CN102212496A

CN102212496A - 一株胶冻样芽孢杆菌及其用途

Info

Publication number: CN102212496A
Application number: CN 201110124488
Authority: CN
Inventors: 杜迎辉; 庄钟娟; 孙杉杉; 徐志文; 苏海榆; 张财源; 朱瑞艳
Original assignee: LEADING BIO-AGRICULTURAL Co Ltd
Current assignee: LEADING BIO-AGRICULTURAL Co Ltd
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2031-05-13
Also published as: CN102212496B

Abstract

本发明涉及一株经过紫外诱变获得的具有较强解硅能力的胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，其保藏编号为CGMCCNO.4667。本发明还涉及所述菌株的用途。通过试验证明，该菌株使土壤中有效硅、水溶性硅含量提高20％以上；能促进根系生长，根系干重增加可达30％以上；水稻分蘖数增加20％以上；水稻的产量提高10％以上；同时能够使收获水稻植株中全氮含量增加7.4％、全磷含量增加7.41％、全钾含量增加3.72％、全硅含量增加7.89％。

Description

一株胶冻样芽孢杆菌及其用途

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一株胶冻样芽孢杆菌，还涉及所述胶冻样芽孢杆菌作为生物硅肥的用途。

【背景技术】

硅在国际土壤界被列为继氮、磷、钾之后的第四大元素肥料。主要用于水稻、小麦、玉米等喜硅作物，尤其是水稻对硅最敏感。水稻素有硅酸植物之称，在缺硅土壤上施用硅肥可以增加水稻分蘖数，提高有效收获穗数，还可以提高结实率，促进干物质的累积进而增加产量，并有改善米质的作用；另外，硅肥抗稻瘟病的效果最显著，主要表现为增加水稻自身抗病能力，即使水稻感染某些病害，也可以使病斑硅质化，控制病斑发展；其次是抗褐变穗、纹枯病。

目前，田间施用的硅肥主要是含硅酸盐的工业废渣，如钢铁冶炼渣、炼铜渣、炼铝赤泥、粉煤灰硅钙肥和黄磷渣以及水泥窑灰和硅镁钾肥等，这些肥料的有效硅含量不稳定，而且其中的重金属离子也难以除去。所以长期施用这些肥料会对土质造成严重的影响。

土壤中含有大量的硅，二氧化硅重量百分含量是20％-80％，但其绝大部分处于结晶体中，不能被植物吸收利用。土壤有效硅是指能被当季作物吸收利用的硅，其中包括土壤溶液中的单硅酸及各种易于转化为单硅酸的硅形态，例如多硅酸、交换态硅以及一部分胶态硅等。

胶冻样芽孢杆菌通常又称之为硅酸盐细菌，其重要特性是能够分解长石、云母等矿物，释放出钾和硅，也能分解磷灰石，释放出磷，还能够分泌出植物生长刺激素及多种酶，增强作物对一些病害的抵抗力。目前，这类细菌是用作生物肥料的最好菌种，它能够促进土壤无效硅磷钾的转化，增加土壤硅磷钾的供给，提高作物产量。

CN101781152A公开了一种多效活性硅肥及其生产工艺，它主要以富含二氧化硅的固体废弃物或矿物为原料，经过理化处理后复配具有溶硅能力的硅酸盐细菌及其保护促进剂并选择性地添加作物生长所需营养元素。该肥料产品可直接使用或掺混其他化肥、复合肥或有机肥料使用，可获得显著的增产增收、抗病抗逆、改良品质的综合效果。

CN1504563A公开了一种生产高密度硅酸盐细菌菌剂的工艺。该种微生物为胶质芽孢杆菌。通过固体发酵方法生产出高密度的胶质芽孢杆菌菌剂。

CN1379083公开了硅酸盐细菌及含有硅酸盐细菌的肥料，该菌是土壤芽胞杆菌。菌体为长杆状(1.0-1.5×3-5μm)，两端钝圆，幼龄时周生鞭毛，革兰氏反应阴性，菌体外有肥厚的荚膜，菌体内往往有1-2个颗粒体。具有高效分解释放矿物和土壤中钾、磷，固定空气中的氮素，产生多种生理活性物质的能力。以该细菌为有效成分的生物钾肥，可改善作物钾素营养，提高作物产量和品质，改良土壤。

本发明提供一株具有较强解硅能力的胶冻样芽孢杆菌，该菌施入土壤后能有效地分解含硅矿物。该胶冻样芽孢杆菌菌株对以后微生物肥料的生产具有非常重要的指导意义。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一株具有较强解硅能力的胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，其保藏编号CGMCCNO.4667。

本发明的另一个目的是所述胶冻样芽孢杆菌在制备微生物肥料中的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一株胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，它已于2011年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号CGMCC No.4667。

本发明胶冻样芽孢杆菌CGMCC No.4667的获得方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、制备出发型菌株的菌悬液

挑取出发菌株ACCC 10013单菌落，接入由酵母浸膏粉5g/l、蛋白胨10g/l与氯化钠5g/l，pH7.2-7.4组成的简单培养基中，在温度32℃与180rpm的条件下恒温摇床上培养16-20h；然后，取5ml培养菌液加到装有玻璃珠和45ml无菌水三角瓶中，以转速180rpm进行震荡培养20min，制成均匀的菌悬液，再用无菌水稀释至10^-4后备用；

B、紫外线诱变及强解硅性能菌株的选育

将步骤(A)制备的菌悬液加入到平板中，菌液厚度为0.2cm，让其在距20瓦紫外灯30cm处照射5min，进行紫外诱变，紫外诱变结束后，立即将该菌液涂布在含有二氧化硅的固体培养基上，在温度28℃恒温培养箱中避光培养5-7d；

所述的固体培养基是由蔗糖10-20g/l、磷酸氢二钾0.5-5g/l、氯化钠0.2-5g/l、二氧化硅1-10g/l、硫酸镁0.2-5g/l、碳酸钙1-10g/l、酵母膏0.4-5g/l、琼脂粉18g/l，pH7.2-7.4组成的；

C、摇瓶解硅能力的验证

挑取在步骤(B)得到的解硅圈透明带最大6mm单菌落接入种子培养基中，同时挑取其他解硅圈透明带较窄的2、3、4mm的三个单菌落进行对照试验，使用恒温摇床在温度32℃与180rpm的条件下培养3d，然后取发酵液10ml，稀释2倍，在12000-18000rpm的条件下离心5min，去除菌体；取上清液，然后测定该上清液中可溶性硅含量；根据该上清液中可溶性硅含量判断这些菌的解硅能力大小；

所述的种子培养基是由淀粉5-20g/l、磷酸氢二钾3-10g/l、硫酸铵1-5g/l、酵母膏0.5-5g/l、蔗糖3-10g/l、硫酸镁2-5g/l、碳酸钙1-5g/l、二氧化硅1-10g/l、三氯化铁0.02-1g/l，pH7.2-7.4组成的。

所述胶冻样芽孢杆菌CGMCC No.4667的培养方法，其特征在于该方法步骤如下：

(1)菌种活化：接种胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667至斜面培养基，在温度28℃下培养48h；

所述的斜面培养基组成如下：蔗糖10-20g/l、磷酸氢二钾0.5-5g/l、氯化钠0.2-5g/l、二氧化硅1-10g/l、硫酸镁0.2-5g/l、碳酸钙1-10g/l、酵母膏0.4-5g/l、琼脂粉10-20g/l，pH7.2-7.4；

(2)种子培养：在500ml三角瓶中装入100ml液体种子培养基，灭菌，然后把步骤(1)得到的活化菌种接至种子培养基中，在温度32℃与180rpm的条件下培养16-20h，制得种子液；

所述种子培养基组成如下：淀粉5-20g/l、磷酸氢二钾3-10g/l、硫酸铵1-5g/l、酵母膏0.5-5g/l、蔗糖3-10g/l、硫酸镁2-5g/l、碳酸钙1-5g/l、二氧化硅1-10g/l、三氯化铁0.02-1g/l，pH 7.2-7.4；

(3)发酵培养：将培养好的种子液取5ml接入100ml发酵培养基中，在温度32℃恒温摇床中180rpm培养10h，得到发酵液；

所述发酵培养基组成如下：蔗糖1-5g/l、磷酸氢二钾1-5g/l、酵母膏0.7-5g/l、硫酸铵0.2-5g/l、大豆蛋白胨1-5g/l、硫酸镁0.2-5g/l，pH7.2-7.4。

本发明还涉及所述胶冻样芽孢杆菌在制备微生物肥料中的用途。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的微生物肥料是微生物硅肥。

下面将更详细地描述本发明。

本发明是以ACCCl0013胶冻样芽孢杆菌菌株作为出发型菌株，通过紫外诱变方法，以平板解硅圈大小进行特征菌落挑选，再通过摇瓶解硅实验进行验证，并在土壤中进行解硅能力的测定，最终获得了这株胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，该菌株已于2011年3月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.4667。

所述的胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC 4667具有如下特征：

1)菌体形态特征：菌体粗、稍弯曲长杆状，有厚荚膜。菌体大小为(1.0～1.2)×(2.5～7.0)μm；

2)芽孢形态特征：芽孢囊微膨大。椭圆形中生，芽孢内不着色。

3)菌落形态特征：在硅酸盐细菌专用培养基平板上菌落为圆形，如半粒玻璃球；凸起，凸起度大于45度；无色透明，5-6天后中部有淡黄色的浑浊点，边缘透明；表面光滑，粘稠，弹性大，可拉成丝状。好氧或兼性厌氧生长。

4)生理生化特性：革兰氏染色阴性，在植物根际具有解磷、解钾、解硅矿物作用，有一定固氮作用。

5)微生物学特征：好氧或兼性厌氧生长，接触酶反应阳性，氧化酶或卵磷脂酶反应阴性，在无氮培养基上生长良好，能很好地利用葡萄糖、蔗糖作为碳源，在酵母浸膏粉蛋白胨氯化钠培养基中生长略弱，只能形成很薄的荚膜，能水解淀粉，生长温度10-45℃。

ACCC10013胶冻样芽孢杆菌菌株作为出发型菌株进行诱变步骤如下：

A、制备出发型菌株的菌悬液：

挑取出发菌株(ACCC 10013)单菌落，接入下面将要描述的简单培养基(a)中，在32℃与180rpm的恒温摇床上培养16-20h。然后，取5ml培养菌液加到装有一些玻璃珠和45ml无菌水三角瓶中，以转速180rpm进行振荡培养20min，制成均匀的菌悬液，再用无菌水稀释至10^-4后备用。

所述培养时所使用的培养装置是本技术领域的技术人员熟知的培养装置。胶冻样芽孢杆菌平板培养设备可以是恒温培养箱，像实验室用的恒温培养箱，例如上海森信实验仪器有限公司，上海人和科学仪器有限公司生产的恒温培养箱。菌悬液制备使用恒温摇床，例如北京安必升发展有限公司，北京恒奥科技有限公司等销售的恒温摇床。

B、紫外线诱变及强解硅性能菌株的选育

将步骤(A)制备的菌悬液加入到平板中，菌液厚度为0.2cm，让其在距20瓦紫外灯30cm处照射5min，进行紫外诱变，紫外诱变结束后，立即将该菌液涂布在下面将要描述的含有二氧化硅的固体培养基(b)上，在28℃恒温培养箱中避光培养5-7d。

使用的诱变设备是本技术领域技术人员熟知的超净工作台，例如北京昌平长城空气净化设备工程公司生产的超净工作台。使用的玻璃仪器和实验工具都是本技术领域技术人员熟知的实验室常用器具，如三角瓶，平板，酒精灯，玻棒等。

胶冻样芽孢杆菌在含有石英粉、长岭石、玻璃粉等含有二氧化硅的培养基中能够合成出有机酸、氨基酸、多糖等各种代谢产物。摇瓶试验表明，这些有机酸、氨基酸、多糖代谢产物具有络合矿物中各种金属离子的有机基团，并且它们本身也具有一定的酸溶作用，因此它们均能够破坏高岭石晶体结构，释放出其晶体中存在的铝、硅。这些试验还表明，各种代谢产物在浸出硅酸盐矿物时具有一种协同作用，三者混合物的浸出硅酸盐矿效果明显好于它们各自效果(参见文献：孙德四、张贤珍、张强，“硅酸盐细菌代谢产物对硅酸盐矿物的浸溶作用研究”，《矿冶工程》2006年第26卷第3期)，所以在初筛固体平板培养基中加入二氧化硅，经过培养后在平板上会出现明显的解硅透明圈。

经过5-7d的培养后，平板上会出现明显的环状解硅圈透明带，根据紫外光诱变效果差异，解硅圈透明带宽度2-5mm，经过二十多次反复实验，终于发现一株透明带宽约6mm的单菌落，挑取该单菌落进行下一步的摇瓶验证试验。

C、摇瓶解硅能力的验证

挑取解硅圈6mm的单菌落接入种子培养基(c)中，同时挑取其他透明带较窄的2、3、4mm的三个单菌落做对照试验，使用恒温摇床在温度32℃与180rpm的条件下培养3d，然后取发酵液10ml，稀释2倍，在12000-18000rpm的条件下离心5min，去除菌体。取上清液，然后采用本技术领域技术人员熟知的钼蓝比色法(参见“土壤农化分析第三版”，中国农业出版社出版，2000年)测定该上清液中的可溶性硅。根据在该上清液中可溶性硅含量可以判断这些菌的解硅能力大小。

在本发明中，所用的离心设备为sigma公司生产的离心机，也可以使用其他公司生产的同类产品，例如上海化工机械厂、长沙英泰仪器有限公司等销售的离心机。

经过测定，本发明的胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667在摇瓶中的解硅能力可以达到25.6μg/ml，比所述的出发菌株(摇瓶解硅能力4.8μg/ml)提高了533％，比其他对照菌株分别提高了(解硅圈2mm的单菌落摇瓶解硅能力14.79μg/ml)173％，(解硅圈3mm的单菌落摇瓶解硅能力16.8μg/ml)152％与(解硅圈4mm的单菌落摇瓶解硅能力为21.33μg/ml)120.7％。

本发明胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667培养方法的步骤如下：

(1)菌种活化：接种胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667至斜面培养基(b)，在温度28℃下培养48h。使用的培养设备与前面提到的恒温培养箱相同，使用的实验器具为常用的实验室器具，例如接种环，玻璃试管，酒精灯等。

(2)种子培养：在500ml三角瓶中装入100ml液体种子培养基(c)，灭菌，然后把步骤(1)得到的活化菌种接至种子培养基(c)中，在温度32℃与180rpm的条件下培养16-20h，制得种子液。其中灭菌使用的灭菌锅是一般化验室所使用的普通型号灭菌锅，例如北京华威兴业厂，北京京仪东方科技有限公司等销售的灭菌锅。恒温培养使用的恒温摇床与前面提到的相同。

(3)发酵培养：将培养好的种子培养液取5ml接入发酵培养基中(500ml三角瓶装100ml培养液)，将接好种的发酵液放入32℃恒温摇床中180rpm培养10h，即获得发酵液。

本发明胶冻样芽孢杆菌CGMCC 4667培养使用的培养基组成如下：

(a)简单培养基：酵母浸膏粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l，pH7.2-7.4。

(b)斜面培养基(与固体平板培养基相同)：蔗糖10-20g/l、磷酸氢二钾0.5-5g/l、氯化钠0.2-5g/l、二氧化硅1-10g/l、硫酸镁0.2-5g/l、碳酸钙1-10g/l、酵母膏0.4-5g/l、琼脂粉18g/l，pH7.2-7.4。

(c)种子培养基：淀粉5-20g/1、磷酸氢二钾3-10g/l、硫酸铵1-5g/l、酵母膏0.5-5g/l、蔗糖3-10g/l、硫酸镁2-5g/l、碳酸钙1-5g/l、二氧化硅1-10g/l、三氯化铁0.02-1g/l，pH 7.2-7.4。

(d)发酵培养基的成分为：蔗糖1-5g/l、磷酸氢二钾1-5g/l、酵母膏0.7-5g/l、硫酸铵0.2-5g/l、大豆蛋白胨1-5g/l、硫酸镁0.2-5g/l、pH7.2-7.4。

其中所涉及的各种实验药品试剂均为普通的实验用试剂，在化学试剂公司均可购买到。例如所用酵母浸膏粉是由北京奥博星公司生产销售的，氯化钠、七水硫酸镁等是从秦皇岛化学试剂公司直接购得的。

本发明还涉及胶冻样芽孢杆菌菌株CGMCC 4667在制备微生物肥料中的用途，特别地在制备微生物硅肥中的用途。

下面对本发明胶冻样芽孢杆菌菌株CGMCC 4667进行了土壤培养试验与水稻盆栽试验。

一、胶冻样芽孢杆菌的土壤培养试验

试验步骤如下：

(1)取水稻土阴干，过2mm筛；

(2)测定该水稻土的饱和含水量；

土壤饱和含水量测定方法如下：

取一定量试验土壤放入布什漏斗中，不断加水至基本不再滴水，过夜。取试验土放入铝盒中称重后用酒精灼烧至干，再称重。根据试验前后土壤重量计算含水量。

(3)菌剂解硅

制备胶冻样芽孢杆菌菌剂：草炭与胶冻样芽孢杆菌种子液重量比5∶2的条件下用草炭吸附在前面制备的胶冻样芽孢杆菌种子液上；

取两份上述水稻土500g，分别加入2g胶冻样芽孢杆菌ACCC 10013菌剂和本发明胶冻样芽孢杆菌CGMCCNO.4667菌剂，完全混匀后装入500ml烧杯中，加水至土壤达到饱和含水量状态，烧杯口用塑料膜封口后扎少量孔，最后放到25℃培养箱中，分别在第1、2、4、6、8周测定土壤中有效硅、水溶性硅含量。

根据“土壤农化分析”(中国农业出版社，2000年，第三版)描述的钼蓝比色法测定有效硅、水溶性硅含量。

与此同时进行不加胶冻样芽孢杆菌菌剂的对照试验，试验步骤与前面相同。

二、胶冻样芽孢杆菌的水稻盆栽试验

1)取水稻土阴干，过2mm筛；

2)测定该土的饱和含水量，测定方法同前；

3)试验处理

注：基肥含量：N：0.15g/kg土；P₂O₅：0.1g/kg土；K₂O：0.15g/kg土

4)检测指标：

苗期：植株全氮、磷、钾、硅含量；

分蘖期：植株全氮、磷、钾、硅含量；

成熟期：植株全氮、磷、钾、硅含量；分蘖数、根重、产量。

硅含量根据“土壤农化分析”(中国农业出版社出版，2000年，第三版)描述的钼蓝比色法测定。

植物中其它常量元素含量根据“土壤农化分析”(中国农业出版社出版社，2000年，第三版)描述的方法测定。

通过该菌株在土壤中的培养试验和水稻的盆栽试验，证明该菌株能使土壤中有效硅、水溶性硅的含量提高20％以上，同时能促进根系生长，植物根系干重增加30％以上；增加水稻分蘖数20％以上；使水稻产量提高10％以上；同时能够使收获水稻植株中全氮含量增加7.4％、全磷含量增加7.41％、全钾含量增加3.72％、全硅含量增加7.89％。该胶冻样芽孢杆菌菌株可以在生产微生物肥料中发挥非常重要的作用，具有极其重要的实际应用意义。

[有益效果]

本发明提供的胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667是由胶冻样芽孢杆菌ACCC 10013菌株经过紫外诱变后获得的，胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667的解硅能力达到25.6μg/ml，而原菌株仅为4.8μg/ml。土壤解硅试验和盆栽试验表明，本发明菌种在土壤中2个月可使有效硅、水溶性硅量提高20％以上。同时能促进根系生长，根系干重增加可达30％以上；增加水稻分蘖数20％以上；使水稻的产量提高10％以上；同时能够使收获水稻植株中全氮含量增加7.4％、全磷含量增加7.41％、全钾含量增加3.72％、全硅含量增加7.89％。

一株胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，它已于2011年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号CGMCC No.4667。

【具体实施方式】

下面将通过实施例更详细地说明本发明。

实施例1：胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667培养

(1)菌种活化：

制备含有下述成分的斜面培养基：蔗糖10g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、氯化钠0.2g/l、二氧化硅1g/l、硫酸镁0.2g/l、碳酸钙1g/l、酵母膏0.4g/l、琼脂粉18g/l，pH 7.2；

挑取胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667一环于所述斜面培养基上，将接种好的斜面放入恒温培养箱中在温度28℃下进行培养48h。

(2)种子培养：

制备含有下述成分的种子培养基：淀粉5g/l、磷酸氢二钾3g/l、硫酸铵1g/l、酵母膏0.5g/l、蔗糖3g/l、硫酸镁2g/l、碳酸钙1g/l、三氯化铁0.02g/l、二氧化硅1g/l，pH7.2；

取步骤(1)活化胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667一环接种于所述的种子培养基中(500ml三角瓶装100ml培养液)，将接种好的种子培养液放入温度32℃恒温摇床中在180rpm条件下培养16h。

(3)发酵培养：

制备含有下述成分的发酵培养基：蔗糖1g/l磷酸氢二钾1g/l、酵母膏0.7g/l硫酸铵0.2g/l、大豆蛋白胨1g/l、硫酸镁0.2g/l，pH7.4；

将培养好的种子培养液取5ml接入上述发酵培养基中(500ml三角瓶装100ml培养液)，将接好种的发酵液放入温度32℃恒温摇床中在180rpm条件下培养10h，得到胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667发酵液。

实施例2胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667的诱变及平板初筛

(1)制备出发型菌株的菌悬液：

挑取出发菌株ACCC 10013单菌落，接入简单培养基(酵母浸膏粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，pH7.2-7.4)中，在32℃180rpm恒温摇床上培养18h后可用。取5ml培养好的菌液装入有玻璃珠和45ml无菌水三角瓶中，以180rpm的转速震荡20min，制成均匀的菌悬液并稀释至10^-4后备用。

(2)紫外线诱变及强解硅性能菌株的选育

将步骤(1)制备好的菌悬液加入到平板中，菌液的厚度为0.2cm，让其在距离20瓦紫外灯30cm处照射5min，进行紫外诱变，诱变结束后立即将菌液涂布于含有二氧化硅的固体培养基上，固体培养基的成分为：蔗糖10g/l、磷酸氢二钾5g/l、氯化钠0.2g/l、二氧化硅1g/l、硫酸镁0.2g/l、碳酸钙10g/l、酵母膏0.4g/l、琼脂粉18g/l，pH 7.2；在恒温28℃下避光培养5-7d。

(3)平板初筛

将步骤(2)中培养好的平板取出，观察诱变后的平板与对照平板的区别，对照平板上有菌体长出，并有较小的解硅圈形成，解硅圈的透明带宽1-2mm不等在经过紫外照射的平板上有的没有菌体长出，有的长出菌体，透明带的宽度1-4mm不等。

(4)摇瓶解硅能力的验证

挑取解硅圈最大的4mm单菌落接入种子培养基(种子培养基：淀粉5g/l、磷酸氢二钾10g/l、硫酸铵1g/l、酵母膏5g/l、蔗糖3g/l、硫酸镁5g/l、碳酸钙1g/l、三氯化铁0.02g/l、二氧化硅1g/l，pH7.2)中，在恒温摇床上32℃180rpm培养3d后，取发酵液10ml，稀释2倍，15000rpm离心5min，去除菌体。取上清液，采用本说明书中说明的钼蓝比色法对上清液中的可溶性硅进行测定。

经过测定，在摇瓶中的解硅能力可达16.8μg/ml

实施例3胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667的诱变及平板初筛

(1)制备出发型菌株的菌悬液：

挑取出发菌株(ACCC 10013)单菌落，接入简单培养基(酵母浸膏粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，pH7.2)中，在32℃180rpm恒温摇床上培养16-20h后可用。取5ml培养好的菌液装入有玻璃珠和45ml无菌水三角瓶中，以180rpm的转速震荡20min，制成均匀的菌悬液并稀释至10^-4后备用。

(2)紫外线诱变及强解硅性能菌株的选育

将步骤(1)制备好的菌悬液加入到平板中，菌液的厚度为0.2cm，让其在距离20瓦紫外灯30cm处照射5min，进行紫外诱变，诱变结束后立即将菌液涂布于含有二氧化硅的固体培养基上，固体培养基的成分为：蔗糖20g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、氯化钠5g/l、二氧化硅1g/l、硫酸镁5g/l、碳酸钙1g/l、酵母膏5g/l、琼脂粉18g/l，pH 7.2；在恒温28℃下避光培养5-7d。

(3)平板初筛

将步骤(2)中培养好的平板取出，观察诱变后的平板与对照平板的区别，对照平板上有菌体长出，并有较小的解硅圈形成，解硅圈的透明带宽1-2mm不等，在经过紫外照射的平板上有的没有菌体长出，有的长出菌体，透明带的宽度1-6mm不等。

(4)摇瓶解硅能力的验证

挑取解硅圈最大的6mm单菌落接入种子培养基(种子培养基：淀粉20g/l、磷酸氢二钾3g/l、硫酸铵5g/l、酵母膏0.5g/l、蔗糖10g/l、硫酸镁2g/l、碳酸钙5g/l、三氯化铁1g/l、二氧化硅1g/l，pH7.2)中，在恒温摇床上32℃180rpm培养3d后，取发酵液10ml，稀释2倍，15000rpm离心5min，去除菌体。取上清液，采用本说明书中说明的钼蓝比色法对上清液中的可溶性硅进行测定。

经过测定，在摇瓶中的解硅能力可达25.6μg/ml。

实施例4胶冻样芽孢杆菌的土壤培养试验

1)取秦皇岛青石山水稻土(碱解氮：57.7mg/kg；有效磷：18.6mg/kg；有效钾：118.2mg/kg；有机质：2.5％；pH：5.6；有效硅：102mg/kg；可溶性硅：28.9mg/kg)阴干，过2mm筛；

2)测定该水稻土的饱和含水量；

土壤饱和含水量测定方法如下：

取一定量试验土壤放入布什漏斗中，不断加水至基本不再滴水，过夜。取试验土放入铝盒中称重后用酒精灼烧至干，再称重。根据试验前后土壤重量计算含水量，测得该水稻土饱和含水量是33％

3)取2份水稻土500g，分别加入2g胶冻样芽孢杆菌菌剂(制备菌剂所用的菌株为胶冻样芽孢杆菌ACCC 10013(I)和本发明的胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667(II))完全混匀后装入500ml烧杯中，加水至土壤达到饱和含水量状态，烧杯口用塑料膜封口后扎少量孔，最后放到25℃培养箱中，分别在第1、2、4、6、8周测定土壤中有效硅、水溶性硅含量。

4)胶冻样芽孢杆菌制备过程：按照草炭与菌株发酵液重量比5∶2，分别用草炭吸附按照实施例同样方式制备的胶冻样芽孢杆菌ACCCl0013发酵液，与实施例1制备的胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667发酵液，这些发酵液用轻质碳酸钙调节pH在6.5左右。

同时做对照试验CK，不加胶冻样芽孢杆菌菌剂。

结果见表1和2：

表1：土壤中有效硅含量测对比试验

表2：土壤中水溶性硅含量测定值

由表1和2的结果清楚地看出，胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667在两个月中可将土壤中有效硅、水溶性硅含量提高20％以上，胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667的解硅效果要明显优于胶冻样芽孢杆菌ACCC10013。

实施例5：胶冻样芽孢杆菌的水稻盆栽试验

2)测定该土的饱和含水量(方法同上)；

3)试验处理

注：基肥为：N：0.15g/kg土；P₂O₅：0.1g/kg土；K₂O：0.15g/kg土；所用胶冻样芽孢杆菌菌剂由经过紫外诱变后获得的CGMCC NO.4667胶冻样芽孢杆菌菌株制成。

4)胶冻样芽孢杆菌菌剂制备：按照草炭与菌株发酵液重量比5∶2，用草炭吸附实施例1制备的胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667发酵液，其发酵液用轻质碳酸钙调节pH在6.5左右。

同时做对照试验CK，不加胶冻样芽孢杆菌菌剂。

5)检测指标：

苗期：植株全氮、磷、钾、硅含量；

分蘖期：植株全氮、磷、钾、硅含量；

试验结果见表3、表4、表5。

表3：水稻根、穗、分蘖数测定值

表4：水稻植株全钾、全氮测定值

表5：水稻植株全磷、全硅测定值

由表3-5的结果非常清楚地表明，本发明胶冻样芽孢杆菌CGMCC NO.4667能促进根系生长，根系干重增加可达30％以上；增加水稻分蘖数20％以上；使水稻的产量提高10％以上；同时能够使收获水稻植株中全氮含量增加7.4％、全磷含量增加7.41％、全钾含量增加3.72％、全硅含量增加7.89％。

Claims

1.一株胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，它已于2011年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号CGMCC No.4667。

2.根据权利要求1所述胶冻样芽孢杆菌CGMCC No.4667的获得方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、制备出发型菌株的菌悬液：

挑取出发菌株ACCC 10013单菌落，接入由酵母浸膏粉5g/l、蛋白胨10g/l与氯化钠5g/l，pH7.2-7.4组成的简单培养基中，在温度32℃与180rpm的条件下恒温摇床上培养16-20h；然后，取5ml培养菌液加到装有玻璃珠和45ml无菌水三角瓶中，以转速180rpm进行振荡培养20min，制成均匀的菌悬液，再用无菌水稀释至10^-4后备用；

B、紫外线诱变及强解硅性能菌株的选育

C、摇瓶解硅能力的验证

挑取在步骤(B)得到的解硅圈透明带最大6mm单菌落接入种子培养基中，同时挑取其他解硅圈透明带较窄的2、3、4mm的三个单菌落进行对照试验，使用恒温摇床在温度32℃与180rpm的条件下培养3d，然后取发酵液10ml，稀释2倍，在12000-18000rpm的条件下离心5min，去除菌体；取上清液，然后测定该上清液中的可溶性硅；根据在该上清液中可溶性硅含量判断这些菌的解硅能力大小；

3.根据权利要求1所述胶冻样芽孢杆菌CGMCC No.4667的培养方法，其特征在于在于该方法步骤如下：

(2)种子培养：在500ml三角瓶中装入100ml液体种子培养基，灭菌，然后把步骤(1)得到的活化菌种接至种子培养基(c)中，在温度32℃与180rpm的条件下培养16-20h，制得种子液；

所述发酵培养基组成如下：蔗糖1-5g/l、磷酸氢二钾1-5g/l、酵母膏0.7-5g/l、硫酸铵0.2-5g/l、大豆蛋白胨1-5g/l、硫酸镁0.2-5g/l，pH7.2-7.4。。

4.根据权利要求1所述的胶冻样芽孢杆菌在制备微生物肥料中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的微生物肥料是微生物硅肥。