天观察记录一次稻茬腐熟情况，结果如表5所示。
表5水稻秸秆腐熟记录表
Figure BDA0001496061420000103
Figure BDA0001496061420000111
经试验显示：试验组1、2稻田中的稻茬从第5天开始变黑、变软，对照组1稻田中的稻茬在第5天观察还是黄色，稻茬韧性还非常好；在第15天时，试验组1、2的稻茬已完全变黑、腐熟，用手轻轻一拉，就断裂，对照组1的稻茬开始变黑，但大部分还是黄褐色；在第35天时，对照组1的稻茬才完全变黑，腐烂。从试验结果可以看出，采用本发明的秸秆腐熟剂可以使稻田中的稻茬腐熟时间缩短20天左右。
五、对水稻秸秆的肥效试验
1、试验时间：2016年6月5日～2016年10月20日；
2、试验地点：河南省中牟县雁鸣湖稻田养蟹专业合作社水稻基地；
3、试验方法：
以河南省中牟县雁鸣湖稻田养蟹专业合作社水稻基地的面积160m2稻田为试验点，水稻采用收割机收割后，稻茬高度留20cm左右，将稻田划分为四个区域，每组面积为40m2，编号试验组1、试验组2、试验组3和对照组，各试验组以及对照组之间隔有一定距离，不会发生相互干涉；
试验组1：常规施肥+用供试实施例3制备的秸秆腐熟剂60g(拌干细土300g)于水稻插秧后撒施；
试验组2：常规施肥+用供试实施例3制备的微生物菌剂60g(拌干细土300g)于水稻插秧后撒施；
试验组3：常规施肥+用细沙60g(拌干细土300g)于水稻插秧后撒施；
对照组：常规施肥。
试验在当地常规施肥的基础上进行。水稻常规施肥为：小麦收获后趁墒耕翻，亩施40％水稻专用肥60kg作基肥，随即耙田耖平，以备灌水插秧。插秧后10天每亩施尿素10kg；巧施促花肥，每亩施磷酸二铵8kg、硫酸钾5kg。试验田水稻于2016年6月5日插秧，按照试验方案要求分别于2016年6月10日供试秸秆腐熟剂、供试微生物菌剂基质和细沙分别均匀拌干细土撒施于各处理区，2016年10月20日收获。收获时各小区单收单打单晒计产并同时去植株样进行室内考种。试验除按方案要求撒施供试秸秆腐熟剂、供试微生物菌剂基质和细沙外，其他管理措施同一般水稻田。
3.1撒施“秸秆腐熟剂”对水稻生物学性状的影响
撒施本发明的“秸秆腐熟剂”改善了水稻的生物学性状。由表6可以看出：
表6田间调查与考种统计表
Figure BDA0001496061420000121
(注：表中4个处理的数据均为3次重复的平均数)
试验组1与试验组2、试验组3、对照组相比，穗长分别增加0.7cm、0.9cm、1.0cm，穗粒数分别增加9粒、11粒、11粒，千粒重分别增加0.5g、0.6g、0.6g，结实率分别增加1.7％、1.9％、1.9％。说明在常规施肥的基础上，撒施“秸秆腐熟剂”能够增加水稻的穗长、穗粒数、千粒重和结实率。3.2撒施“秸秆腐熟剂”对水稻产量的影响
撒施本发明的“秸秆腐熟剂”增加了水稻的产量。有表7可以看出：试验组1较试验组2平均亩产43.3kg，增产率为8.1％。对各处理产量结果进行方差分析(见表8)，结果显示实验组间产量差异为显著水平。采用PLSD法进行多重比较(见表9)，结果显示试验组1与试验组2之间产量差异为显著水平，试验组1和试验组3、对照组之间差异均为极显著水平，试验组2与试验组3、对照组之间产量差异为不显著，实验组3和对照组之间差异不显著。
表7产量结果统计表
Figure BDA0001496061420000131
表8方差分析表
Figure BDA0001496061420000132
表9多重比较
Figure BDA0001496061420000133
Figure BDA0001496061420000141
Figure BDA0001496061420000151
序列表
<110> 四川明湖环保科技有限公司
<120> 软化类芽孢杆菌及秸秆腐熟剂
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1445
<212> DNA
<213> 软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)
<400> 1
gaggcagcta taatgcagtc gagcggacct gatggagtgc ttgcactcct gatggttagc 60
ggcggacggg tgagtaacac gtaggcaacc tgcccgtaag accgggataa ctaccggaaa 120
cggtagctaa taccggataa tcaagtttct cgcatgggag gcttgggaaa ggcggagcaa 180
tctgtcactt acggatgggc ctgcggcgca ttagctagtt ggtggggtaa cggctcacca 240
aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgaacggcca cactgggact gagacacggc 300
ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga 360
gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgcc agggaagaac 420
gtcctgtaga gtaactgcta caggagtgac ggtacctgag aagaaagccc cggctaacta 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540
agcgcgcgca ggcggctgtt taagtctggt gtttaatcct ggggctcaac tccgggtcgc 600
actggaaact ggacggcttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga 660
aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctgggc tgtaactgac 720
gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780
aacgatgagt gctaggtgtt aggggtttcg atacccttgg tgccgaagta aacacattaa 840
gcactccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctgaaactca aaggaattga cggggacccg 900
cacaagcagt ggagtatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 960
acatccctct gaccgctgta gagatatggc tttccttcgg gacagaggag acaggtggtg 1020
catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080
cttgacttta gttgccagca agtgaagttg ggcactctag agtgactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
actacaatgg ccggtacaac gggaagcgaa ggagcgatct ggagcgaatc ctagaaaagc 1260
cggtctcagt tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat tgctagtaat 1320
cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
cacgagagtt tacaacaccc gaagtcggtg aggtaaccgc aaggagccag ccgccgaagc 1440
tcctt 1445

Claims (8)

1.软化类芽孢杆菌R-807，保藏于2017年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14564。
2.软化类芽孢杆菌R-807基因，序列如：SEQ ID No.1所示。
3.一种秸秆腐熟剂，其特征在于：包括权利要求1所述的软化类芽孢杆菌R-807或具有权利要求2所述基因的软化类芽孢杆菌，以及枯草芽胞杆菌；腐熟剂中总有效活菌数为0.5×108～2×108个/g，总有效活菌数中软化类芽孢杆菌有效活菌数占65%～70%。
4.一种如权利要求3所述的秸秆腐熟剂的制备方法，其步骤为：
（1）菌种活化：将软化类芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌分别接种于各自的斜面培养基培养，其中软化类芽孢杆菌在35～37℃、pH7.0～7.2的条件下培养23～24h，枯草芽胞杆菌在28～30℃、pH7.0～7.2的条件下培养23～24h；
（2）摇瓶培养：将步骤（1）中活化的软化类芽孢杆菌和枯草芽胞杆菌分别接种于各自的液体培养基中，摇床振荡培养至各菌种培养液中菌种有效活菌数均为108～2×108个/ml；
（3）种子罐发酵：将步骤（2）中各菌种培养液按5%接种量分别接种于各自的种子罐中，培养至各菌种培养液中菌种有效活菌数均为108～2×108个/ml；
（4）发酵罐发酵：将步骤（3）中各菌种培养液按5%接种量分别接种于各自的发酵罐中，培养至各菌种发酵培养液中菌种有效活菌数分别为108～2×108个/ml，得软化类芽孢杆菌菌液和枯草芽胞杆菌菌液；
（5）将步骤（4）中软化类芽孢杆菌菌液、枯草芽胞杆菌菌液按1.8～2.4:1的体积比混合，得混合菌液，将混合菌液与麦麸或碎秸秆按3:6～8的质量比混和搅拌，自然风干，得总有效活菌数为0.5×108～2×108个/g的混合物，将混合物晾干、粉碎、制剂，得秸秆腐熟剂。
5.权利要求4所述的秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中软化类芽孢杆菌的斜面培养基配方为：蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g,琼脂20g，补水至1000ml，pH7.2，在121℃下高温灭菌30min；枯草芽胞杆菌的斜面培养基配方为：蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g,琼脂20g，补水至1000ml，pH7.2，在121℃下高温灭菌30min。
6.权利要求4所述的秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中软化类芽孢杆菌的液体培养基配方为：蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g,补水至1000ml，pH7.2，在121℃下高温灭菌30min；枯草芽胞杆菌的液体培养基配方为：蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g，补水至1000ml，pH7.2，在115℃下高温灭菌30min。
7.权利要求4所述的秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中 软化类芽孢杆菌是在30～35℃、170～190rmp条件下摇床振荡培养23～24h，枯草芽胞杆菌是在30～35℃、140～160rmp条件下摇床振荡培养23～24h。
8.权利要求4所述的秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）中 软化类芽孢杆菌的种子罐培养基、以及步骤（4）中软化类芽孢杆菌的发酵罐培养基均与步骤（2） 中软化类芽孢杆菌的液体培养基配方相同；
所述步骤（3）中枯草芽胞杆菌的种子罐培养基、以及步骤（4）中枯草芽胞杆菌的发酵罐培养基均与步骤（2）中枯草芽胞杆菌的液体培养基配方相同。
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