CN117683668A - 一种植物乳杆菌菌株d5205及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）D5205，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.28615；其对胆盐降解率和胆固醇的去除能力分别达到30%和40%以上，本发明通过体外模拟胃肠道消化、耐酸耐胆盐和肠道黏附性测定发现植物乳杆菌D5205具备较好的定植能力和益生特性，同时，植物乳杆菌D5205筛选于昆明市寻甸县豆豉，作为食源性微生物具有安全性高的优点，植物乳杆菌D5205在降胆固醇方面具有较好的开发利用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）D5205及其在制备具有代谢胆固醇能力产品、调节人体胃肠道菌群产品中的应用，属于功能微生物技术领域。
背景技术
胆固醇是人体中天然存在的物质，可增强细胞壁的生物合成和荷尔蒙的产生。人体所需的胆固醇来源于两方面，约80%为内源性胆固醇，由肝脏和肠黏膜合成，剩余少量20%为外源性胆固醇，来源于动物性食物如蛋黄、内脏等。然而，当饮食中的胆固醇变高时，可能会导致高胆固醇血症的出现。这将导致胆固醇在血管中进行积累，向心脏和大脑等重要器官供血的动脉阻塞或变窄。虽然通过饮食管理、定期运动和药物治疗可以有效降低机体胆固醇含量，但是这些药物存在价格昂贵并且伴有严重的副作用等问题。
益生菌是“活的微生物，在足够数量的情况下对宿主的健康有益”。其主要优点是通过改善人类宿主的肠道菌群，为宿主提供一定预防疾病的能力；改善人体肠道微生物的平衡，并提高摄入营养物质的吸收率。乳酸菌通过发酵产生的有机酸和自身的特殊酶系等物质具有特殊生理功能，例如增强肠粘膜完整性、抗高血压作用、减少过敏症状等。
发明内容
本发明提供了一株植物乳杆菌D5205，分类命名为Lactobacillus plantarum，于2023年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28615，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明另一目的是将上述植物乳杆菌D5205应用在制备具有代谢胆固醇能力产品、调节人体胃肠道功能产品中。
本发明目的通过以下技术方案实现：
1、采集昆明市寻甸县豆豉作为样品，将其用生理盐水稀释后，用MRS固体培养基涂布培养，挑取平板上的典型菌落，划线纯化培养得到纯菌落，挑取单菌落富集培养，通过沉淀圈法筛选获得1株明显具备胆盐水解酶活性的菌株D5205；
2、菌株D5205的鉴定
①菌株D5205形态学特征：革兰氏阳性菌，在MRS培养基上呈乳白色，圆形，边缘整齐，不透明，隆起，有粘性；
②分子鉴定：采用TIANGEN DP302-02 细菌基因组DNA提取试剂盒 (TIANGEN, 中国)提取该菌株DNA，经检测后送至生工生物工程股份有限公司(上海)进行序列测定，测序结果见SEQ ID NO:1所示，将测序结果与NCBI上序列进行比对；结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；
3、采用HPLC方法检测菌株D5205的胆盐降解率；利用邻苯二甲醛法将纯化后的菌株D5205接种到含有胆固醇的MRS培养基中，分析菌株的去胆固醇能力；结果显示该菌体具备良好的代谢胆固醇潜能；
4、通过体外模拟胃肠道消化、耐酸耐胆盐和肠道黏附性测定发现植物乳杆菌D5205具备较好的体外定植和益生能力。
本发明所述产品包括药物、化妆品、食品、保健品、发酵剂、饲料中任意一种。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明利用云南特色发酵食品为原料筛选食源性功能植物乳杆菌，原料安全可靠，通过沉淀圈法初步筛选出具有胆盐水解酶活性的植物乳杆菌；通过HPLC和邻苯二甲醛法进一步定量分析植物乳杆菌对胆盐和胆固醇的降解能力，并且结合益生和定植特性实验，确定了该菌株具备良好的体外益生和定植特性；
2、本发明植物乳杆菌来源于昆明市寻甸县的豆豉，相对于市面上的洛伐他汀类药物具有成本低，来源广泛，安全性高的优点，并且传统上，副作用小，市场前景较为客观，蕴藏着较好的社会和经济效应。
附图说明
图1为植物乳杆菌D5205的胆盐水解酶活性定性检测结果示意图；
图2为利用HPLC分析植物乳杆菌D5205对胆盐的降解效果示意图，所有值均表示为平均值±标准差（n = 3），不同小写字母代表差异性显著（p<0.05）；
图3为植物乳杆菌D5205在不同pH和不同浓度胆盐环境下的耐受性，所有值均表示为平均值±标准差（n = 3），不同小写字母代表差异性显著（p<0.05）；
图4为植物乳杆菌D5205的黏附能力示意图，所有值均表示为平均值±标准差（n =3），不同小写字母代表差异性显著（p<0.05）；
图5为植物乳杆菌D5205在模拟胃液和模拟小肠液中的生存能力示意图，所有值均表示为平均值±标准差（n = 3），不同小写字母代表差异性显著（p<0.05）。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制；下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售；在阅读了本发明的记载以后，本领域的科技人员对其等效的各种改动、修改和修饰，都属于本发明权利要求所限定的范围；
乳酸菌液体培养基（MRS）：蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5g/L、吐温80 1g/L、磷酸氢二钾2 g/L、醋酸钠5 g/L、柠檬酸钠2 g/L、七水硫酸镁0.2 g/L、五水硫酸锰0.054 g/L，用于乳酸菌的培养和计数；
MRS-CHOL培养基：MRS培养基中加入1.5mg/mL的胆固醇，用于乳酸菌降胆固醇的活力测定；
耐受胆盐能力测定中胆盐培养基：MRS培养基中分别加入0.1、0.3、0.5%（v/v）牛磺胆酸钠（Taurocholic acid Sodium Salt, TCAs），用于菌株耐胆盐能力的测定。
牛磺胆酸钠、牛磺酸（北京索莱宝科技有限公司）、三氯乙酸、茚三酮、胆固醇（上海麦克林生化科技有限公司）；氯化钙（AR，天津市化学试剂一厂）；邻苯二甲醛（上海生工生物工程有限公司）；浓硫酸、冰醋酸、正己烷、氢氧化钾（上海易恩化学技术有限公司）；胃蛋白酶、胰蛋白酶（Solarbio, Beijing, China）等。
昆明市寻甸县豆豉采集并储存在消毒过的瓶子中。
实施例1：具有胆盐水解酶活性菌株的分离、筛选和鉴定
1、菌株D5205的分离和筛选
胆汁酸为胆固醇代谢的提供了一条重要途径，BSH是代谢调控胆汁酸的关键酶。而具有BSH活性的菌株能够将牛磺胆酸钠分解为胆酸和牛磺酸，分解的胆酸能与CaCl2反应生成白色沉淀。根据这一原理，利用牛津杯在添加0.3%牛磺胆酸钠、0.37g/L CaCl2和1.5%琼脂的MRS平板上均匀打孔，制得筛选具有BSH活性菌株的平板。
取发酵豆豉1g加入10mL生理盐水中振荡混匀，按10倍比梯度稀释，选取合适的稀释度在MRS固体培养基上进行涂布， 37℃下厌氧培养48 h，分别挑取4株典型单菌落在MRS固体培养基上进行纯化并在MRS液体培养基中富集培养。然后，分别取100μL菌悬液加入上述筛选平板的小孔中，37℃厌氧培养72h，筛选具备BSH活性的菌株，最终观察发现，有1株菌具有明显的白色沉淀圈 (图1)，说明具备良好的BSH活性，将该菌株命名为D5205。
2、菌株的鉴定
2.1菌株形态学特征：革兰氏阳性菌，在MRS培养基上菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐，不透明，隆起，有粘性。菌体形态呈杆状或链球状；
2.2分子鉴定
利用TIANGEN DP302-02 细菌基因组DNA提取试剂盒 (TIANGEN, 中国)提取细菌基因组DNA，采用通用引物27F（5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'）和1492R（5'GGTTACCTTGTTACGACTT3'）进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30个循环，最后72 ℃末端延伸10min。PCR扩增体系（总体系50μL）为：10×buff 5 μL、dNTP 4 μL、27F 1.5 μL、1492R 1.5 μL、r-Taq 0.5 μL、双蒸水35.5 μL、DNA模板 2μL。获得16S rRNA，然后送至生工生物工程股份有限公司(上海)进行测序，测序序列如SEQ ID NO：1所示。将序列在NCBI进行BLAST比对，发现菌株D5205与Lactobacillus plantarum 6941相似性达99.46%；故鉴定D5205为植物乳杆菌，并将其命名为植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum）D5205。
实施例2：植物乳杆菌D5205降解胆盐的HPLC鉴定
取甘油冻存管里的D5205菌液活化2代后，将菌悬液在3800 rpm下离心5 min，倒出上清液，加入等量的磷酸缓冲盐溶液（Phosphate buffered saline, PBS, pH=6.8）洗菌，重复2次，以PBS为空白对照，调整菌悬液OD600值为1.0 ± 0.2，以4%（v/v）接种量接种至含0.3%胆盐的MRS液体培养基中，37 ℃、200 rpm培养96 h；
分别在12 h、24 h、48 h、72 h、96 h取样，样品7000 rpm离心10 min取上清液，0.22 µm水系滤膜过滤后上样，进行液相分析。
液相条件：色谱柱：TC-C18柱（5 μm ，4.6 mm ×250 mm，Agilent）；流动相：A通道：乙腈/TFA=100/0.09，B通道：水/TFA=100/0.1；梯度条件：0~2min，25% A等度洗脱，2~10min，55%A梯度洗脱，10~15min，25% A再进行等度洗脱；流速：0.6mL/min；色谱柱温度：40℃；检测器：电雾式检测器（CAD），胆盐的降解率计算公式如下：
式中：At为t h胆盐峰面积，A0为0 h胆盐峰面积。
HPLC分析结果如图2所示，通过分析比较发现96h内，随着时间的增加，植物乳杆菌D5205对胆盐的代谢率逐渐增高，并在48h后无明显的变化（p > 0.05）；96h时，D5205对胆盐的代谢率为31.35%，植物乳杆菌消耗胆盐会促使生成胆酸与菌泥形成沉淀，进而在宿主聚集后随粪便排出；然而，缺失的胆盐会导致宿主体内更多的胆固醇参与循环，最终达到代谢胆固醇的效果。
实施例3：植物乳杆菌D5205去胆固醇能力鉴定
取甘油冻存管里的D5205菌液500μL于MRS液体培养基中活化2代后，将菌悬液在3800rpm下离心5 min，倒出上清液，加入等量的磷酸缓冲盐溶液（PBS, pH=6.8）洗菌，重复2次，以PBS为空白对照，调整菌悬液OD600值为1.0 ± 0.2，取0.5 mL菌悬液接种到4.5 mLMRS-CHOL培养基中，37 ℃厌氧培养12 h，4200 rpm离心15 min，通过邻苯二甲醛法定量菌株培养基上清液中去除的胆固醇含量，结果去除胆固醇含量为0.62±0.05mg/mL，去除率为41.02%±3.10，结果表明D5205具备良好的去除胆固醇的能力。
实施例4：植物乳杆菌D5205的益生和定植特性分析
1、耐酸耐胆盐实验
适应低pH和高胆盐环境生长是益生菌能够定植在宿主体内的重要特性。因此针对这两种特性进行了实验研究。
用0.3 mM HCl调整MRS培养基为不同pH 2、3、4、7，将菌株D5205活化后置于不同酸度的MRS培养基中培养，进行菌株的耐酸性实验；
将菌株D5205活化后置于含不同浓度胆盐的胆盐培养基中培养，进行植物乳杆菌D5205的耐胆盐能力的探究。
植物乳杆菌D5205在不同pH和胆盐浓度下的生长情况如图3所示，随着pH值的升高，所有菌株的OD600值均有上升趋势（p<0.05）；在pH为3时菌株的OD600值大约是pH为7时的一半，表明长时间的低pH下D5205存活率仍能到达50%左右。另外，相比于没有胆盐的MRS培养基，植物乳杆菌D5205在含有胆盐的培养基中生长情况更好，这说明菌体可以适应胆盐环境，甚至能利用胆盐进行生长，并且在0.5%（w/v）胆盐浓度下的OD600值相对较高，这一胆盐耐受性的结果也进一步证实了上述实施例中胆盐水解酶活定性和降解胆盐定量结果一致。
2、模拟肠道黏附性
体外常用的菌株黏附性通常是以细胞的自聚力和疏水性两种指标来评价的。取甘油冻存管中的菌液以4%（v/v）的接种量加入到MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h，生长至3代后，使用生理盐水（0.85%，w/v）清洗菌泥两次后重悬，以生理盐水为空白对照，调整菌悬液OD600值为1.0 ± 0.02。
2.1自聚力
取4 mL的菌液加入10 mL试管中，放置在37 ℃培养箱中静置，分别在0 h和24 h取上层清液，使用分光光度计测定该菌在600 nm处的吸光值，其细胞自聚力的计算公式为：
式中：A24为24 h测定的上层清液的OD600值，A0为初始的OD600值。
2.2疏水性
取1 mL二甲苯添加在3 mL的菌液中，涡旋2 min后在37 ℃下静置至观察到相分离，然后吸取下层液体，使用分光光度计测定600nm处的吸光度值At；其细胞疏水性的计算公式为：
式中：At为涡旋后静置至相分离的OD600值，A0为初始的OD600值。
结果如图4所示，该菌株自聚力和疏水性分别为90.16%和71.59%，研究表明，自聚能力高的菌株可以通过在肠道上皮细胞形成免疫屏障，与致病菌竞争黏附位点，从而防止肠道受到致病菌的侵害；而细胞表面疏水指数高于70%的菌株更易聚在一起形成生物膜，促进细菌黏附力，属于具有良好黏附活性的疏水菌株。
2.3模拟胃肠道消化
模拟胃液（Simulated gastric juice, SGJ）：3 mg/mL的胃蛋白酶溶解在0.5 %（w/v）的生理盐水中，并用0.3 mM HCl调节pH为2.50；
模拟小肠液（Simulated small intestinal fluid, SSIJ）：1 mg/mL的胰蛋白酶溶于溶解在0.50%（w/v）的生理盐水中，加入0.3%（w/v）牛磺胆酸钠，用0.5 mM NaOH调节pH为8.00。
取108 CFU/mL的菌株D5205菌悬液0.5mL接种至模拟胃液4.5mL中，充分混合均匀后进行梯度稀释，倾注平板法测定菌株刚刚进入胃液中的活菌数，记为初始活细胞数，同时在37 ℃下培养3 h后取出，倾注平板法测定菌株经胃液消化后的活菌数。
取0.5mL来自胃液消化后的菌悬液加入4.5 mL模拟肠液中。充分混合均匀后进行梯度稀释，在37 ℃下培养3 h后取出，倾注平板法测定菌株经肠液消化后的活菌数。
样品平行测定三次，存活率用下式表示:
式中：At分别为SGJ和SSIJ消化下活细胞数（lgCFU/mL），A0为初始活细胞数（lgCFU/mL）。
模拟胃肠道消化结果如图5所示，植物乳杆菌D5205经过SGJ和SSIJ消化后的菌落总数均大于7 lgCFU/mL，在SGJ后的菌落总数显著高于SSIJ消化后（p < 0.05），并显著低于初始状态下菌落总数（p < 0.05）；D5205经过SGJ后存活率也显著高于SSIJ（p < 0.05），并且SSIJ的存活率大于85%。
总之，植物乳杆菌D5205具有较明显的胆盐水解酶活性和降低胆固醇能力，并且在耐酸、耐胆盐、黏附性以及模拟胃肠道消化方面表现较好，具备了益生菌的潜在益生作用，可被用来作为降胆固醇的益生菌。
Claims (3)
1.一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）D5205，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 28615。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌D5205在制备具有代谢胆固醇能力产品中的应用。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌D5205在制备调节人体胃肠道功能产品中的应用。
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