CN108949635B - 胶冻样芽孢杆菌、微生物菌肥、其制备方法及其应用 - Google Patents

胶冻样芽孢杆菌、微生物菌肥、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种胶冻样芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.16005。本发明还提供了一种微生物菌肥，包括上述技术方案所述的胶冻样芽孢杆菌、载体和有机肥，其中，上述技术方案所述的胶冻样芽孢杆菌复合在所述载体上。本发明提供的胶冻样芽孢杆菌对土壤中云母和长石等含钾的硅酸盐矿石具有较强的分解能力，应用于农业生产不仅可以起到解钾溶磷的作用，还易形成根系优势种，用作果蔬和农作物种植的微生物菌肥能够增强作物和花卉抗寒、抗旱、抗病和抗逆能力，小叶、黄叶、早期落叶现象明显减少。

Description

胶冻样芽孢杆菌、微生物菌肥、其制备方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物肥料技术领域，尤其涉及一种胶冻样芽孢杆菌、微生物菌肥、其制备方法及其应用。
背景技术
由于无机化肥的过量使用，当前我国花卉土壤质量普遍较差，尤其是表现在土壤碳氮比低，进而导致土壤微生物系统遭到破坏，有益微生物不断减少，严重影响了根系的生长发育。
多年来，化学肥料的施用对农业增产增收起到了关键作用。据资料显示，中国的钾肥生产量只占世界的0.3％，而消耗量却到14.7％，每年虽然进口200多万吨钾肥，仍然不能满足农业生产对钾肥的需要。利用化学钾肥补钾是我国农业中普遍使用并且见效较快的土壤速效钾补充方法，但是，大量使用化学钾肥也造成了土壤结构破坏、土壤污染、有机质含量降低等问题。我国土壤耕层含钾量平均为25500kg/hm2，但其中95％的钾为矿物态钾，主要存在于钾长石和云母中，可供作物直接吸收利用的速效性钾不超过全钾量的2.0％。因此，研究如何将土壤中的矿物态钾释放出来，转化为速效性钾，对农业生产具有重要的理论和实践意义。
在我国，随着人民生活水平不断提同，温饱问题已基本解决，生产优质农产品和绿色食品已成为当前社会和农业生产的迫切需求。2017年中央一号文件中明确提出了“深入推进化肥农药零增长行动，开展有机肥替代化肥试点”，推行生态农业。为了发展生态农业，开发生产绿色食品，农业生产中施肥质量及技术必须进行改革，即合理施用化肥，走有机无机配合施用的发展之路，而生物肥料更应大力提倡和发展。今后在我国农产品品质提高和产量增加的方面，更要依靠包括生物学肥料在内的创新技术的支持，特别是生物肥料的推广应用。目前，世界各国都在寻求新的肥源，其中微生物肥料是研究的重点。
微生物菌剂属于微生物肥料里的农用微生物菌剂。该类产品是指通过有益微生物正常的活动或者有益微生物的产物所得到的一种微生物制品。微生物菌剂中的微生物在土壤内的生命活动过程中会产生大量的赤霉素和细胞激系类物质，这些物质在与植物根系接触后，会刺激作物生长，调节作物新陈代谢，达到增产的目的。有益微生物在植物根部大量生长、繁殖，形成优势菌，抑制和减少了病原菌的繁殖机会，起到了减轻作物病害的功效。丰富的有机质一方面通过微生物活动后，可不断释放出植物生长所需营养元素，另一方面可以改善土壤物理性状，改变土壤团粒结构，从而使土壤疏松，减少土壤板结，有利于保水、保肥、透气和促进根系发展，为农作物提供安全健康的生长环境。
现有技术公开了多种微生物菌剂，例如，申请号为201510236115.5的中国专利文献公开了一种复合微生物肥，由以下重量份数的原料制成：0.5份解淀粉芽孢杆菌、0.5份胶冻样芽孢杆菌、3份粉末尿素、5份磷酸一铵、2份硫酸钾、10份发酵鸡粪、4份发酵牛粪、10份发酵菌糠、65份麦饭石，虽然该复合微生物肥可以体现普通肥料和微生物肥料的综合效果，增强农作物的抗逆能力，但是其成分较为复杂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胶冻样芽孢杆菌、微生物菌肥、其制备方法及其应用，本发明提供的微生物菌肥成分简单，用于农作物和花卉种植时，能够增强作物和花卉抗寒、抗旱、抗病和抗逆能力，小叶、黄叶、早期落叶现象明显减少。
本发明提供了一种胶冻样芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.16005。
本发明提供的胶冻样芽孢杆菌对土壤中云母和长石等含钾的硅酸盐矿石具有较强的分解能力，应用于农业生产不仅可以起到解钾溶磷的作用，还易形成根系优势种，用作果蔬和农作物种植的微生物菌肥能够增强作物和花卉抗寒、抗旱、抗病和抗逆能力，小叶、黄叶、早期落叶现象明显减少。
本发明提供的胶冻样芽孢杆菌保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其筛选过程如下：
以大田作物磷钾肥利用率低为靶标，筛选出具有一定增肥作用，活化硅酸盐矿物中钾素的能力，而且还能利用磷灰石中磷素和固定大气氮素的快速繁殖的菌株；
根据平板解磷解钾分解圈大小、摇瓶解磷解钾效果进行初筛和复筛，筛选具有解磷和解钾作用的的标记菌株，测定标记菌株的稳定性，生物膜形成能力，生理生化特性及解磷解钾能力，研究标记菌株在大田中的定殖动态，根据菌株对磷肥和钾肥肥力的利用率筛选确定最终的菌株。
本发明还提供了一种微生物菌肥，包括上述技术方案所述的胶冻样芽孢杆菌、载体和有机肥，其中，上述技术方案所述的胶冻样芽孢杆菌复合在所述载体上。
在某些技术方案中，所述有机肥和载体的质量比为20～60:20～60。
在某些技术方案中，所述有机肥为经过发酵的鸡粪。
在某些技术方案中，所述载体为草炭。
在某些技术方案中，所述微生物菌肥含菌量为12.0亿芽孢/g以上。
在某些技术方案中，所述微生物菌肥含菌量为20.0～200亿芽孢/g以上。
本发明采用载体与胶冻样芽孢杆菌复合，以适量的有机肥作为增效剂，有效降低胶冻样芽孢杆菌与外界接触的比表面积，减轻外界不良环境对有益微生物负面影响，使具有耐性的微生物菌种剂能够抗御不良环境影响，提高有益微生物存活数量，延长产品有效期，提高产品市场竞争力。
本发明还提供了一种微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：
上述技术方案所述的胶冻样芽孢杆菌经过活化、发酵后与载体复合，干燥后与有机肥混合造粒，得到微生物菌肥。
本发明提供的微生物菌肥的具体制备工艺如下：
(1)将冷冻保藏管中的菌种在斜面中活化(37℃24h)，并在平板中进行纯化(37℃24h)，最终得到斜面菌种或菌种斜面，30℃培养2d，斜面表面变成白色，涂片后，在显微镜下观察，菌体全部变成芽孢，4℃冰箱保存；其中，斜面培养基组成为(g/L)：酵母粉7.0，酵母膏0.7，蛋白冻10.0，糊精2.0，磷酸氢二钠1.0，硫酸锌0.2，硫酸钙0.2，琼脂20.0。
(2)摇瓶培养阶段:取一环纯化后的菌种，接入装量为50mL种子培养基的250mL三角瓶中，121℃，0.5h灭菌，冷却至室温后接种胶冻样类芽孢杆菌，恒温摇床振荡培养，培养条件：温度30℃，转速200r/min，周期14～18h，接种量为三角瓶实际培养基装量的4～5％，PH控制在7.0-7.5之间。培养基：蔗糖10.0，硫酸铵1.0，磷酸氢二钾2.0，酵母膏0.4，硫酸锰2.0，醋酸钙1.0，三氯化铁0.2，pH7.0～7.2。将胶冻样类芽孢杆菌转接到种子培养基上，培养12～14h，取样镜检，菌体成对或单个排列，菌体粗壮，结晶紫染色均匀，pH6.0～6.3，计数含菌量为2.4亿/mL。
(3)种子罐培养
首先采用蒸汽将全部设备进行灭菌处理，灭菌条件为121～125℃，0.103～0.168MPa，0.5～1.0h；
在种子罐中加入种子罐培养基，加料体积约为50～75％，种子罐培养基为：0.5kg牛肉膏、10kg蛋白胨、0.25kg氯化镁、20kg玉米粉、15kg蔗糖、5kg淀粉、0.5kg磷酸二氢钾、1000kg水，pH值8.0；
采用蒸汽对种子罐进行灭菌处理，灭菌条件为121～125℃，0.103～0.168MPa，0.5～1.0h；
采用灭菌空气对种子罐进行降温，25～35℃，常压；
将上述摇瓶培养的菌种接入种子罐，接种量为4％，加入消泡剂，通入灭菌空气，25～35℃发酵20h，镜检菌体的形态、密度，至芽孢形成率≥80％；
(4)发酵罐发酵
在发酵罐中加入发酵罐培养基，加料体积约为50～75％，发酵罐培养基为：2.5kg牛肉膏、50kg蛋白胨、1.25kg氯化镁、100kg玉米粉、75kg蔗糖、25kg淀粉、1.0kg磷酸二氢钾、5000kg水，pH值8.0；
采用蒸汽对发酵罐进行灭菌处理，灭菌条件为121～125℃，0.103～0.168MPa，0.5～1.0h；
采用灭菌空气对发酵罐进行降温，25～35℃，常压；
将上述种子罐培养的菌种接入发酵罐，接种量为4％，加入消泡剂，通入灭菌空气，25～35℃发酵24～36h，镜检菌体的形态、密度，至芽孢形成率≥80％；
(5)将获得的发酵物与载体混合，载体与发酵物的质量比为1～3:1，混合后水分含量为25～50％；
将得到的产品进行气流干燥后，干燥温度为100～120℃，干燥后产品水分＜10％，产品中微生物均的含量为25～200亿/g；
将干燥后的粉剂与有机肥料混合制粒，得到微生物菌肥，有机肥料与载体的质量比为20～60:20～60。微生物菌肥中含菌量为2.0亿芽孢/g以上。
本发明采用载体与胶冻样芽孢杆菌复合，以适量的有机肥作为增效剂，有效降低胶冻样芽孢杆菌与外界接触的比表面积，减轻外界不良环境对有益微生物负面影响，使具有耐性的微生物菌种剂能够抗御不良环境影响，提高有益微生物存活数量，延长产品有效期，提高产品市场竞争力。
本发明提供的微生物菌剂中，胶冻样芽孢杆菌对土壤中云母和长石等含钾的硅酸盐矿石具有较强的分解能力，应用于农业生产不仅可以起到解钾溶磷的作用，还易形成根系优势种，可以用作果蔬、农作物、花卉等种植的微生物菌肥，能够增强作物和花卉抗寒、抗旱、抗病和抗逆能力，小叶、黄叶、早期落叶现象明显减少。
实验结果表明，将本发明提供的微生物菌肥施用于大豆后，能够增加大豆的株粒重、百粒重以及产量；施用于枸杞后，能够增加枸杞的产量，增加枸杞颗粒及含糖量，减少农药残留和重金属残留，更重要的是能够减少枸杞死树数量。
生物保藏说明
生物材料：BH-001，分类命名：胶冻样芽孢杆菌(Patuibacillus mucilaginous)，已于2018年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.16005。
具体实施方式
实施例1
(1)将冷冻保藏管中、保藏编号为CGMCC No.16005的菌种在斜面中活化(37℃24h)，并在平板中进行纯化(37℃24h)，最终得到斜面菌种或菌种斜面，30℃培养2d，斜面表面变成白色，涂片后，在显微镜下观察，菌体全部变成芽孢，4℃冰箱保存；其中，斜面培养基组成为(g/L)：酵母粉7.0，酵母膏0.7，蛋白冻10.0，糊精2.0，磷酸氢二钠1.0，硫酸锌0.2，硫酸钙0.2，琼脂20.0。
(2)摇瓶培养阶段:取一环纯化后的菌种，接入装量为50mL种子培养基的250mL三角瓶中，121℃，0.5h灭菌，冷却至室温后接种胶冻样类芽孢杆菌，恒温摇床振荡培养，培养条件：温度30℃，转速200r/min，周期14～18h，接种量为三角瓶实际培养基装量的4～5％，PH控制在7.0-7.5之间。培养基：蔗糖10.0，硫酸铵1.0，磷酸氢二钾2.0，酵母膏0.4，硫酸锰2.0，醋酸钙1.0，三氯化铁0.2，pH7.0～7.2。将胶冻样类芽孢杆菌转接到种子培养基上，培养12～14h，取样镜检，菌体成对或单个排列，菌体粗壮，结晶紫染色均匀，pH6.0～6.3，计数含菌量为2.4亿/mL。
(3)种子罐培养
首先采用蒸汽将全部设备进行灭菌处理，灭菌条件为125℃，0.15MPa，0.5h；
在种子罐中加入种子罐培养基，加料体积约为70％，种子罐培养基为：0.5kg牛肉膏、10kg蛋白胨、0.25kg氯化镁、20kg玉米粉、15kg蔗糖、5kg淀粉、0.5kg磷酸二氢钾、1000kg水，pH值8.0；
采用蒸汽对种子罐进行灭菌处理，灭菌条件为125℃，0.15MPa，0.5h；
采用灭菌空气对种子罐进行降温，25～35℃，常压；
将上述摇瓶培养的菌种接入种子罐，接种量为4％，加入消泡剂，通入灭菌空气，30℃发酵20h，镜检菌体的形态、密度，至芽孢形成率≥80％；
(4)发酵罐发酵
在50L发酵罐中加入发酵罐培养基，加料体积约为70％，发酵罐培养基为：2.5kg牛肉膏、50kg蛋白胨、1.25kg氯化镁、100kg玉米粉、75kg蔗糖、25kg淀粉、1.0kg磷酸二氢钾、5000kg水，pH值8.0；
采用蒸汽对发酵罐进行灭菌处理，灭菌条件为121～125℃，0.103～0.168MPa，0.5～1.0h；
采用灭菌空气对发酵罐进行降温，25～35℃，常压；
将上述种子罐培养的菌种接入发酵罐，接种量为4％，加入消泡剂，通入灭菌空气，30℃发酵30h，罐压0.06MPa，间歇搅拌，搅拌转速为200r/min，通风比为1:(0.3～0.5)，镜检菌体的形态、密度，至芽孢形成率≥80％；
(5)将获得的发酵物与草炭混合，草炭与发酵物的质量比为2:1，混合后水分含量为30％；
将得到的产品进行干燥后，干燥温度为110℃，干燥后产品水分＜10％，产品中微生物均的含量为25亿/g以上；
将干燥后的粉剂与经过发酵的鸡粪混合制粒，得到圆粒状微生物菌肥，鸡粪与草炭的用量比为1:1，微生物菌肥中含菌量为2.0亿芽孢/g以上。
实施例2
1.1材料
1.1.1供试肥料：实施例1的微生物菌肥，颗粒剂，20㎏/袋；含菌量≥2.0×108cfu/g，含水量≤10％；
1.1.2供试作物：大豆品种晋豆20。
1.2方法
T：微生物菌肥，40kg/亩基施；
CK:常规对照为亩用农家肥5m3，基施氮肥(N)15kg，磷肥(P2O5)6.0kg，钾肥(K2O)10.0kg。亩留苗1.58万株。4月21日播种，10月14日收获，各区单收计产。
2结果与分析
2.1不同处理对大豆生物学性状的影响
表1微生物菌肥对大豆生物学性状的影响
Figure BDA0001761502680000071
2.2不同处理对大豆产量的影响
表2微生物菌肥对大豆产量的影响
Figure BDA0001761502680000072
实验结果表明：使用实施例1的微生物菌肥大豆产量为193kg/亩，较对照(CK)高14kg/亩，增产幅度达7.8％。
实施例3
采用简单对比试验进行枸杞大田试验，亩施用实施例1的微生物菌肥40公斤，验证该菌剂有提高土壤肥料利用率、增加产量的功效。
1.材料与方法
1.1供试土壤
试验地为青海省海西蒙古族藏族自治州都兰县诺木洪农场第一生产大队，砂质壤土，土壤肥力中等，土壤有机质含量为17.0mg/kg、水解性氮119mg/kg、有效磷114mg/kg、速效钾232mg/kg，pH为8.3。土壤肥力均匀一致，
1.2供试肥料
实施例1的微生物菌肥，颗粒剂，20㎏/袋；含菌量≥2.0×108cfu/g，含水量≤10％。
1.3供试品种
供试枸杞品种为宁杞7号。
1.4试验方法
试验设2个处理，每个处理1.5亩，每亩650株。
表3枸杞肥效试验施肥处理
Figure BDA0001761502680000081
1.5施肥方法
树根部处开出环形沟施肥，将复合肥、尿素或微生物菌肥混匀后施入沟内。
2.结果与分析
2.1不同处理对枸杞产量的影响
表4微生物菌肥对枸杞产量的影响
Figure BDA0001761502680000091
由上表可见施用微生物菌肥后，枸杞亩增加产量24公斤，增产幅度达12.6％。
2.2不同处理对枸杞产量和品质的影响
表5不同施肥处理对枸杞理化性状的影响
Figure BDA0001761502680000092
由表5可以得出：施用微生物菌肥后，枸杞单个颗粒变大，含糖量增高。总糖含量较对照提升35.33％。
表6不同施肥处理对枸杞污染物、农药残留、食品添加剂限量的影响
Figure BDA0001761502680000093
由表4可以推断出：施用微生物菌肥后，降低了枸杞的农药残留和重金属污染。
2.3经济效益分析
表7不同施肥处理枸杞死树的比较
Figure BDA0001761502680000094
由表7可以看出，施用微生物菌肥后，枸杞苗木6元/株，每亩地能为农户节省至少1626元的成本。
3.结论
与不施微生物菌剂相比，实施例1的微生物菌肥能够增加枸杞产量、提高果实的品质，增加农户的经济收入；同时枸杞品相好、糖分增大口感更好、污染物含量降低、农残含量低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种胶冻样芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.16005。
2.一种微生物菌肥，其特征在于，包括权利要求1所述的胶冻样芽孢杆菌、载体和有机肥，其中，权利要求1所述的胶冻样芽孢杆菌复合在所述载体上。
3.根据权利要求2所述的微生物菌肥，其特征在于，所述有机肥和载体的质量比为20～60:20～60。
4.根据权利要求3所述的微生物菌肥，其特征在于，所述有机肥为经过发酵的鸡粪。
5.根据权利要求3所述的微生物菌肥，其特征在于，所述载体为草炭。
6.根据权利要求2所述的微生物菌肥，其特征在于，所述微生物菌肥含菌量为12.0亿芽孢/g以上。
7.根据权利要求5所述的微生物菌肥，其特征在于，所述微生物菌肥含菌量为20.0～200亿芽孢/g以上。
8.一种微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：
权利要求1所述的胶冻样芽孢杆菌经过活化、发酵后与载体复合，干燥后与有机肥混合造粒，得到微生物菌肥。
9.权利要求1所述胶冻样芽孢杆菌或权利要求2～7任意一项所述的微生物菌肥作为农作物或花卉肥料的应用。
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