CN113755377A - 一种降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于生物降解尿酸的芽孢杆菌，其能够产生催化降解尿酸的酶，所述芽孢杆菌为副蕈状芽孢杆菌YC‑02株。本发明还涉及一种生物降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂，该副蕈状芽孢杆菌制剂含有上述芽孢杆菌的菌细胞、芽孢和粗酶中的一种或几种。研究结果表明，本发明所提供的用于生物降解尿酸的芽孢杆菌及其所产生的酶对人体安全，且均能够高效生物降解尿酸，在去除尿酸用于治疗人体高尿酸血症和相应并发症方面具有重要的应用前景。

Description

一种降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用。

背景技术

进入21世纪以来，我国社会经济水平不断提高，饮食也日益多样化，随着脂肪和嘌呤含量高的食物摄入增加，许多疾病的发生率也不断上升，高尿酸血症(Hyperuricemia，HUA)便是其中之一。相关流行病学研究表明，全球HUA的患病率为5％～25％，是继糖尿病之后的又一常见代谢性疾病。据近几年来我国各地HUA患病率的研究和报道，目前大陆地区的HUA患者人数估计已达2亿。中老年男性与绝经后女性是其高发人群，而近年来HUA发病的年轻化趋势显著加剧，防控形势严峻。在进化过程中，灵长类动物编码尿酸酶的基因发生了假基因化，导致人类自身无法转化尿酸，因而尿酸是人类嘌呤代谢的最终产物。正常的尿酸浓度对于人体是无害的，但现代社会的高能量、高嘌呤饮食习惯很容易打破体内的尿酸平衡，使得越来越多人患HUA。由于弱水溶性尿酸盐饱和而以尿酸单钠晶体的形式析出，其偶尔出现在肾小管中导致肾结石，最常发生的是在关节滑膜液中累积引发痛风，而痛风是成年人最常见的关节炎类型。另外，尿酸单钠晶体在泌尿系统形成结石，引发梗阻和剧烈的疼痛，导致泌尿系统的感染。如果尿酸单钠晶体沉积在动脉，会引起动脉硬化，在心脏沉积，会引起心脏功能的异常。尿酸单钠晶体甚至还会在我们的脊柱，或者是中枢神经系统进行沉积，会破坏相应沉积部位的组织器官功能。HUA的遗传率很高，约70％。这预示了HUA和痛风在基因遗传上的风险，HUA将患高血压、慢性肾病和肥胖的风险提高了2-3倍。

尿酸微溶于水，易形成白色晶体。目前治疗人类HUA的方法主要有物理吸附、药物治疗和生物降解等。物理吸附和药物治疗因并非直接降解尿酸，因此存在治疗效果较差且有不良反应等缺点。微生物法降解去除尿酸具有成本低、安全性强、降解效果好等优点，是一种很有前途的去除尿酸的方法，因此近几年国内外学者在此领域进行了大量研究。目前国内外普遍通过生物降解形成尿酸的底物如嘌呤等，进而降低尿酸的生成量，达到治疗HUA的效果。我国学者采用益生菌如干酪乳杆菌、加氏乳杆菌和发酵乳杆菌等乳杆菌生物降解腺苷、鸟苷、腺苷酸、鸟苷酸、腺嘌呤和鸟嘌呤，达到降低尿酸生成量的目的。但这些报道菌株对尿酸都没有明显的生物降解能力，而且乳杆菌的抗逆性较差，不利于保存，因此防治HUA的效果有限。澳大利亚学者研究了真菌病原体新型隐球菌生物降解尿酸的途径，发现有包括尿酸酶在内的3种酶将尿酸降解成为尿囊素。埃及学者研究了蜡样芽孢杆菌产尿酸酶的最佳发酵条件，并研究了酶和基因，但没有进一步研究该酶对尿酸的降解能力。自2019年以来，我们成功筛选出了一株高效降解尿酸的微生物纯菌种，不仅具有非常重要的进一步研究的价值，而且在高效降解去除尿酸方面具有重要的应用价值。

副蕈状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)是一类产芽孢的革兰氏阳性菌，具有抗菌谱广、生长迅速、抗逆性强和生物安全性高等优点。近年来，关于副蕈状芽孢杆菌的研究主要集中在水产养殖、污水处理、产角蛋白酶，农作物保护等领域。作为一种新型生防微生物因子，副蕈状芽孢杆菌产生的二甲基二硫化物可以抑制立枯丝核菌和瓜果腐霉的生长，从而降低甘蓝立枯病的发生率。迄今为止尚未见有副蕈状芽孢杆菌具有对人产生毒性效应的研究报道，同时在利用副蕈状芽孢杆菌生物降解尿酸方面也尚未见有文献报道，因此利用副蕈状芽孢杆菌高效降解尿酸的特性，在其细胞和酶水平制备降尿酸的生物制剂在防治人HUA领域具有重要的研究意义与应用价值。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的降解去除尿酸的药物或食品效果不显著且存在副作用的问题，提供了一种用于生物降解尿酸的芽孢杆菌，该菌株的菌细胞、芽孢及其所产生的酶均能够高效生物降解尿酸，且对人体安全，具有重要的应用前景。

本发明的目的之二在于提供一种降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂及其应用，所述副蕈状芽孢杆菌制剂由上述用于生物降解尿酸的芽孢杆菌制成，能够高效生物降解尿酸。

为此，本发明第一方面提供了一种用于生物降解尿酸的芽孢杆菌，其能够产生催化降解尿酸的酶，所述芽孢杆菌为副蕈状芽孢杆菌YC-02株，其保藏编号为CGMCCNo.22812。

在本发明的一些实施例中，所述副蕈状芽孢杆菌YC-02株的菌细胞在24小时内能够将初始浓度为500mg/L的尿酸全部降解去除。

在本发明的另一些实施例中，所述副蕈状芽孢杆菌YC-02株所产生的粗酶在蛋白浓度5.38mg/mL下，在6小时内能够将初始浓度为500mg/L的尿酸全部降解。

本发明第二方面提供了一种降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂，其含有如本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌细胞、芽孢和粗酶中的一种或几种；优选地，所述副蕈状芽孢杆菌制剂含有如本发明第一方面所述的芽孢杆菌的芽孢。

在本发明的一些实施例中，所述降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂为液态制剂；优选地，在所述降解尿酸的液态制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的浓度为(1-6)×10¹⁰/mL；和/或，在所述降解尿酸的液态制剂中，芽孢杆菌的粗酶的蛋白浓度为4-10mg/mL。

在本发明的另一些实施例中，所述降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂为固体粉末制剂；优选地，在所述降解尿酸的固体粉末制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的含量为(1-6)×10¹⁰/g，更优选为(2-4)×10¹⁰/g；和/或，在所述降解尿酸的固体粉末制剂中，芽孢杆菌粗酶的蛋白含量为200-500mg/g，更优选为200-300mg/g。

本发明第三方面提供了一种如本发明第二方面所述的降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂的制备方法，其包括：

步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得芽孢杆菌的发酵培养物；

步骤C，对芽孢杆菌的发酵培养物进行离心分离处理，收获芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢；

其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得；

所述发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌株的16SrDNA的同源性至少为90％的菌株；优选发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌株的16S rDNA的同源性至少为95％的菌株；进一步优选发酵菌种的相应的菌株为本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌株。

根据本发明，所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：

全脂奶粉 5-10g；优选为8-10g；

酵母粉 5-10g；优选为8-10g；以及

NaCl 3-8g；优选为4-6g；

优选地，所述发酵培养基的pH值为7-8；

进一步优选地，在步骤B中，所述发酵培养的温度为18-40℃，优选为36-38℃。

根据本发明的一些实施方式，所述制备方法还包括：

步骤K，将所述芽孢杆菌的细胞悬浊液在低温条件下进行细胞破碎处理，获得芽孢杆菌的无细胞破碎液；

步骤L，将芽孢杆菌的无细胞破碎液进行离心分离，取上清无细胞提取液作为芽孢杆菌的粗酶；

其中，所述低温的温度为0℃-4℃。

本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述的降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂或如本发明第三方面所述的制备方法制备的降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂在制备降尿酸药剂中的应用，其包括：

步骤D，采用生理食盐水清洗芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢，获得芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢纯品；

步骤E，在生理食盐水体系中，在低温条件下，采用超声波破碎芽孢杆菌的菌细胞纯品，离心处理后取上清液获得无细胞提取液作为芽孢杆菌的粗酶纯品；

步骤F，对芽孢杆菌的菌细胞、芽孢和粗酶中的一种或几种进行冷冻干燥，并对冷冻干燥后的副蕈状芽孢杆菌制剂进行稀释，制成用于降尿酸药剂；

其中，所述低温的温度为0℃-4℃。

在本发明的一些实施例中，在步骤F中，使用生理食盐水对冷冻干燥后的副蕈状芽孢杆菌制剂进行稀释，制成用于降尿酸药剂，制成液态降尿酸药剂。

在本发明的另一些实施例中，在步骤F中，使用食用淀粉冷冻干燥后的副蕈状芽孢杆菌制剂进行稀释，制成固态降尿酸药剂。

在本发明的一些优选的实施例中，所述降尿酸药剂为口服制剂。

研究发现，本发明所提供的用于生物降解尿酸的芽孢杆菌及所产生的酶对人体安全，且均能够生物降解尿酸，在高效去除尿酸降尿酸方面具有重要的应用前景。

附图说明

为使本发明容易理解，下面结合附图来说明本发明。

图1是筛选副蕈状芽孢杆菌YC-02基于16S rDNA的分子进化树。

图2是副蕈状芽孢杆菌YC-02降解尿酸的动力学过程和生长曲线。

图3是副蕈状芽孢杆菌YC-02酶催化降解尿酸的动力学过程。

菌种保藏

副蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)，由北京科技大学分离、鉴定，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)保藏，保藏日期：2021年07月05日，保藏编号：CGMCCNo.22812。本发明中该菌株被命名为副蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoidesstrain YC-02)。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ、术语

本发明中所述用语“菌体”是指细菌的活细胞和/或死细胞。

本发明中所述用语“芽孢”是指芽孢杆菌在一定条件下形成的抗逆性非常强的休眠体。

本发明中所述用语“粗酶”是指芽孢杆菌的菌细胞破碎后通过离心取上清液获得的无细胞提取液。

本发明中所述用语“粗酶纯品”是相对于粗酶而言，是指芽孢杆菌的菌细胞纯品破碎后通过离心取上清液获得的无细胞提取液。

本发明中所述用语“副蕈状芽孢杆菌YC-02株的粗酶”与“副蕈状芽孢杆菌YC-02粗酶”可以互换使用。

本发明中所述用语“微生物制剂”是指具有医研价值的微生物为原料，利用传统技术或现代生物技术制造，作用于人体各类生理症状的预防(保健)、治疗和诊断的各种形态的制剂。

本发明所述用语“食用淀粉”是指达到“食用淀粉国家标准”(GB 31637-2016食品安全国家标准食用淀粉)的淀粉。

发明用于培养基或发酵培养过程中的“水”，在没有特别指定的情况下，是指经0.22μ滤膜过滤获得的无菌纯水。

Ⅱ、实施方案

如前所述，现有的用于人体内降解去除尿酸的药物或食品不尽如人意，存在这样或那样的问题；例如，治疗HUA最常用的别嘌呤醇，虽然可以治疗高尿酸症，但存在较大的副作用。乳酸菌虽然可以促进肠道健康，在某种程度上通过一系列代谢调节减少了尿酸的积累，但所用菌种缺乏直接高效生物降解尿酸的证据。另外，乳酸菌抗逆性弱容易死亡，不易保存且有效期短。鉴于此，本发明人对于尿酸的生物降解进行了大量的研究。

在长期从事微生物研究的基础上，我们从酒窖窖泥中成功筛选出了一株高效生物降解尿酸的微生物纯菌种，该菌株及其所产生的酶均能够高效生物降解尿酸，不仅具有非常重要的研究价值，而且在高效生物降解去除尿酸方面具有重要的应用前景。

因此，本发明第一方面所涉及的用于生物降解尿酸的芽孢杆菌，其能够产生催化降解尿酸的酶。

本发明人首先从酒窖中成功筛选出了一株芽孢杆菌。经提取基因组DNA，通过PCR扩增和基于16S rDNA测序的分子鉴定，确定为副蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)，基于上述，该菌株被鉴定并命名为副蕈状芽孢杆菌YC-02株(Bacillus paramycoidesstrain YC-02)。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.22812。

本发明人研究发现，对副蕈状芽孢杆菌YC-02株进行发酵培养，发酵培养过程中所产生的菌细胞含有一种以上的能够催化降解尿酸的酶，本发明中将这些酶的混合物称为粗酶，或者称为副蕈状芽孢杆菌YC-02粗酶。

进一步研究发现，对菌细胞破碎后的无细胞破碎液进行离心分离，取上清无细胞提取液作为副蕈状芽孢杆菌YC-02粗酶。副蕈状芽孢杆菌YC-02芽孢可以通过人胃酸，待进入小肠后可以萌发为细胞并产生降解尿酸的酶；由此容易理解，副蕈状芽孢杆菌YC-02株的菌细胞、芽孢和副蕈状芽孢杆菌YC-02粗酶均能够催化降解尿酸。

研究结果表明，所述副蕈状芽孢杆菌YC-02株的菌细胞和/或芽孢在24小时内能够将初始浓度为500mg/L的尿酸全部降解去除。

所述副蕈状芽孢杆菌YC-02株所产生的粗酶在蛋白浓度5.38mg/mL下，在6小时内能够将初始浓度为500mg/L的尿酸全部降解。

基于上述，本发明第二至四方面进一步提供了本发明第一方面中所述的用于生物降解尿酸的芽孢杆菌的用途或应用。

具体地，本发明第二方面提供了一种生物降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂，其属于一种生物降解尿酸的微生物制剂，其含有如本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌细胞、芽孢和粗酶中的一种或几种。

在本发明的一些优选的实施例中，所述副蕈状芽孢杆菌制剂含有如本发明第一方面所述的芽孢杆菌的芽孢。

根据本发明的一些实施方式，所述生物降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂为液态制剂。

在本发明的一些实施例中，在所述生物降解尿酸的液态制剂中，所述芽孢杆的菌细胞和/或芽孢的浓度为(1-6)×10¹⁰/mL。

在本发明的另一些实施例中，在所述生物降解尿酸的液态制剂中，芽孢杆菌的粗酶的蛋白浓度为4-10mg/mL。

根据本发明的另一些实施方式，所述生物降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂为固体粉末制剂。

在本发明的一些实施例中，在所述生物降解尿酸的固体粉末制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的含量为(1-6)×10¹⁰/g，优选为(2-4)×10¹⁰/g。

在本发明的另一些实施例中，在所述生物降解尿酸的固体粉末制剂中，芽孢杆菌粗酶的蛋白含量为200-500mg/g，优选为200-300mg/g。

本发明第三方面提供了一种如本发明第二方面所述的生物降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂的制备方法，其包括：

步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中。在18-40℃，优选为36-38℃，摇床转速100-300转/分钟下，进行发酵培养3-5天后，获得芽孢杆菌的发酵培养物；

步骤C，对芽孢杆菌的发酵培养物进行离心分离处理，收获芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢；

其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得。

正如本领域技术人员所知，目前，国际上常使用16S rRNA来进行细菌的分子鉴定，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以本发明所使用的发酵菌株并不限定于本发明所使用的野外分离株，16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。图1显示了基于16S rDNA的分子进化树，本发明的所述芽孢杆菌为副蕈状芽孢杆菌YC-02株。

因此，本发明中，所述发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌株的16S rDNA的同源性至少为90％的菌株；优选发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌株的16S rDNA的同源性至少为95％的菌株；进一步优选发酵菌种的相应的菌株为本发明第一方面所述的芽孢杆菌菌株。即在不改变副蕈状芽孢杆菌YC-02的16S rDNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的副蕈状芽孢杆菌YC-02，获得与本发明副蕈状芽孢杆菌YC-02的16S rDNA高度同源菌株，并获得相应地具有相同或相似的生物降解尿酸的功能的菌株。

上述步骤C中，所述离心分离处理包括将液体发酵培养物经离心分离处理获得的沉淀物(即芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢)，利用生理食盐水重悬清洗后，再进行离心分离处理，获得芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢。

本发明对上述步骤C中的离心分离的条件没有特别的限制，在本发明的一些实施例中，例如，可以在8000-10000r/min条件下对待分离物离心处理10-20min。

根据本发明方法，所述发酵培养为菌种的摇床或发酵罐发酵培养，发酵菌种以种子液的形式接种到发酵培养基中。所述种子液的接种量为0.1％-1％(v/v)；优选所述种子液的接种量为0.2％-0.5％(v/v)；进一步优选所述种子液的接种量为0.5％(v/v)。

具体地，上述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：

全脂奶粉 5-10g；

酵母粉 5-10g；以及

NaCl 3-8g。

优选地，上述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：

全脂奶粉 8-10g；

酵母粉 8-10g；以及

NaCl 4-6g。

在本发明的一些实施例中，采用40％(wt/v)的氢氧化钠溶液和36％(v/v)盐酸溶液调整发酵培养基的初始pH值，所述发酵培养基的pH值为7-8。

根据本发明的一些实施方式，本发明所涉及的芽孢杆菌的制备方法还包括在步骤B之前种子培养的步骤A：挑取本发明所提供的副蕈状芽孢杆菌YC-02株单克隆菌落接种到100mL发酵液体培养基中，在温度38℃、转速200r/min下摇床培养3天后，制得发酵菌种(种子液)。

发明人研究了不同温度对副蕈状芽孢杆菌YC-02生长的效应，发现在温度38℃下副蕈状芽孢杆菌YC-02生长最快。

根据本发明的一些实施方式，所述制备方法还包括：

步骤K，将所述芽孢杆菌的细胞悬浊液在冰水浴(即冰水混合物，0-4℃)中进行细胞破碎处理，获得芽孢杆菌的无细胞破碎液；

步骤L，将芽孢杆菌的无细胞破碎液进行离心分离，取上清无细胞提取液作为副蕈状芽孢杆菌YC-02株的粗酶。

本发明对上述步骤L中的离心分离的条件没有特别的限制，在本发明的一些实施例中，例如，可以在15000-18000r/min条件下对待分离物离心处理10-20min。

本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述的生物降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂或如本发明第三方面所述的制备方法制备的生物降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂在制备降尿酸药剂中的应用，其包括：

步骤D，采用生理食盐水清洗芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢，获得芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢纯品；

步骤E，在生理食盐水体系中，在0℃-4℃的低温条件下，采用超声波破碎芽孢杆菌的菌细胞纯品，离心处理后取上清液获得无细胞提取液作为芽孢杆菌的粗酶纯品；

步骤F，对芽孢杆菌的菌细胞、芽孢和粗酶中的一种或几种进行冷冻干燥，并对冷冻干燥后的副蕈状芽孢杆菌制剂进行稀释，制成用于降尿酸药剂。

在本发明的一些实施例中，在步骤F中，使用生理食盐水对冷冻干燥后的副蕈状芽孢杆菌制剂进行稀释，制成用于降尿酸药剂，制成液态降尿酸药剂。

在本发明的另一些实施例中，在步骤F中，使用食用淀粉冷冻干燥后的副蕈状芽孢杆菌制剂进行稀释，制成固态降尿酸药剂。

在本发明的一些优选的实施例中，所述降尿酸药剂为口服制剂。

Ⅲ、本发明中的相关检测方法

(1)本发明中细胞和/或芽孢浓度采用以下方法测定：

副蕈状芽孢杆菌YC-02细胞和/或芽孢浓度的测定，取副蕈状芽孢杆菌YC-02培养物，经生理食盐水稀释一定倍数后，直接采用流式细胞仪(德国SYSMEX)测定其中的细胞和/或芽孢浓度。

(2)本发明中尿酸浓度采用以下方法测定：

尿酸浓度的测定方法，按比例加入NaOH溶液充分溶解液体培养基中的尿酸，离心后取上清液，使用RID-20A高效液相色谱仪(岛津)测定液体中的尿酸浓度。

(3)本发明中粗酶蛋白浓度采用以下方法测定：

取副蕈状芽孢杆菌YC-02的无细胞提取液，经磷酸盐缓冲溶液稀释一定倍数后，按比例加入考马斯亮蓝G-250染料试剂反应10分钟，使用722S可见分光光度计(上海棱光)在595nm处测定吸光度，采用标准曲线法计算出蛋白浓度。

Ⅲ、实施例

以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。

实施例1：

(1)配制副蕈状芽孢杆菌YC-02的生长培养基，其组成为(每升)：全脂奶粉10.0g，酵母粉10.0g，NaCl 5.0g。用500毫升三角瓶加入配制好的液体培养基100毫升，在高温高压(121℃)下进行灭菌20分钟，然后在洁净工作台内紫外线照射下再消毒20分钟。

(2)在洁净工作台内无菌条件下，接种0.5毫升副蕈状芽孢杆菌YC-02菌液于三角瓶100毫升液体培养基中，在温度38℃，摇床转速200转/分条件下进行批量培养3天后，通过离心后(8000转/分，10分钟)倒去上清液，收获副蕈状芽孢杆菌YC-02细胞和/或芽孢。

取副蕈状芽孢杆菌YC-02细胞悬浊液20mL加入到50mL玻璃管中后插入冰水中后，用超声波细胞破碎仪对副蕈状芽孢杆菌YC-02细胞进行破碎，条件是：超声功率400W，间隔2秒，超声振荡10秒，破碎时间15分钟(每次5分钟)。细胞破碎完毕后，将细胞破碎液进行15000转/分20分钟的离心，然后缓慢倒出上清液作为副蕈状芽孢杆菌YC-02的无细胞提取液(粗酶)。

(3)根据尿酸不同浓度，将培养制备的副蕈状芽孢杆菌YC-02细胞和/或芽孢及粗酶作为一种快速、安全和高效的生物催化剂，按一定比例加入，达到迅速高效降解去除尿酸的目的。

图1显示我们筛选的菌株与副蕈状芽孢杆菌的亲缘关系最近，因此命名为副蕈状芽孢杆菌YC-02株。

图2表明在24小时内伴随着副蕈状芽孢杆菌YC-02细胞浓度从40亿/mL生长到230亿/mL，可以将初始浓度为500mg/L的尿酸完全降解，说明副蕈状芽孢杆菌YC-02对尿酸具有很强的生物降解能力。

图3表明副蕈状芽孢杆菌YC-02的无细胞提取液(粗酶)能够以更快的速率催化降解尿酸，在蛋白浓度为5.38mg/mL下6小时，可以将初始浓度为500mg/L的尿酸全部降解，具备更高的尿酸降解速率。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种用于生物降解尿酸的芽孢杆菌，其能够产生催化降解尿酸的酶，所述芽孢杆菌为副蕈状芽孢杆菌YC-02株，其保藏编号为CGMCC No.22812。

2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，所述副蕈状芽孢杆菌YC-02株的菌细胞和/或芽孢在24小时内能够将初始浓度为500mg/L的尿酸全部降解去除。

3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，所述副蕈状芽孢杆菌YC-02株所产生的粗酶,在蛋白浓度5.38mg/mL下，在6小时内能够将初始浓度为500mg/L的尿酸全部降解。

4.一种降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂，其含有如权利要求1-3中任意一项所述的芽孢杆菌的菌细胞、芽孢和粗酶中的一种或几种；优选地，所述副蕈状芽孢杆菌制剂含有如权利要求1-3中任意一项所述的芽孢杆菌的芽孢。

5.根据权利要求4所述的副蕈状芽孢杆菌制剂，其特征在于，

所述降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂为液态制剂；优选地，在所述降解尿酸的液态制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的浓度为(1-6)×10¹⁰/mL；和/或，在所述降解尿酸的液态制剂中，芽孢杆菌的粗酶的蛋白浓度为4-10mg/mL；

或者，所述降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂为固体粉末制剂；优选地，在所述降解尿酸的固体粉末制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的含量为(1-6)×10¹⁰/g，更优选为(2-4)×10¹⁰/g；和/或，在所述降解尿酸的固体粉末制剂中，芽孢杆菌粗酶的蛋白含量为200-500mg/g，更优选为200-300mg/g。

6.一种如权利要求4或5中任意一项所述的降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂的制备方法，其包括：

步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得芽孢杆菌的发酵培养物；

步骤C，对芽孢杆菌的发酵培养物进行离心分离处理，收获芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢；

其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得；

所述发酵菌种的相应的菌株为与权利要求1-3中任意一项所述的芽孢杆菌的菌株的16S rDNA的同源性至少为90％的菌株；优选发酵菌种的相应的菌株为与权利要求1-3中任意一项所述的芽孢杆菌的菌株的16S rDNA的同源性至少为95％的菌株；进一步优选发酵菌种的相应的菌株为权利要求1-3中任意一项所述的芽孢杆菌的菌株。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：

全脂奶粉 5-10g；优选为8-10g；

酵母粉 5-10g；优选为8-10g；以及

NaCl 3-8g；优选为4-6g；

优选地，所述发酵培养基的pH值为7-8；

进一步优选地，在步骤B中，所述发酵培养的温度为18-40℃，优选为36-38℃。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：

步骤K，将所述芽孢杆菌的细胞悬浊液在低温条件下进行细胞破碎处理，获得芽孢杆菌的无细胞破碎液；

步骤L，将芽孢杆菌的无细胞破碎液进行离心分离，取上清无细胞提取液作为芽孢杆菌的粗酶；

其中，所述低温的温度为0℃-4℃。

9.一种如权利要求4或5所述的降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂或如权利要求6-8中任意一项所述的制备方法制得的降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂在制备降尿酸药剂中的应用，其包括：

步骤D，采用生理食盐水清洗芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢，获得芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢纯品；

步骤E，在生理食盐水体系中，在低温条件下，采用超声波破碎芽孢杆菌的菌细胞纯品，离心处理后取上清液获得无细胞提取液作为芽孢杆菌的粗酶纯品；

步骤F，对芽孢杆菌的菌细胞、芽孢和粗酶中的一种或几种进行冷冻干燥，并对冷冻干燥后的副蕈状芽孢杆菌制剂进行稀释，制成用于降尿酸药剂；

其中，所述低温的温度为0℃-4℃。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，

在步骤F中，使用生理食盐水对冷冻干燥后的副蕈状芽孢杆菌制剂进行稀释，制成用于降尿酸药剂，制成液态降尿酸药剂；

或者，在步骤F中，使用食用淀粉冷冻干燥后的副蕈状芽孢杆菌制剂进行稀释，制成固态降尿酸药剂；

优选地，所述降尿酸药剂为口服制剂。

Images