CN103409345A - 一种海洋交替假单胞菌的发酵培养方法 - Google Patents

一种海洋交替假单胞菌的发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种海洋细菌交替假单胞菌的培养方法，步骤如下：取活化后的海洋交替假单胞菌，按重量百分比1.0%～5.0%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度20℃～40℃、转速120～260r/min、装液体积百分比10%～30%的条件下，发酵培养15～28h，即可；本发明还涉及海洋细菌交替假单胞菌的专用发酵培养基。通过优化后的发酵条件和培养基，海洋交替假单胞菌可良好生长，平均菌浓能够达到4.2×1011个/mL，较现有使用的海水发酵培养基与发酵条件，菌液浓度提高1～3个数量级。

Description

一种海洋交替假单胞菌的发酵培养方法
技术领域
本发明涉及一种海洋交替假单胞菌的发酵培养方法，特别涉及一种鱼用细菌疫苗海洋交替假单胞菌优化发酵条件后的发酵培养方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
早在1942年，Duff首次应用灭活的杀鲑产气单胞菌口服免疫硬头鳟获得成功。虽然该实验未能被后人重复证实，但毕竟开创了疫苗在鱼类应用上的新纪元。此后许多人探索性的研究、制备疫苗，对那些爆发性和难以用药物防治的鱼病进行免疫预防。其中弧菌病菌苗、肠道性红嘴病（ERM）菌苗等获得了成功。1975年，美国疫苗有限公司（AVL）开始生产商品型鱼用疫苗。1984年2月，首次鱼用疫苗接种研讨会在法国巴黎举行。这次会议是鱼用疫苗发展史上的一个重要里程碑。从此，新技术、新方法逐渐被用于病毒病疫苗、高效价菌苗的研制。
我国对鱼类疫苗研究起步较晚，始于1955年，进展较慢。其中，草鱼出血症疫苗的研制代表了我国水产疫苗从低级向高级发展的历史历程。经过30余年的发展，针对草鱼出血症先后研制出4种开创性疫苗。经过实验探索、生产应用，鱼类疫苗的研究已进入用新技术和新方法研制高效疫苗的时期。到目前为止，我国获得国家新兽医证书的水产疫苗产品仅有三种，分别是草鱼出血病细胞灭活疫苗、鱼嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗和牙鲆溶藻弧菌、鳗弧菌、迟缓爱德华菌病多联抗独特型抗体疫苗，同发达国家相比有较大差距。此外，迄今为止尚有许多鱼类疾病的病原菌还不能分离培养并鉴定；有些鱼类的病原菌还不能被直接灭活制成疫苗；这些导致我国水产疫苗的研制发展缓慢，每年的鱼类病害造成的损失巨大。
鱼用疫苗在防病效果上具有不可替代性的优点。首先，鱼用疫苗能有效地保护环境和食用鱼的品质，安全的鱼用疫苗使用后没有污染，在鱼体内没有残留，不会对鱼体产生耐药性；其次，对有些难以用药物防治的鱼病，使用鱼用疫苗是有效的方法之一；再次，随着养殖的强化，大水面鱼病的暴发呈上升趋势，从经济的角度考虑，应用鱼用疫苗免疫预防是一个有效的措施；最后随着研究的深入，联苗、多价疫苗以及基因工程疫苗的应用，它们的防病效果将会大大超过化学药品等其它防治措施，提高经济效益。
海洋细菌交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)分离自海洋，由于其具有杀灭鳗弧菌等引起水产养殖动物疾病的病原菌，因此被广泛的研究利用于鱼用疫苗的研制工作中。
中国专利文献CN102266356A（申请号201110215570.9）公开了一种微生物杀菌剂的制备方法，属微生物发酵工业领域。本发明公开了一种利用假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)制备鳗弧菌杀菌剂的方法，由(1)菌种的斜面活化培养，(2)液体发酵培养，(3)发酵液粗提，(4)抑菌剂的制备等步骤组成。
目前,假交替单胞菌的培养发酵主要为2216E培养基、Zobel2216E培养基或EM培养基等海水培养基。如中国专利文献CN102942516A（申请号201210437136.X）公开了将假交替单胞菌保藏号为CGMCC No.6555划线接种到固体斜面培养基上，于30℃，培养1天后，接种1个菌落到EM培养基中，于30℃，150rpm下摇床培养7天，获得发酵产物的步骤。
上述海水培养基是为了模拟假交替单胞菌的生存环境，从而有利于其生长。但上述培养条件由于培养速度慢，已无法适应大规模工业化生产的需要。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，本发明提供一种海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法。
术语说明
海洋交替假单胞菌：生长于海洋中的交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）。
本发明的技术方案如下：
一种海洋交替假单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：
取活化后的海洋交替假单胞菌，按重量百分比1.0%～5.0%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度20℃～40℃、转速120～260r/min，装液体积百分比10%～30%，发酵培养15～28h，即可；
上述低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨5～50g、酵母浸粉0.1～15g、NaCl浓度为5～30g、蔗糖5～50g、FeCl30.01～1g，水定容至1L，pH7～8。
根据本发明优选的，低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨5～30g、酵母浸粉0.1～10g、NaCl浓度为10～20g、蔗糖5～30g、FeCl30.01～0.5g，水定容至1L，pH7.5。
根据本发明优选的，所述的水为自来水、去离子水或蒸馏水。
根据本发明优选的，所述的海洋交替假单胞菌为海洋细菌交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）、游海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis）或海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas marina）。
根据本发明优选的，按重量百分比1.0%～3.0%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度20℃～35℃，转速120～200r/min和装液体积百分比10%～20%，发酵培养15～25h，即可。
一种海洋交替假单胞菌的发酵培养基，每升组分如下：
蛋白胨5～50g、酵母浸粉0.1～15g、NaCl浓度为5～30g、蔗糖5～50g、FeCl30.01～1g，水定容至1L，pH7～8。
根据本发明优选的，低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨5～30g、酵母浸粉0.1～10g、NaCl浓度为10～20g、蔗糖5～30g、FeCl30.01～0.5g，水定容至1L，pH7.5。
有益效果
通过优化后的发酵条件和培养基，海洋交替假单胞菌可良好生长，平均菌浓能够达到4.2×1011个/mL，较现有使用的海水发酵培养基与发酵条件，菌液浓度提高1～3个数量级。
附图说明
图1是不同盐浓度对海洋细菌交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）发酵液浓度的影响曲线；
其中：横坐标为盐浓度，单位g/ml；纵坐标为OD值；
图2是不同培养基对海洋细菌交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）发酵液菌浓度的影响曲线；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
测试菌株来源
实施例1～7及对比例1～4所述的海洋细菌交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心（MCCC），菌种保藏编号为：1A00511；
实施例8所述的游海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis）购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为：1.10250；
实施例9所述的海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas marina）购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为：1.10151。
1、盐浓度对培养结果的分析
实施例1
一种海洋细菌假交替单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：
取活化后的海洋细菌交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），按重量百分比1.5%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度29℃、转速180r/min，装液体积百分比20%，发酵培养18h，即可；
上述低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨12g、酵母浸粉0.8g、NaCl浓度为5g、蔗糖17.5g、FeCl30.015g，水定容至1L，pH7.5。
经检测，菌液OD值为0.75，菌液浓度为2.8×106个/ml。
实施例2
一种海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：
取活化后的海洋细菌交替假单胞菌，按重量百分比1.5%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度29℃、转速180r/min，装液量20%，发酵培养18h，即可；
上述低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨12g、酵母浸粉0.8g、NaCl浓度为10g、蔗糖17.5g、FeCl30.015g，水定容至1L，pH7.5。
经检测，菌液OD值为1.80，菌液浓度为4.2×1011个/ml。
实施例3
一种海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：
取活化后的海洋细菌交替假单胞菌，按重量百分比1.5%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度29℃、转速180r/min，装液量20%，发酵培养18h，即可；
上述低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨12g、酵母浸粉0.8g、NaCl浓度为15g、蔗糖17.5g、FeCl30.015g，水定容至1L，pH7.5。
经检测，菌液OD值为1.60，菌液浓度为4.0×109个/ml。
实施例4
一种海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：
取活化后的海洋细菌交替假单胞菌，按重量百分比1.5%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度29℃、转速180r/min，装液量20%，发酵培养18h，即可；
上述低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨12g、酵母浸粉0.8g、NaCl浓度为20g、蔗糖17.5g、FeCl30.015g，水定容至1L，pH7.5。
经检测，菌液OD值为1.50，菌液浓度为1.0×109个/ml。
实施例5
一种海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：
取活化后的海洋细菌交替假单胞菌，按重量百分比1.5%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度29℃、转速180r/min，装液量20%，发酵培养18h，即可；
上述低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨12g、酵母浸粉0.8g、NaCl浓度为25g、蔗糖17.5g、FeCl30.015g，水定容至1L，pH7.5。
经检测，菌液OD值为1.40，菌液浓度为3.9×108个/ml。
实施例6
一种海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：
取活化后的海洋细菌交替假单胞菌，按重量百分比1.5%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度29℃、转速180r/min，装液量20%，发酵培养18h，即可；
上述低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨12g、酵母浸粉0.8g、NaCl浓度为30g、蔗糖17.5g、FeCl30.015g，水定容至1L，pH7.5。
经检测，菌液OD值为1.20，菌液浓度为3.5×108个/ml。
对比例1
一种海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：
取活化后的海洋细菌交替假单胞菌，按重量百分比1.5%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度29℃、转速180r/min，装液量20%，发酵培养18h，即可；
上述低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨12g、酵母浸粉0.8g、NaCl浓度为35g、蔗糖17.5g、FeCl30.015g，水定容至1L，pH7.5。
经检测，菌液OD值为1.10，菌液浓度为3.8×107个/ml。
对比例2
一种海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：
如实施例1所述的海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，不同之处在于，低盐发酵培养基变为普通纯化水发酵培养基，每升组分如下：
蛋白胨12g、酵母浸粉0.8g、蔗糖17.5g、FeCl30.015g，纯化水定容至1L，pH7.5。
经检测，菌液OD值为0.26，菌液浓度为1.0×104个/ml。
对比例3
如实施例1所述的海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，不同之处在于，低盐发酵培养基变为普通LB发酵培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，调pH至7.5。
经检测，菌液OD值为1.0，菌液浓度为1.0×108个/ml。
对比例4
如实施例1所述的海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，不同之处在于，低盐发酵培养基变为海水发酵培养基，每升组分如下：
蛋白胨15g，酵母膏1g，蔗糖17.2g，FeCl30.01g，调整pH至7.6，加海水至1L。
经检测，菌液OD值为1.20，菌液浓度为3.5×108个/ml。
结果分析
由实施例1～7及对比例1绘制盐浓度对菌液浓度影响的曲线，如图1所示，横坐标为不同盐浓度的实施例1～7及对比例1、对比例2，纵坐标为对应的相同发酵条件下发酵后菌液的OD值。由图1可知，当盐浓度为10g/L时，菌液浓度最高，达到4.2×1011个/ml。而盐浓度低于10g/L时与高于10g/L时，菌液浓度上有明显的数量级差异。当达到35g/L（相当于海水盐浓度）时，菌液浓度最低为3.8×107个/ml。由此可见，盐浓度对菌液浓度有很大的影响。
由实施例2、对比例3和对比例4可以看出，在相同的培养条件下培养海洋细菌交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），分别取适量的菌液放于比色皿中，用分光光度计在630nm下测其发酵液的OD值。测定结果如图2所示。由图2可以看出，海洋细菌交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）在低盐浓度培养基（实施例2）中比在海水培养基（对比例3）和LB培养基（对比例2）中生长要好，这可能是因为海水的NaCl浓度较高，限制了细菌的分离增殖；而LB培养基的营养成分不如低盐浓度培养基成分丰富，故细菌生长较慢。因此，应采用低盐浓度培养基作为海洋细菌交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）的液体发酵培养基。
2、菌株对培养结果的影响
实施例8
如实施例2所述的海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，不同之处在于，菌株为游海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis）。
经检测，菌液浓度为3.5×1011个/ml。
实施例9
如实施例2所述的海洋细菌交替假单胞菌的发酵培养方法，不同之处在于，菌株为海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas marina）。
经检测，菌液浓度为3.0×1011个/ml。
由实施例8、9的结果可知，本发明的培养基不仅适用于海洋细菌交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）这一特定菌种，游海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis）与海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas marina）用本发明提供的培养基进行培养，其生长形态良好，通过吸光度检测，菌液浓度也能达到1011个/ml。

Claims (7)

1.一种海洋交替假单胞菌的发酵培养方法，步骤如下：
取活化后的海洋交替假单胞菌，按重量百分比1.0%～5.0%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度20℃～40℃、转速120～260r/min、装液体积百分比10%～30%的条件下，发酵培养15～28h，即可；
上述低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨5～50g、酵母浸粉0.1～15g、NaCl浓度为5～30g、蔗糖5～50g、FeCl30.01～1g，水定容至1L，pH7～8。
2.如权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述低盐发酵培养基每升组分如下：
蛋白胨5～30g、酵母浸粉0.1～10g、NaCl浓度为10～20g、蔗糖5～30g、FeCl30.01～0.5g，水定容至1L，pH7.5。
3.如权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述的水为自来水、去离子水或蒸馏水。
4.如权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述的海洋交替假单胞菌为海洋细菌交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）、游海假交替单胞菌（Pseudoalteromonashaloplanktis）或海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas marina）。
5.如权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，按重量百分比1.0%～3.0%接种于低盐发酵培养基中，在发酵温度20℃～35℃、转速120～200r/min和装液体积百分比10%～20%的条件下，发酵培养15～25h，即可。
6.一种海洋交替假单胞菌的发酵培养基，其特征在于，每升组分如下：
蛋白胨5～50g、酵母浸粉0.1～15g、NaCl浓度为5～30g、蔗糖5～50g、FeCl30.01～1g，水定容至1L，pH7～8。
7.如权利要求6所述的发酵培养基，其特征在于，每升组分如下：
蛋白胨5～30g、酵母浸粉0.1～10g、NaCl浓度为10～20g、蔗糖5～30g、FeCl30.01～0.5g，水定容至1L，pH7.5。
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