CN112481339A - 一种提高藻红蛋白产量的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提高藻红蛋白产量的制备方法，包括步骤一、混合顶丝藻、含游海假交替单胞菌的发酵菌液及海水，得顶丝藻菌液混合物；步骤二、将所述顶丝藻菌液混合物在一时间条件、一温度条件及一转速条件下发酵，使顶丝藻破碎释出藻红蛋白；本发明另提供一种细菌用于破碎顶丝藻的用途。

Description

一种提高藻红蛋白产量的制备方法
技术领域
本发明是关于一种提高藻红蛋白产量的制备方法，特别是关于利用细菌发酵来提高藻红蛋白产量的制备方法。
背景技术
藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)为藻胆蛋白(Phycobiliprotein)的一种，其为蓝绿藻、红藻、隐藻等藻类用于补光的光合色素蛋白。藻红蛋白因其光谱及荧光特性，已广泛被用于与荧光标记相关的应用中，诸如生物指针试剂、化学药品制剂、体外诊断标记、荧光检测探针等。近年来，亦有藻红蛋白被应用于食品、化妆品和保健品中。
然而，藻红蛋白虽具高产业利用性，却有生产技术门坎较高、产量低，导致其相关应用产品成本过高的隐忧。因此，如何降低藻红蛋白的生产成本、提高藻红蛋白的产量即成为相关应用领域急需解决的问题。
专利CN104130319B公开了一种藻红蛋白的萃取方法，其包含先将红藻加入-50℃～-10℃的冰粉中，在1000r/min～3000r/min的搅拌速度条件下进行破壁处理，得到含有藻红蛋白的破壁液；接着将得到的含有藻红蛋白的破壁液进行分离、纯化和干燥，得到藻红蛋白成品。
目前，藻红蛋白的取得主要是以紫菜、仙菜藻等大型红藻为原料，先对红藻进行物理性处理，包含利用反复冻融、超音波破碎等方式释出藻红蛋白后，再使用硫酸铵沉淀、离子交换层析等方法分离纯化出藻红蛋白。然而，因大型红藻的藻体形态多为叶状体，要使其破碎释出藻红蛋白具有一定困难度。此外，大型红藻类的醣类含量高，此导致后续的分离纯化程序较为困难。因此如何有效地破碎红藻，以使藻红蛋白产量提升，即为本发明所属技术领域所面临的另一个问题。
发明内容
本发明的发明人发现，顶丝藻(Acrochaetium sp.)虽属于红藻类，但是不同于传统所使用的大型红藻，顶丝藻的醣类含量少，且藻体为丝状体，非常适合作为取得藻红蛋白的原料。使用顶丝藻作为原料制备藻红蛋白，具有分离纯化较简单的优势，若能进一步提高制备可得到藻红蛋白产量，将对藻红蛋白的市场应用有很大的帮助。
基于上述发现，本发明的目的在于提供一种提高藻红蛋白产量的制备方法，包括：
步骤一、混合顶丝藻、发酵菌液及海水，得顶丝藻菌液混合物；
步骤二、将所述顶丝藻菌液混合物在时间条件、温度条件及转速条件下发酵，使顶丝藻破碎释出藻红蛋白；
其中所述发酵菌液包含游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)；
其中所述时间条件为6-78小时，所述温度条件为20-25℃，所述转速条件为100-500rpm。
为达前述发明目的，其中所述发酵菌液的OD600值为0.9～1.1。
为达前述发明目的，其中所述发酵菌液的OD600值为1。
为达前述发明目的，其中所述温度条件为22℃。
为达前述发明目的，其中所述转速条件为300rpm。
为达前述发明目的，其中所述时间条件为6-36小时。
为达前述发明目的，其中所述时间条件为24-30小时。
为达前述发明目的，其中所述顶丝藻：所述发酵菌液：所述海水的混合比例为2(g):1(mL):1(mL)。
为达前述发明目的，其中所述海水为人工海水或天然海水。
本发明另提供一种细菌用于破碎顶丝藻的用途，包括将顶丝藻与细菌混合发酵；其中所述细菌为游海假交替单胞菌。
本发明解决了先前技术中，藻类难以被破碎所导致的藻红蛋白产量不高问题。本发明所提供的方法不但可提高藻红蛋白的产量，且程序简单，容易达成，大幅降低了藻红蛋白生产技术门坎，有利于推动藻红蛋白在市场上的应用进展。本发明也解决了过去没有人使用游海假交替单胞菌作为用于破碎顶丝藻的用途的问题。
附图说明
图1为本发明实施例提供的顶丝藻发酵实验流程图；
图2为本发明实施例提供的时间条件对藻红蛋白产量的影响关系图。
具体实施方式
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属专业人士领域可共同了解的意义，其中单数用语“一”、“一个”、“该”、“所述”，除非另有说明，皆可指涉多于一个对象，此外，用语“包含”、“包括”皆为开放式连接词；另外，除非另有说明，本发明所用的材料皆市售易于取得。
术语“萃取”是指将一有效成份或活性成份从其他成份中分离出。
术语“破壁”是指将生物体细胞壁打破，让生物体内成份释放出细胞壁外。
术语“破碎”是指将打破生物体，让生物体内成份释放出细胞壁外。
术语“发酵”是指运用生物体使目标物质分解的反应过程，其中该生物体是包含但不限于细菌、酵母菌、植物细胞或微生物。
本发明是以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
本发明实施例所使用的顶丝藻为Acrochaetium formosanum，其是本发明所属技术领域中具有通常知识者可从天然海域中取得。本发明实施例是以Acrochaetiumformosanum予以示范阐明，但本发明不受Acrochaetium formosanum所限制，顶丝藻属(Acrochaetium)的物种或可生产藻红蛋白的顶丝藻皆应涵盖于本发明范围内。
本发明实施例所使用的细菌为标准菌株游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)(ATCC 14393)，其可于市面上购买取得。购买取得的菌株以冷冻保存，在使用前先经固态培养基(Marine agar)涂盘活化处理。
本发明的实施例提供的提高藻红蛋白产量的制备方法如图1所示，先使用游海假交替单胞菌制备发酵菌液，将该发酵菌液与一顶丝藻及一海水混合得一顶丝藻菌液混合物，然后将该顶丝藻菌液混合物在一温度条件及一转速条件下发酵，以破碎顶丝藻，接着取样进行藻红蛋白含量的检测以确认发酵最佳时间条件。
本发明所提供的提高藻红蛋白产量的制备方法，其实施方式包含：
步骤一、混合一顶丝藻、一含有游海假交替单胞菌的发酵菌液及一海水，得到一顶丝藻菌液混合物，其中该发酵菌液的OD600值为0.9～1.1，该发酵菌液的OD600值较佳为1，其中该顶丝藻：该发酵菌液：该海水的混合比例为2(g):1(mL):1(mL)；
步骤二、将该顶丝藻菌液混合物在一时间条件、一温度条件及一转速条件下发酵，使顶丝藻破碎释出藻红蛋白，其中该时间条件为6-78小时，该时间条件较佳为6-36小时，该时间条件最佳为24-30小时，该温度条件为20-25℃，该温度条件最佳为22℃，该转速条件为100-500rpm，该转速条件较佳为200-400rpm，该转速条件最佳为300rpm。
实施例一、制备发酵菌液
将冷冻保存的游海假交替单胞菌退冰后，取100μL菌液至固态培养基(Marineagar)涂盘，以活化菌株，在22℃培养12小时后，使用1mL磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffered saline，PBS)将游海假交替单胞菌润洗下来并接种至50mL的液态培养基(Marinebroth)中，以22℃、300rpm条件进行液态培养12小时，接着利用分光亮度机检测600nm的吸光值，当OD600值为0.9～1.1时即可作为顶丝藻发酵用的发酵菌液。
实施例二、顶丝藻发酵处理
取一顶丝藻加入一海水中，接着加入使用实施例一所述方法制备而得的发酵菌液，得一顶丝藻菌液混合物。将该顶丝藻菌液混合物在一温度条件及一转速条件下发酵，使顶丝藻破碎释出水溶性的藻红蛋白，并于0、6、12、24、30、36、48、54、60、72及78小时取样进行藻红蛋白含量检测。其中，该顶丝藻：该海水：该发酵菌液的混合比例为2(g):1(mL):1(mL)；其中该海水为人工海水或天然海水；其中该温度条件为20-25℃，该温度条件最佳为22℃；其中该转速条件为100-500rpm，该转速条件较佳为200-400rpm，该转速条件最佳为300rpm。
实施例三、藻胆蛋白含量测定
藻胆蛋白含量是参照Allen等人(1973)所提出的方法进行检测，在各时间取样点取1mL发酵后的顶丝藻菌液混合物，离心取上清液，接着以酵素免疫分析仪检测其562nm、615nm及652nm的吸光值，再代入以下公式求得不同藻胆蛋白含量：
藻蓝蛋白(mg/mL)＝(OD615－0.474(OD652))÷5.34
副藻蓝蛋白(mg/mL)＝(OD652－0.208(OD615))÷5.09
藻红蛋白(mg/mL)＝(OD562－2.41(PC)－0.89(APC))÷9.62
由图2及表1可知，顶丝藻经单纯物理性处理后所释出的藻红蛋白含量仅有0.128g，而在经实施例二所述方法发酵6-78小时后，所释出的藻红蛋白含量皆较单纯物理性处理高；其中，发酵的时间为6-36小时，可释出较多的藻红蛋白含量；其中，发酵的时间为24-30小时，可释出最多的藻红蛋白含量。
表1、时间条件对藻红蛋白产量的影响
Figure BDA0002200427470000061
本发明提供一种高藻红蛋白产量的制备方法，其是利用游海假交替单胞菌发酵分解顶丝藻，使其藻体破碎，释出顶丝藻体内成份，让顶丝藻的营养成分或是活性成分，尤其是藻红蛋白，更容易被析出或是萃取，以使之更容易被利用。本发明所提供的方法可提升藻红蛋白的产量，且具有简单、操作容易的优势，利于用于产业生产应用。
于本说明书较佳实施例揭示的内容，本发明所属技术领域具有通常知识者可明显得知前述实施例仅为例示；具本发明所属技术领域通常知识者可通过诸多变换、替换而实施，而不与本发明得技术特征有所差异。依据说明书实施例，本发明可有多种变换仍无碍于实施。本说明书提供的请求项界定本发明的范围，该范围涵盖前述方法与结构及与其相等的发明。

Claims (10)

1.一种提高藻红蛋白产量的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一、混合顶丝藻、发酵菌液及海水，得到顶丝藻菌液混合物；
步骤二、将所述顶丝藻菌液混合物在时间条件、温度条件及转速条件下发酵，使顶丝藻破碎释出藻红蛋白；
其中所述发酵菌液包含游海假交替单胞菌；
其中所述时间条件为6-78小时，所述温度条件为20-25℃，所述转速条件为100-500rpm。
2.根据权利要求1所述的提高藻红蛋白产量的制备方法，其特征在于，其中所述发酵菌液的OD600值为0.9～1.1。
3.根据权利要求1所述的提高藻红蛋白产量的制备方法，其特征在于，其中所述发酵菌液的OD600值为1。
4.根据权利要求1所述的提高藻红蛋白产量的制备方法，其特征在于，其中所述温度条件为22℃。
5.根据权利要求1所述的提高藻红蛋白产量的制备方法，其特征在于，其中所述转速条件为300rpm。
6.根据权利要求1所述的提高藻红蛋白产量的制备方法，其特征在于，其中所述时间条件为6-36小时。
7.根据权利要求1所述的提高藻红蛋白产量的制备方法，其特征在于，其中所述时间条件为24-30小时。
8.根据权利要求1所述的提高藻红蛋白产量的制备方法，其特征在于，其中所述顶丝藻：该发酵菌液：该海水的混合比例为2(g):1(mL):1(mL)。
9.根据权利要求1所述的提高藻红蛋白产量的制备方法，其特征在于，其中所述海水为人工海水或天然海水。
10.一种细菌用于破碎顶丝藻的用途，其特征在于，包括将顶丝藻与细菌混合发酵；其中所述细菌为游海假交替单胞菌。
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